Name: Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit SPLINTER seltene Varianten in gepoolten Sequenzierungsdaten identifizieren. Diese computergestützte Methode ermöglicht präzise Variantendetektion in großen Populationen für Krebsforschung und Genetik.

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Diese Arbeit wurde von der Kinder-Discovery Institute Zuschuss MC-II-2006-1 (RDM und TED), der NIH Epigenetik Roadmap Zuschuss [1R01DA025744-01 und 3R01DA025744-02S1] (RDM und FLMV), U01AG023746 (SC), die Saigh unterstützt Foundation (FLMV und TED), 1K08CA140720-01A1 und Alex &#39;Lemonade Stand &quot;A&quot;-Award-Unterstützung (TED). Wir danken dem Access-Genome Technology Center in der Abteilung für Genetik an der Washington University School of Medicine um Hilfe bei der Genomanalyse. Das Zentrum wird teilweise durch NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842 dem Siteman Cancer Center und von ICTS / CTSA Grant # UL1RR024992 aus dem NationalCenter for Research Resources (NCRR), eine Komponente von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt wird, und NIH-Roadmap for Medical Research. Diese Publikation ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der NCRR oder NIH.

<ol><li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li>
<li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Sequencing+Technologies%3A+Methods+and+Goals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li>
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<li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li>
<li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+allelic+spectrum+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li>
<li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li>
<li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li>
<li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li>
<li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li>
<li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Es gibt zunehmend Hinweise, dass die Inzidenz und therapeutische Reaktion von gemeinsamen, komplexen Phänotypen und Krankheiten wie Fettleibigkeit 8, 4 Hypercholesterinämie, Hypertonie 7 und andere durch persönliche Profile von seltenen Variation kann moderiert werden. Identifikation der Gene und Signalwege, wo diese Varianten Aggregat in die betroffene Bevölkerung tiefe diagnostische und therapeutische Implikationen haben wird, aber die Analyse Betroffenen separat Zeit sein und unerschwinglich. Populations-basierte Analyse bietet eine effizientere Methode zur Erfassung genetischer Variation an verschiedenen Loci. Wir stellen eine neue gepoolte-DNA-Sequenzierung-Protokoll mit der Splinter-Software-Paket entwickelt, um diese Art der genetischen Unterschiede zwischen den Populationen zu identifizieren gepaart. Wir zeigen die Genauigkeit dieser Methode bei der Identifizierung und Quantifizierung von kleineren Allele innerhalb eines großen gepoolten Population von 947 Personen, darunter seltene Varianten, die warenDe-novo-Sequenzierung aus der gepoolten genannt und validiert durch einzelne Pyrosequenzierung. Unsere Strategie unterscheiden sich von anderen Protokollen durch den Einbau von einer positiven und einer negativen Kontrolle in jedem Versuch. Dies ermöglicht SPLINTER viel höhere Genauigkeit und Leistung im Vergleich zu anderen Ansätzen 1 zu erzielen. Die optimale Abdeckung von 25-fach pro Allel wird unabhängig von der Größe des Pools, fixiert damit die Analyse von großen Pools möglich wie diese Anforderung nur skaliert linear mit der Größe des Pools. Unser Ansatz ist sehr flexibel und kann an jeden Phänotyp von Interesse, sondern auch für Proben, die von Natur aus heterogen sind, wie gemischte Zellpopulationen und Tumorbiopsien angewendet werden. Angesichts der ständig wachsenden Interesse an der gepoolten Sequenzierung von großen Zielregionen wie die Exom oder Genom, ist unsere Bibliothek prep und Splinter Analyse kompatibel mit Custom-Abscheidung und-ganze-Exom Sequenzierung, aber die Angleichung Dienstprogramm in der Splinter-Paket wurde nicht entwickelt für großArtikeln Sequenzen. Deshalb haben wir erfolgreich die dynamische Programmierung Aligner eingesetzt, für genomweite Ausrichtungen durch Aufruf Variante aus der Sammelprobe (Ramos et al., Eingereicht) gefolgt Novoalign. So können unsere vereinigt Sequenzierungs-Strategie erfolgreich zu skalieren auf größere mit steigenden Mengen an Ziel-Sequenz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz Namen </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Abschnitt </td></tr><tr><td> PfuUltra High-Fidelity </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Betain </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA-Vektor </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> pGEM-T Easy </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> T4 Polynukleotidkinase </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> T4-Ligase </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Polyethylenglykol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Bioruptor Sonicator </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2,3 </td></tr></tbody></table>

nachweis seltener varianten von genomic pooled-sequenzierung mit splinter

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Als DNA-Sequenzierung-Technologie hat sich in den letzten Jahren 2 vorgeschoben hat sich immer deutlicher gezeigt, dass die Menge an genetischer Variation zwischen zwei beliebigen Individuen größer als bisher angenommen 3 ist. Im Gegensatz dazu hat sich Array-basierte Genotypisierung konnten keine signifikante Anteil an gemeinsamen Sequenzvarianten auf die phänotypische Variabilität von 4,5 häufige Erkrankung zu identifizieren. Zusammengenommen haben diese Beobachtungen auf die Entwicklung der Volkskrankheit / seltene Variante Hypothese, dass die Mehrheit der &quot;fehlenden Erblichkeit&quot; in gemeinsamen und komplexen Phänotypen statt beruht auf einer individuellen persönlichen Profil von seltenen oder private DNA-Varianten 8.6 geführt . Allerdings charakterisieren, wie selten Variation komplexen Phänotypen beeinflusst erfordert die Analyse von vielen Betroffenen an vielen genomischen Loci, und eignet sich ideal zu einer ähnlichen Befragung in einem nicht betroffenen Kohorte verglichen. Trotz der Macht durch die Sequenzierung der heutigen Plattformen, eine angebotenebevölkerungsbezogene Umfrage von vielen genomischen Loci und der anschließenden computergestützten Analyse erforderlich bleibt unerschwinglich für viele Forscher. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir eine Pool-Sequenzierung Ansatz 1,9 und eine neuartige Software-Paket 1 für hochgenaue Erfassung seltene Variante aus den resultierenden Daten entwickelt. Die Fähigkeit, Pool Genome von ganzen Populationen von betroffenen Einzelpersonen und Befragung der Grad der genetischen Variation an verschiedenen Zielregionen in einer einzigen Bibliothek Sequenzierung bietet eine hervorragende Kosten-und Zeitersparnis zu herkömmlichen Single-Probe-Sequenzierung Methodik. Mit einer mittleren Sequenzierung Deckung pro Allel des 25-fachen, nutzt unsere benutzerdefinierten Algorithmus, Splinter, eine interne Variante Aufruf Regelstrategie zu Insertionen, Deletionen und Substitutionen rufen bis zu vier Basenpaare lang mit hoher Sensitivität und Spezifität aus Pools von bis zu 1 mutierte Allel in 500 Individuen. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Herstellung der gepoolten sequencing Bibliothek gefolgt von Schritt-für-Schritt-Anleitung, den Splitter-Paket für gepoolten Analyse Sequenzierung (verwenden <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Wir zeigen einen Vergleich zwischen gepoolten Sequenzierung von 947 Individuen, von denen alle unterzog sich auch genomweite Array, an über 20kb der Sequenzierung pro Person. Übereinstimmung zwischen Genotypisierung von getaggt und neue Varianten in der Sammelprobe genannt waren ausgezeichnet. Diese Methode kann einfach skaliert werden bis zu einer beliebigen Anzahl von genomischen Loci und einer beliebigen Anzahl von Individuen. Durch die Integration der internen positiven und negativen Kontrollen Amplikon in Verhältnissen, die die Bevölkerung imitieren untersuchten, kann der Algorithmus für eine optimale Leistung zu kalibrieren. Diese Strategie kann auch zur Verwendung mit der Hybridisierung Fang oder individualspezifischen Barcodes geändert werden und dann zur Sequenzierung von natürlich heterogenen Proben, wie Tumor-DNA eingesetzt werden.

