Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Gene innerhalb einer Population von Individuen zu identifizieren, die ein Übergewicht an seltenen funktionellen Variationen aufweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Population von DNA-Proben gepoolt wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Next Generation Sequencing-Bibliothek zu erstellen und zu sequenzieren.

Es folgt das Alignment der Reads an der Referenzsequenz und die Erstellung eines Fehlermodells. Der letzte Schritt ist die rechnerische Analyse mit dem Splinter-Algorithmus. Letztendlich wird die Splitteranalyse des gepoolten Next Generation Sequencing verwendet, um Gene innerhalb von Populationen mit einem Übergewicht an seltener funktioneller Varianz zu zeigen.

Heute wird Francesco Vilania, Doktorand im Labor meines Mentors und unseres Mitarbeiters Rob Mitra, sein, und er wird von Enrique Ramos, einem Doktoranden in meinem Labor, begleitet. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. einzelnen einzelnen Genotypen, besteht darin, dass Sie seltene Sequenzvarianten in einer gemischten Population von DNA-Molekülen sehr genau nachweisen können, ohne dass vorherige Informationen erforderlich sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Genetik und Genomik zu beantworten, z. B. wie man die Häufigkeit neuartiger krankheitsbedingter seltener Varianten in großen Kohortenstudien bestimmen kann.

Jedes Splitterexperiment erfordert das Vorhandensein einer Negativ- und Positivkontrolle, um eine optimale Genauigkeit zu erzielen, und die PCR-Reaktionsmischung mit PFU ultra high fidelity vorzubereiten. DNA-Polymerase. Bei der Negativkontrolle handelt es sich um ein PCR-Produkt aus einer DNA-Sequenz, von der bekannt ist, dass sie keine genetische Variation aufweist, wie z. B. ein kloniertes Vektorrückgrat.

Hier wird ein 1.934 Basenpaar Amplikon aus dem M 13 MP 18 Vektor verwendet. Bei der Positivkontrolle kann es sich um einen beliebigen Satz zuvor validierter Sequenzvarianten handeln, die in der gesamten Population vorhanden sind. Falls diese Daten nicht verfügbar sind, hat dieses Labor eine künstliche Positivkontrolle entwickelt, die aus einer 331-Base pro PCR-Produkt aus einer Mischung von manipulierten Sequenzen besteht, die in den in dieser Tabelle aufgeführten PGMT-Easy-Vektor kloniert wurden.

Diese Sequenzen werden kombiniert, um verschiedene kleinere Allelfrequenzen echter Varianten innerhalb des Patientenpools nachzuahmen. Reinigen Sie nach der PCR-Amplifikation der Proben, wie im schriftlichen Protokoll zu diesem Video beschrieben, jedes PCR-Produkt von überschüssigen Primern mit der Kyogen Kayak-Schnellsäulenreinigung oder 96-Well-Filterplatten mit Vakuumverteiler für eine großflächige Reinigung. Nach der Reinigung wird jedes PCR-Produkt mit Standardtechniken quantifiziert.

Bereiten Sie sich darauf vor, alle PCR-Produkte und -Kontrollen in einem Pool zu kombinieren, der nach Molekülanzahl normiert ist. Die Bündelung nach Konzentration führt zu einer Überrepräsentation kleiner Amplikons gegenüber größeren Produkten. Poolen Sie stattdessen eine normalisierte Anzahl von Molekülen pro Amplikon.

Wählen Sie beliebige Zahlen, die groß genug sind, um die Genauigkeit beim Pipettieren zu gewährleisten. Ziehen Sie die PCR-Produkte und -Kontrollen heraus. Die Ligation der PCR-Produkte ist notwendig, da die Fragmentierung kleiner PCR-Antragsteller die Repräsentation wahrscheinlich zu ihren Zwecken verzerren wird.

Aus diesem Grund ligieren wir die Pull-PCR-Produkte vor ihrer Fragmentierung in große Con. Bereiten Sie die Mischung für die stumpfe Ligatur mit T vier Ligase, T vier PNK und PEG vor, wie im Protokoll aufgeführt. Inkubieren Sie die Reaktion 17 Stunden lang bei 22 Grad Celsius.

Anschließend 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius inkubieren und bei vier Grad Celsius halten. Überprüfen Sie die Ligation, indem Sie 50 Nanogramm Probe in ein entstandenes Gel laden. Eine erfolgreiche Ligation führt dazu, dass eine Bande mit hohem Molekulargewicht in der Lane vorhanden ist.

Bereiten Sie sich auf die DNA-Fragmentierung durch eine zufällige Beschallungsstrategie vor, indem Sie die Probe 10 zu eins in Qiagen PB-Puffer verdünnen, um sie weniger viskos zu machen. Fragmentieren Sie dann den großen Konus der PCR-Produkte mit einer Bioruptur des Diagonknotens für 24 Proben und beschallen Sie ihn mit hoher Leistung über einen Zeitraum von 25 Minuten mit 40 Sekunden an und 20 Sekunden aus pro Minute. Überprüfen Sie die Ergebnisse der DNA-Fragmentierung auf einem Agro-Gel und fahren Sie mit der leuchtenden Sequenzierung fort, wie im Text beschrieben.

