Entwicklung einer Bronchiolitis obliterans in einem Mausmodell der orthotopen Lungentransplantation
10. Juli 2012
Bronchiolitis obliterans ist der Schlüssel Hindernis für die langfristige Überleben der Lunge Transplantatempfänger und das Fehlen einer robusten präklinischen Modell schließt die Prüfung Bronchiolitis obliterans Immunpathogenese. Im Gegensatz zu anderen Organtransplantationen hat vaskularisierten Maus Lungentransplantation erst vor kurzem entwickelt worden. Hier zeigen wir unser eigenständig entwickeltes Modell Bronchiolitis obliterans nach murinen orthotopen Single-Lungen-Transplantation.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein literatives Bronchiolitis-Modell zu etablieren, das die orthotope Lungentransplantation widerspiegelt. Dazu wird zunächst die Spenderlunge einer C 57 BL 10 Maus entnommen. Der zweite Schritt besteht darin, die Manschette für den Bronchus, die Lungenarterie und die Vene für die Anastomose vorzubereiten.
Als nächstes wird die vorbereitete Spenderlunge in die Maus des Empfängers C fünf sieben BL sechs transplantiert. Der letzte Schritt besteht darin, die transplantierte Maus 21 oder 28 Tage nach der Transplantation zu beobachten. Letztendlich wird die histologische Analyse verwendet, um literative Bronchiolitis-Läsionen in der transplantierten Lunge nachzuweisen.
Der Hauptvorteil dieses Modells im Vergleich zum spiegelnden heterotopen Atemwegstransplantationsmodell besteht darin, dass das aktuelle Modell den menschlichen Zustand nachahmt. Im Allgemeinen werden Individuen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die höheren Strukturen bei Mäusen sehr empfindlich und anfälliger für Verletzungen sind, da sie nur ein Zehntel der Masse der Ratte haben. Legen Sie die Spendermaus in eine versiegelte Haltekammer und leiten Sie eine Anästhesie mit 5% Fluor ein. Verwenden Sie anschließend den intravenösen 20-Gauge-Katheter, um die Maus oder Trae zu intubieren, und legen Sie sie dann an ein Nagetierbeatmungsgerät.
Halten Sie die Anästhesie mit ein bis 2 % Fluor aufrecht. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Maus vollständig betäubt ist, weil sie nicht auf Schwanzbewegungen und Zehenkneifen reagiert, platzieren Sie sie in Rückenlage und bereiten Sie den Bauch mit 70% Alkohol vor. Schneide nun mit einer Schere die Haut über dem Bauch ab und lege die Bauchmuskulatur frei.
Führen Sie als Nächstes eine Laparsternotomie durch, indem Sie zuerst einen Mittellinienschnitt durch die Bauchdecke machen und dann quer über das Brustbein schneiden, den Darm wegbewegen und die untere Hohlvene lokalisieren, die sich direkt unter der Leber befindet. Injizieren Sie Heparin in einer Menge von 100 Mikrolitern pro Kilogramm in die IVC. Als nächstes ziehen Sie das falciforme Band der Leber nach unten und durchtrennen das Zwerchfell entlang des ventralen kausalen Ansatzes in Richtung Wirbelsäule.
Schneiden Sie beide Seiten der Brustwand bis zum Hals ab, um die Brusthöhle freizulegen. Schneiden Sie den Brustkorb beidseitig unter Schonung der Lunge ab und entfernen Sie die Thymusdrüse. Schneiden Sie als Nächstes die intrathorakale IVC auf Höhe des Zwerchfells.
Lokalisieren Sie nun das Herz und entfernen Sie das rechte Vorhofohr. Machen Sie dann einen Querschnitt an der Wurzel des Lungenarterienstamms und spülen Sie mit dem Schnitt die Lunge mit zwei Millilitern gekühlten Laktationsringern und 0,1 Millilitern Heparin. Legen Sie die Luftröhre frei und schneiden Sie sie dann zusammen mit der Speiseröhre weg.
Jetzt wird die Belüftung bei zwei Dritteln der Endflutinflation gestoppt. Den Herzblock herausschneiden und auf Eis lagern. Legen Sie Gaze auf die herausgeschnittene Lunge, um sie vor Licht zu schützen.
Schneiden Sie das Lungenband bis zur Lungenvene oder pv. Entfernen Sie die Speiseröhre und die Aorta, um den Hilum zu lokalisieren. Suchen Sie die Lungenarterie oder Pa, die sich an der schädelförmigsten Seite des Hilums und des daran befestigten Hauptbronchus befindet.