Pooled DNA-Sequenzierung ist eine schnelle und kostengünstige Strategie, um seltene Varianten mit komplexen Phänotypen assoziiert in großen Kohorten zu erkennen. Hier beschreiben wir die computergestützte Analyse von gepoolten, Next-Generation-Sequenzierung von 32 Krebs-Genen unter Verwendung des SPLINTER Software-Paket. Diese Methode ist skalierbar und für jeden interessierenden Phänotyp.

Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

Da die DNA-Sequenzierungstechnologie in den letzten Jahren erheblich Fortschritte gemacht hat, wurde immer deutlicher, dass das Ausmaß der genetischen Variation zwischen beliebigen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gene innerhalb einer Population von Individuen zu identifizieren, die ein Übermaß an seltenen funktionellen Variationen aufweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Population von DNA-Proben gepoolt wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Next-Generation-Sequenzierungs-Bibliothek herzustellen und zu sequenzieren.Darauf folgt die Ausrichtung der Reads an der Referenzsequenz und die Erstellung eines Fehlermodells. Der letzte Schritt ist die rechnergestützte Analyse mithilfe des Splinter-Algorithmus. Letztendlich wird die Splinter-Analyse von gepooltem Next-Generation-Sequencing verwendet, um Gene innerhalb von Populationen aufzuzeigen, die einen Überschuss an seltenen funktionellen Varianten aufweisen, und damit das Verfahren zu demonstrieren.Heute wird Francesco Vilania dabei sein, ein Doktorand in dem Labor meines Mentors und Kooperationspartners Rob Mitra, der gemeinsam mit Enrique Ramos, einem Doktoranden in meinem Labor, arbeiten wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Genotypisierung einzelner Individuen liegt darin, dass sie eine sehr präzise Detektion seltener Sequenzvarianten in einer gemischten Population von DNA-Molekülen ermöglicht, ohne dass vorherige Informationen erforderlich sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Genetik und Genomik zu beantworten, beispielsweise wie die Häufigkeit neuartiger, krankheitsverursachender seltener Varianten in großen Kohortenstudien bestimmt werden kann.Jedes Splinter-Experiment erfordert die Verwendung eines negativen und eines positiven Kontrollansatzes, um eine optimale Genauigkeit zu erzielen. Bereiten Sie die PCR-Reaktionsmischung unter Verwendung von PFU ultra high fidelity DNA-Polymerase vor. Die negative Kontrolle ist ein PCR-Produkt einer beliebigen DNA-Sequenz, von der bekannt ist, dass sie keine genetische Variation aufweist, beispielsweise ein klonierter Vektor-Backbone.Hier wird ein 1.934 Basenpaare langes Amplikon aus dem M13MP18-Vektor verwendet. Die positive Kontrolle kann aus einem beliebigen Satz zuvor validierter Sequenzvarianten bestehen, die in der gesamten Population vorhanden sind. Falls diese Daten nicht verfügbar sind, hat dieses Labor eine künstliche positive Kontrolle entwickelt, die aus einem 331 Basenpaare langen PCR-Produkt aus einer Mischung von konstruierten Sequenzen besteht, die in den pGEM-T-easy-Vektor kloniert wurden, wie in dieser Tabelle aufgeführt.Diese Sequenzen werden kombiniert, um verschiedene Frequenzen von Minor-Allelen echter Varianten innerhalb des Patientenkollektivs nachzuahmen. Nach der PCR-Amplifikation der Proben, wie im schriftlichen Protokoll zu diesem Video beschrieben, reinigen Sie jedes PCR-Produkt von überschüssigen Primern mithilfe der Kyogen-Kayak-Schnellsäulenchromatographie oder von 96-Loch-Filtrationsplatten mit Vakuummanifold