Um mit der Sequenzierung zu beginnen, lesen Sie Ausrichtung. Konvertieren Sie entweder die Rohsequenzierung, lesen Sie Dateien in das Scarf-Format oder komprimieren Sie sie. Die Komprimierung ist optional.

Es spart Zeit und Platz für die nachfolgenden Analyseschritte, ohne dass relevante Informationen verloren gehen. Richten Sie mit dem mitgelieferten Ausrichtungswerkzeug die Rohlesevorgänge an der mit Anmerkungen versehenen schnelleren Referenzsequenz aus. Spezifisch für die Zielregionen sind die PCR-Reaktionen sowie die Positiv- und Negativkontrollen.

Das Eingabeformat muss im Schalformat oder komprimiert sein. Führen Sie als Nächstes das Datei-Tagging durch, wie im Text beschrieben. Jeder Lauf generiert ein eindeutiges Profil von Sequenzierungsfehlern, das für einen genauen Variantenaufruf charakterisiert werden muss, um Fehler für jeden Lauf zu modellieren.

Eine interne Kontrolle, von der bekannt ist, dass sie von Sequenzvariationen eingesetzt wird, ist in jeder Pool-Beispielbibliothek aus der ausgerichteten getaggten Datei enthalten. Generieren Sie mit dem mitgelieferten Werkzeug eine Fehlermodelldatei mit der negativen Kontrollreferenzsequenz, wobei die gesamte negative Kontrollsequenz verwendet werden kann oder alternativ nur eine Teilmenge, wenn sie durch ihre fünf Primzahlen und drei Primzahlen angegeben wird. Eindeutige Lesevorgänge und Pseudozählungen sollten immer angewendet werden.

Das Werkzeug generiert drei Dateien, die als Parameter für den Ausgabedateinamen benannt sind, der mit null, eins oder zwei endet. Diese Dateien entsprechen einem Null-Fehlermodell erster bzw. zweiter Ordnung für den Variantenaufruf mit Splinter. Für die Visualisierung des Lauffehlerratenprofils sollte immer das Fehlermodell zweiter Ordnung verwendet werden.

Das Pearl-Skript, das zum Plotten des Fehlermodelldiagramms verwendet wird, kann verwendet werden, um ein PDF-Fehlerdiagramm in der Fehlermodelldatei nullter Ordnung zu erstellen. Die Plotdatei zeigt laufspezifische Fehlertrends an und kann verwendet werden, um die maximale Anzahl von Lesebasen für die Analyse abzuleiten. Im folgenden Abschnitt wird gezeigt, wie Sie Splinter für die ausgerichtete Datei ausführen, indem Sie das Fehlermodell verwenden, um seltene Sequenzvarianten zu erkennen.

Der erste Schritt in der Analyse besteht darin, Splinter auf der ausgerichteten Datei unter Verwendung der Referenzsequenz und des Fehlermodells auszuführen. Single-Read-Basen können von der Analyse ausgeschlossen werden, wenn sie sich als fehlerhaft erweisen. Der P-Wert-Cutoff gibt an, wie streng die Analyse des Variantenaufrufs sein wird.

Ein minimaler Cutoff von minus 1,301 ist ein guter Anfang. Die Option "Poolgröße" optimiert die Signal-Rausch-Unterscheidung des Algorithmus, indem sie potenzielle Varianz eliminiert, wenn kleinere Allelfrequenzen kleiner sind als die eines einzelnen Allels im tatsächlichen Pool. Die Option für die Poolgröße sollte auf den nächstgelegenen Wert festgelegt werden, der größer ist als die tatsächliche Anzahl der im Experiment analysierten Allele.

Varianz, die bei niedrigeren Frequenzen aufgerufen wird, wird als Rauschen ignoriert. Nachdem Sie alle Parameter und Dateinamen eingegeben haben, führen Sie Splinter aus. Diese Datei gibt alle Treffer zurück, die in der Stichprobe statistisch signifikant sind, mit einer Beschreibung der Position des Variantentyps der Variante.

p-Wert pro DNA-Strang, Häufigkeit der Variante und Gesamtabdeckung pro DNA-Strang. Das Listfläschchen wird von Splintern verwendet, um die Abdeckung über die gesamte Probe zu normalisieren. Das erste Feld gibt das Amplikon von Interesse an, während das zweite Feld die Position angibt, an der die Mutation vorhanden ist.

N gibt an, dass der Rest der Sequenz keine Mutation enthält. Eine Normalisierung, die Analyse der Positivkontrolle, ist der Schlüssel, um die Sensitivität und Spezifität für einen bestimmten Lauf zu maximieren. Dies ist wichtig, da der anfängliche Cutoff von minus 1,301 höchstwahrscheinlich nicht ausreichen wird, um alle falsch positiven Ergebnisse zu eliminieren.

