Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

Dieses Protokoll nutzt die Interaktion zwischen Poliovirus und Poliovirus und erkennt Nanokörper, um einen einfachen quantitativen Flüssigphasen-Affinitäts-Capture-Assay zu demonstrieren. Hauptsächlich werden kobaltbeschichtete magnetische Kügelchen verwendet, um markierte Proteine sowie wechselwirkende radioaktiv markierte Proteine herunterzuziehen. Zuerst werden die markierten und markierten Proteine gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert.

Fügen Sie dann magnetische Kügelchen hinzu, die das Etikett erkennen, und trennen Sie die gebundene Fraktion des markierten Proteins mit Magneten von der ungebundenen Fraktion. Messen Sie dann das Signal des markierten Proteins, das in der ungebundenen Fraktion gefunden wird, und bestimmen Sie die Menge des markierten Proteins, die in der ungebundenen Fraktion gefunden wird. Die Ergebnisse dieses Flüssigphasen-Affinitätsassays sind äußerst nützlich, wenn konversionsempfindliche Proteine untersucht werden.

Dieser Flüssigphasen-Affinitäts-Capture-Assay kann Einblicke in die Interaktion zwischen Polioviren geben, indem er Nano-Boies und verschiedene Poliovirus-Antigene erkennt. Die Methode kann auch auf andere Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet werden, vorausgesetzt, dass ein Protein markiert und das andere nachgewiesen werden kann. Wir hatten die ID für diese Methode erstmals, als wir daran interessiert waren, die Interaktion zwischen Polioviren, der Erkennung von Nanokörpern und verschiedenen Poliovirus-Antigenen zu untersuchen.

Da das Poliovirus empfindlich auf eine bestätigende Umwandlung reagiert, ist die Verwendung von e LSA begrenzt, wenn es an einer festen Oberfläche befestigt wird. Daher sollte ein auf flüssiger Phase basierendes System bevorzugt werden. Ein Beispiel für ein solches flüssigphasenbasiertes System, das häufig in der Poliovirus-Forschung eingesetzt wird, ist das Mikroprotein.

Ein Immunpräzipitationsassay. Obwohl dieser Test seine Anwendbarkeit bewiesen hat, erfordert er die kristallisierte Struktur eines herkömmlichen Antikörpers, die in Nanokörpern nicht vorhanden ist. Diese Nanokörper, bei denen es sich um interessante und sehr stabile Einzeldomänen-Antikörper handelt, können leicht mit unterschiedlichem Text hergestellt werden.

Die weit verbreitete. Der Stack zeigt eine Affinität zu zweiwertigen Ionen wie Nickel und Kobalt, die ihrerseits leicht auf magnetische Kügelchen aufgebracht werden können. Aus diesem Grund haben wir den einfachen quantitativen Affinitäts-Capture-Assay entwickelt, der auf kobaltbeschichteten magnetischen Kügelchen basiert.

Reese füllt den Vorrat an magnetischen Kügelchen durch Vortex und überträgt 10 Mikroliter für jede Probe in ein Röhrchen, das die Kügelchen mit einem Magneten pelletiert. Entfernen Sie das klare Supinat, um die Perlen zu waschen. Fügen Sie 150 Mikroliter Bindungspuffer hinzu.

Ernten Sie die Kügelchen mit einem Magneten und entfernen Sie das Supinat nach einer zweiten Wäsche. Suspendieren Sie die Kügelchen erneut in 40 Mikrolitern Bindungspuffer für jede Probe, um sie zu kontrollieren. Für den Hintergrund in Probe eins ist eine Vertiefung ohne radioaktiv markiertes Virus, aber mit gleichem Volumen an Bindungspuffer zur Kontrolle vorzubereiten.

Probe zwei mit 100%Radioaktivität. Geben Sie alle Komponenten in eine Vertiefung, außer den Nanokörper durch Bindungspuffer zu ersetzen. Geben Sie nun 2000 Zählungen pro Minute des mit S 35 markierten Poliovirus sieben Stammes Typ eins in einem Gesamtvolumen von 80 Mikrolitern Bindungspuffer zu allen Proben.

Übernehmen Sie die Kontrolle. Probieren Sie eins. Geben Sie 10 Mikroliter Nanokörperverdünnung zu jeder Probe.