für großtechnische Reinigung. Quantifizieren Sie anschließend jedes gereinigte PCR-Produkt mit Standardmethoden.Bereiten Sie die Kombination aller PCR-Produkte und Kontrollen zu einem Pool vor, der nach Molekülzahl normalisiert ist. Die Poolbildung nach Konzentration führt zu einer Überrepräsentation kleiner Amplikone gegenüber größeren Produkten. Stattdessen sollten eine normalisierte Anzahl von Molekülen pro Amplikon gepoolt werden.Wählen Sie beliebige Zahlen, die groß genug sind, um die Genauigkeit während des Pipettierens zu gewährleisten. Ziehen Sie die PCR-Produkte und Kontrollen ab. Eine Ligierung der PCR-Produkte ist notwendig, da die Fragmentierung kleiner PCR-Amplicons wahrscheinlich zu einer Verzerrung der Darstellung zugunsten ihrer Enden führt.Aus diesem Grund ligieren wir die amplifizierten PCR-Produkte vor deren Fragmentierung in ein großes Konstrukt. Bereiten Sie eine Mischung für die stumpfendige Ligation unter Verwendung von T4-Ligase, T4-PNK und PEG gemäß dem Protokoll vor. Inkubieren Sie die Reaktion bei 22 Grad Celsius für 17 Stunden.Anschließend 20 Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren und danach bei vier Grad Celsius lagern. Danach die Ligierung überprüfen, indem 50 Nanogramm der Probe in ein Agarosegel aufgetragen werden. Bei erfolgreicher Ligierung zeigt sich ein Band mit hohem Molekulargewicht in der entsprechenden Spur.Bereiten Sie die DNA-Fragmentierung mittels einer zufälligen Sonifikationsstrategie vor, indem Sie die Probe 1:10 im Qiagen PB-Puffer verdünnen, um sie weniger viskos zu machen. Anschließend werden die großen Konen der PCR-Produkte mit einem 24-Proben-Diagonalknoten-Bioruptor fragmentiert, indem 25 Minuten lang bei hoher Leistung sonifiziert wird, mit jeweils 40 Sekunden Einschalt- und 20 Sekunden Ausschaltzeit pro Minute. Überprüfen Sie die Ergebnisse der DNA-Fragmentierung an einem Agarosegel und fahren Sie wie im Text beschrieben mit der Illumina-Sequenzierung fort.Um die Sequenzierung zu beginnen, führen Sie die Read-Alignierung durch. Konvertieren Sie entweder die rohen Sequenzier-Read-Dateien in das SCARF-Format oder komprimieren Sie sie. Die Komprimierung ist optional.Es spart Zeit und Platz für die nachfolgenden Analyse-Schritte, ohne relevante Informationen zu verlieren. Richten Sie mithilfe des beigefügten Alignments-Tools die rohen Reads an der annotierten Referenzsequenz aus. Spezifisch für die gezielten Regionen gehören die PCR-Reaktionen sowie die positiven und negativen Kontrollen dazu.Das Eingabeformat muss im SCARF-Format oder komprimiert vorliegen. Führen Sie anschließend das Datei-Tagging wie im Text beschrieben durch. Jeder Durchlauf erzeugt ein eindeutiges Profil von Sequenzierungsfehlern, das zur genauen Variantenerkennung charakterisiert wird, um Fehler für jeden Durchlauf zu modellieren.Ein interner Kontrollstandard, von dem bekannt ist, dass er sequenzbedingte Variation aufweist, wird in jede Pool-Probenbibliothek aus der alignierten, markierten Datei einbezogen. Erstellen Sie mithilfe des enthaltenen Werkzeugs eine Fehlermodell-Datei mit der Referenzsequenz der Negativkontrolle; sämtliche Sequenzen der Negativkontrolle können verwendet werden, oder alternativ nur ein Teilsatz, sofern dieser durch seine 5'- und 3'-Enden spezifiziert ist. Eindeutige Reads und Pseudocounts sollten stets angewendet werden.Das Tool erzeugt drei Dateien, die entsprechend des Parameters für den Ausgabedateinamen mit null, eins oder zwei enden. Diese Dateien entsprechen einem Fehlermodell