Jede Splitteranalyse zeigt für jede aufgerufene Variante den tatsächlichen P-Wert an, der nicht als Priorität vorhergesagt werden konnte. Die gesamte Analyse kann jedoch wiederholt werden, indem der am wenigsten strenge P-Wert verwendet wird, der in der ersten Ausgabe für die bekannten richtig positiven Basispositionen angezeigt wird. Dies dient dazu, alle richtig positiven Ergebnisse beizubehalten, während die meisten, wenn nicht sogar alle falsch positiven Ergebnisse ausgeschlossen werden, die in der Regel im Vergleich zu richtig positiven Ergebnissen viel weniger signifikante P-Werte aufweisen.

Um diesen Prozess zu automatisieren, kann das Cutoff-Tester-Skript verwendet werden. Das Cutoff-Tester-Skript erfordert eine Splinter-Ausgabedatei und eine Liste positiver Kontrolltreffer in Form einer tabulatorgetrennten Datei, wie sie für die Normalisierung verwendet wird. Die resultierende Ausgabe ist eine Liste von Grenzwerten, die nach und nach den optimalen Grenzwert erreichen.

Die letzte Zeile stellt den optimalsten Cutoff für den Lauf dar und kann daher für die Datenanalyse verwendet werden. Das optimale Ergebnis besteht darin, die Sensitivität und Spezifität eines Einzelnen zu erreichen. Wenn dies jedoch nicht erreicht wird, kann die Splitteranalyse optimiert werden, indem die Anzahl der eingearbeiteten Lesebasen geändert wird.

Der endgültige Cutoff kann mit dem Cutoff-Cut-Skript auf die Daten angewendet werden, das die Splitterausgabedatei nach Treffern unterhalb des optimalen Cutoffs filtert. In diesem Schritt wird die endgültige Splinter-Ausgabedatei generiert, die Ausschnitte und Indels enthält, die im Beispiel vorhanden sind. Bitte beachten Sie, dass die Ausgabe für Einfügungen etwas anders ist als für Ersetzungen oder Löschungen.

Die Genauigkeit als Funktion der Abdeckung für ein einzelnes Allel in einer gepoolten Stichprobe wird in dieser Art von Diagramm visualisiert. Die Genauigkeit wird geschätzt als die Fläche unter der Kurve, abgekürzt als UC einer Empfängeroperatorkurve, und reicht von einer zufälligen Genauigkeit von 0,5 bis zu einer perfekten Genauigkeit von 1,0. In diesem Beispiel wird ein UC als Funktion der Abdeckung pro Allel für den Nachweis einzelner mutierter Allele in Pools von 200 501.000 Allelen aufgetragen.

Hier wird ein UC als Funktion der Summe für Insertionen, Löschungen und Substitutionen aufgetragen. Dieses Fehlerdiagramm zeigt die Wahrscheinlichkeit, dass eine fehlerhafte Basis an einer bestimmten Position eingebaut wird. Das Fehlerprofil zeigt niedrige Fehlerraten mit einem steigenden Trend in Richtung der drei Primzahlen des Sequenz-Reads.

Bemerkenswert ist, dass verschiedene Referenznukleotide unterschiedliche Fehlerwahrscheinlichkeiten aufweisen. Dieses Diagramm zeigt die Genauigkeit des Splitters bei der Schätzung der Allelfrequenz für Positionen, die eine mehr als 25-fache Abdeckung pro Allel aufweisen. Ein Vergleich zwischen gepoolten DNA-Allelfrequenzen, die durch Splitter geschätzt wurden, mit Allelzahlen, die durch genomweite Assoziationsstudien oder GWAS-Ergebnisse gemessen wurden.

In einer sehr hohen Korrelation wurde eine Population von 974 Individuen gezogen und für die Sequenzierung auf über 20 Kilobasen ausgerichtet. Splinter wurde zum Nachweis seltener Varianten eingesetzt. Gemäß dem Standardprotokoll wurde bei jedem Individuum zuvor eine Genotypisierung durchgeführt, die durch eine WAS-Konkordanz zwischen der Genotypisierung von markierten und neuen Varianten durchgeführt wurde.

Die in der gepoolten Stichprobe eingeforderte Stichprobe war ausgezeichnet. Drei Varianten, von denen zwei in der Population selten waren, wurden aus den Sequenzierungsergebnissen als denovo bezeichnet und durch individuelle Pyro-Sequenzierung validiert, wobei die geringe Allelfrequenz oder die mathematische Konkordanz zwischen Pyro-Sequenzierung und gezogener Sequenzierung ausgezeichnet war. Sobald Sie die seltene Varianz in Ihrer gepoolten Stichprobe gefunden haben, möchten viele Leute wissen, welche funktionalen Konsequenzen die identifizierte Varianz hat.

Die Annotation Ihrer Varianz wird also zum nächsten Schritt im Prozess nach einer Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der DNA-Sequenzierung den Weg, seltene Varianten schnell und kostengünstig zu untersuchen, um seltene Varianten in einer großen Populationsstudie zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man seltene Sequenzvarianten in einem Pool und einer DNA-Probe mit Splitter erkennt.