10 Sekunden lang auf einem Shaker gut mischen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter der gewaschenen magnetischen Bead-Suspension hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln, pelletieren Sie die Kügelchen mit einem Magneten und überführen Sie das geklärte SUP-Nativmittel in ein Röhrchen, um die Radioaktivität jeder Probe zu messen, und übertragen Sie 50 Mikroliter des Supinats in einen Zählkolben. Fügen Sie drei Milliliter Szintillationsflüssigkeit hinzu und lesen Sie auf dieser Isolierung ab.

Ziehen Sie die verwendeten Magnetkügelchen mit Wasser in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang 500 mal G. Verwerfen Sie das Supinat und suspendieren Sie die Kügelchen in sechs Millilitern 0,5 molar Natriumhydroxid. Dann aliquotiert man die Suspension in mehrere Röhrchen und inkubiert sie fünf Minuten lang in einem Ultraschallbad.

Nachdem Sie die Kügelchen mit einem Magneten pelletiert und das Supinat entfernt haben, geben Sie einen Milliliter 2%ige SDS-Lösung in jedes Röhrchen und mischen Sie es dann durch Vortexen und Folie für fünf Minuten. Ernte nun die Perlen. Geben Sie einen Milliliter 0,2 molare EDTA pH sieben in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang in einem Ultraschallbad.

Sammeln Sie dann die Kügelchen, waschen Sie die Kügelchen dreimal mit einem Milliliter Wasser, gefolgt von einem Milliliter 10 Millimolar Kobaltchloridlösung. Legen Sie die Röhrchen für 10 Minuten auf einen Shaker. Fahren Sie mit der Ernte der Kügelchen auf einem Magneten fort und reaktivieren Sie die Suspendierung in einem Milliliter Bindungspuffer.

Zweimal in einem Milliliter 20 % Ethanol waschen und schließlich die Kügelchen in ihrem ursprünglichen Volumen von 20 % Ethanol resuspendieren, um regenerierte Kügelchen in einer Konzentration von 40 Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Korrigieren Sie die Hintergrundradioaktivität durch Festlegen der Steuerung. Stichprobe eins als Radioaktivitätswert von 0 % und Kontrollprobe zwei als Radioaktivitätswert von 100 %.

Berechnen Sie nun für jede Probe den prozentualen Anteil der Radioaktivität im Sat als Maß für den Gesamtniederschlag des radioaktiv markierten Virus durch den Nanokörper. In diesem Experiment wird die Affinität von PVSS 38 C und Antikörpern spezifisch für das Poliovirus anhand von drei verschiedenen Antigenen des Poliovirus, dem nativen Antigen, dem erhitzten Antigen und den 14 s-Untereinheiten untersucht. Interessanterweise nimmt die Radioaktivität im Sat der Proben, die radioaktiv markierte 14 s Untereinheiten enthalten, mit zunehmender Konzentration des Nanokörpers PVSS 38 C ab. Dies deutet auf eine Zunahme der Menge an Poliovirus 14 s Untereinheiten hin, die mit dem Nanokörper P pvs, S 38 C und indirekt mit den magnetischen Kügelchen verbunden sind.

Da keine Affinität von pvs S 38 C zur N-antigenen und H-antigenen Form des Poliovirus beobachtet wird, scheint der Nanokörper spezifisch für die 14 s-Untereinheit des Poliovirus zu sein. Die Affinität des Nanokörpers zu seinen Antigenen, wie sie mit dieser Methode gemessen wird, ist spezifisch wie die des nicht verwandten Nanokörpers. NB eins zeigt keine Reaktivität gegen die drei antigenen Formen des Poliovirus.

Dieses System erzeugt eine hohe Reproduzierbarkeit, wie diese Dosis-Wirkungs-Kurve zeigt, die von verschiedenen Untersuchern an verschiedenen Tagen erstellt wurde. Sobald diese zuverlässige flüssige Phase gemeistert wird, kann der Affinity-Capture-Assay innerhalb von zwei Stunden ordnungsgemäß durchgeführt werden, wobei die enthaltenen Beats recycelt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diesen auf magnetischen Beats basierenden Flüssigphasen-Affinitätserfassungsassay bei der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen verschiedenen Proteinen verwenden können, insbesondere wenn Festphasen-basierte Systeme nicht verwendet werden können.