nullter, erster und zweiter Ordnung für die Variantenidentifizierung mit Splinter. Für die Visualisierung des Fehlerprofilverlaufs sollte stets das Fehlermodell zweiter Ordnung verwendet werden.Das Pearl-Skript, das zum Erstellen des Fehlermodell-Graphen verwendet wird, kann eingesetzt werden, um aus der Fehlermodell-Datei der nullten Ordnung ein PDF-Fehlerdiagramm zu erzeugen. Die Plot-Datei zeigt laufspezifische Fehlertrends auf und kann genutzt werden, um die maximale Anzahl an Read-Basen für die Analyse abzuleiten. Im folgenden Abschnitt wird gezeigt, wie splinter auf der alignierten Datei ausgeführt wird, um mithilfe des Fehlermodells seltene Sequenzvarianten zu detektieren.Der erste Schritt der Analyse besteht darin, splinter auf die alignierte Datei unter Verwendung der Referenzsequenz und des Fehlermodells anzuwenden. Einzelne Basen der Reads können von der Analyse ausgeschlossen werden, wenn sie als fehlerhaft erkannt werden. Der P-Wert-Schwellenwert legt fest, wie streng die Variantenidentifizierung durchgeführt wird.Ein minimaler Grenzwert von minus 1,301 ist ein guter Ausgangspunkt. Die Poolgrößenoption optimiert die Signal-Rausch-Diskriminierung des Algorithmus, indem potenzielle Varianzen mit geringeren Allelfrequenzen als der eines einzelnen Allels im tatsächlichen Pool ausgeschlossen werden. Die Poolgrößenoption sollte auf den nächsthöheren Wert gesetzt werden, der größer ist als die tatsächliche Anzahl der im Experiment analysierten Allele.Varianzen, die bei niedrigeren Frequenzen auftreten, werden als Rauschen ignoriert. Nach der Eingabe aller Parameter und Dateinamen führen Sie splinter aus. Diese Datei gibt alle Treffer zurück, die statistisch signifikant über die Probe hinweg sind, zusammen mit einer Beschreibung der Position und des Variantentyps.P-Wert pro DNA-Strangfrequenz der Variante und Gesamtüberdeckung pro DNA-Strang. Die Listenflasche wird von Splinter verwendet, um die Überdeckung über die Probe hinweg zu normalisieren. Das erste Feld gibt das gewünschte Amplikon an, während das zweite Feld die Position angibt, an der die Mutation vorliegt.N zeigt an, dass der restliche Sequenzabschnitt keine Mutationen enthält. Bei einer Normalisierung ist die Analyse der positiven Kontrolle entscheidend, um die Empfindlichkeit und Spezifität eines bestimmten Durchlaufs zu maximieren. Dies ist wichtig, da der anfängliche Schwellenwert von minus 1,301 höchstwahrscheinlich nicht ausreicht, um alle falsch positiven Ergebnisse auszuschließen.Jede Splinter-Analyse zeigt den tatsächlichen P-Wert für jede identifizierte Variante an, der nicht a priori vorhergesagt werden konnte. Die gesamte Analyse kann jedoch wiederholt werden, indem der am wenigsten strenge P-Wert verwendet wird, der in der anfänglichen Ausgabe für die bekannten positiven Basenpositionen angezeigt wird. Dies dient dazu, alle echten Positiven beizubehalten und gleichzeitig die meisten, wenn nicht alle, falschen Positiven auszuschließen, die typischerweise deutlich weniger signifikante P-Werte aufweisen als echte Positive.Um diesen Prozess zu automatisieren, kann das Cutoff-Tester-Skript verwendet werden. Das Cutoff-Tester-Skript benötigt eine Splinter-Ausgabedatei und eine Liste positiver Kontrolltreffer in Form einer tabulatorgetrennten Datei, wie sie für die Normalisierung verwendet wird. Die resultierende Ausgabe ist eine Liste von Cutoffs, die schrittweise den optimalen Cutoff erreichen.Die letzte Zeile stellt den optimalsten Schwellenwert für den Durchlauf dar und kann daher für die Datenanalyse verwendet werden. Das optimale Ergebnis besteht darin, eine Sensitivität und Spezifität von eins zu erreichen. Falls dies nicht erreicht wird, kann die Splinter-Analyse optimiert werden, indem die Anzahl der integrierten Sequenzierzyklen verändert wird.Der endgültige Cutoff kann mithilfe des Cutoff-Cut-Skripts auf die Daten angewendet werden, das die Splinter-Ausgabedatei nach Treffern unterhalb des optimalen Cutoffs filtert. Bei diesem Schritt wird die endgültige Splinter-Ausgabedatei generiert, die Snips und Indels enthält, die in der Probe vorhanden sind. Beachten Sie, dass die Ausgabe für Insertionen leicht von der für Substitutionen oder Deletionen abweicht.Die Genauigkeit in Abhängigkeit von der Abdeckung für ein einzelnes Allel in einer gepoolten Probe wird in dieser Art von Diagramm veranschaulicht. Die Genauigkeit wird als Fläche unter der Kurve (abgekürzt AUC) einer Receiver-Operator-Charakteristik geschätzt und reicht von einer zufälligen Genauigkeit von 0,5 bis zu einer perfekten Genauigkeit von 1,0. In diesem Beispiel wird die AUC als Funktion der Abdeckung pro Allel für den Nachweis einzelner mutierter Allele in Pools von 200 bis 501.000 Allelen dargestellt.Hier wird eine UC als Funktion der Gesamtanzahl für Insertionen, Deletionen und Substitutionen dargestellt. Dieses Fehlerdiagramm zeigt die Wahrscheinlichkeit, an einer gegebenen Position eine falsche Base einzubauen. Das Fehlerprofil weist niedrige Fehlerraten auf, die in Richtung des 3'-Endes des Sequenzierungsreads ansteigen.Auffällig unterschiedliche Referenznukleotide weisen unterschiedliche Fehlerwahrscheinlichkeiten auf. Diese Darstellung zeigt die Genauigkeit von Splinter bei der Schätzung der Allelfrequenz für Positionen mit einer Abdeckung von mehr als 25-fach pro Allel. Ein Vergleich zwischen aus gepoolter DNA geschätzten Allelfrequenzen mittels Splinter und durch genomweite Assoziationsstudien oder GWAS-Ergebnisse gemessenen Allelhäufigkeiten.Bei einer sehr hohen Korrelation wurde eine Population von 974 Individuen gezogen und gezielt über 20 Kilobasen zur Sequenzierung untersucht. Splinter wurde zur Detektion seltener Varianten angewendet. Gemäß dem Standardprotokoll war bei jedem Individuum zuvor eine Genotypisierung mittels GWAS durchgeführt worden, um die Übereinstimmung zwischen der Genotypisierung markierter und neuartiger Varianten zu überprüfen.Die in der gepoolten Probe identifizierten Varianten waren ausgezeichnet. Drei Varianten, von denen zwei in der Bev&ouml;lkerung selten waren, wurden als de-novo-Varianten aus den Sequenzierergebnissen identifiziert und durch individuelle Pyrosequenzierung validiert; die Frequenzen der seltenen Allele oder die &Uuml;bereinstimmung zwischen Pyrosequenzierung und gepoolter Sequenzierung waren hervorragend. Nachdem Sie Ihre seltenen Varianten in der gepoolten Probe gefunden haben, m&ouml;chten viele wissen, welche funktionellen Auswirkungen die identifizierten Varianten haben.Daher wird die Annotation Ihrer Varianz zum nächsten Schritt im Prozess nach einer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der DNA-Sequenzierung den Weg, seltene Varianten auf schnelle und kostengünstige Weise zu untersuchen, um seltene Varianten in großen populationsbasierten Studien zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man seltene Sequenzvarianten in einer DNA-Probe mittels Splinter nachweist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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