Präparieren Sie die Lungenarterie vorsichtig vom Bronchus weg. Stellen Sie nun eine PA-Manschette aus einem 24-Gauge-IV-Katheter her, indem Sie ihn auf eine Länge von 0,5 Millimetern mit einer Verlängerung von 0,7 Millimetern schneiden. Die Oberfläche der Manschette ist AB geflochten.
Um eine Oberfläche für die Anastomose zu schaffen, wird eine Manschette für den Bronchus aus ähnlichem Material wie die PA-Manschette hergestellt, nur mit einem 20-Gauge-Katheter, der auf eine Länge von einem Millimeter geschnitten ist und eine Verlängerung von 0,7 Millimetern aufweist. Die Größe der PV-Manschette variiert mit dem Gewicht der Spendermaus. Für Mäuse mit einem Gewicht von 24 bis 27 Gramm.
Die Manschettengröße beträgt 22 Gauge mit 0,7 Millimeter Länge und 0,7 Millimeter Verlängerung für Mäuse mit einem Gewicht von 27 bis 32 Gramm. Die Längen sind gleich, aber es wird ein 20-Gauge-Katheter verwendet. Führen Sie nun die Manschetten in die distale Linse der Lungenarterie ein, die Lungenvene und den Bronchus und befestigen Sie sie jeweils mit neun Oh-Seidennähten.
Nachdem alle Manschetten richtig befestigt wurden. Wickeln Sie die vorbereitete Spenderlunge in mit Laktation getränkte Gaze und legen Sie sie bis zur Transplantation auf Eis. Zur Vorbereitung der Empfängermaus wird eine Anästhesie eingeleitet und auf die gleiche Weise beatmet, wie es bei der Spende der Fall war.
Rasieren Sie die linke Brustwand und bereiten Sie mit 70% Alkohol vor. Beginnen Sie mit einem Thorakotomieschnitt im linken dritten Interkostalraum. Verlängern Sie den Schnitt dorsal nahe der Wirbelsäule.
Stellen Sie sicher, dass das Operationsfeld steril drapiert ist, und platzieren Sie eine Mikrogefäßklemme an den linken Lungengefäßen und dem Bronchus neben dem Herzen. Die Lungenarterie ist in kranialer Hinsicht, die Lungenvene am verhätschelten Ende des Hilums und der Bronchus dazwischen zu sehen. Verwenden Sie als Nächstes eine sanfte Traktion an einem Hämostaten, um eine leichte Spannung auf dem Pa, PV und Bronchus zu verursachen.
Lassen Sie die hilären Strukturen eingespannt und resezieren Sie vorsichtig die linke Lunge. Isolieren Sie die Lungenarterie und die Lungenvene und den Bronchus und legen Sie dann eine oh Naht locker um jede Struktur. Präparieren Sie die PA vollständig von ihrer Adventitialscheide und machen Sie dann einen kleinen Querschnitt von etwa einem Viertel des Gefäßumfangs in die Vorderwand.
Während die Fortsetzung des dorsalen Teils der Arterie intakt bleibt, nehmen Sie die Spenderlunge, die in kalt laktierte, mit Baumwollgaze getränkte Baumwollgaze eingewickelt ist, und positionieren Sie sie in der Brusthöhle. Führen Sie dann die Manschetten in die PA, PV und Bronchus des Empfängers ein, um eine Anastomose zu erzeugen, und ligieren Sie diese mit Nanonaht. Entfernen Sie als Nächstes die Empfängerlunge.
Entfernen Sie dann die hiläre Kreuzklemme, die eine Reperfusion und Beatmung ermöglicht. Positionieren Sie die transplantierte Lunge wieder in den Thorax des Empfängers und schließen Sie den Thorakotomieschnitt. Mit fünf Nähten sollte sich die Maus nun von der Narkose erholen. Buprenorphin kann zur Schmerzlinderung verabreicht werden, nachdem die Maus das Bewusstsein wiedererlangt hat.
Diese Tabelle zeigt die histologischen Werte der akuten Abstoßung und Prävalenz der literativen Bronchiolitis oder OB. Die Bewertung der akuten Abstoßung nach der Transplantation wird als A-Score bezeichnet. Die Allotransplantatkombinationen zeigen im Vergleich zum ISO-Transplantat eine deutlich akutere oder chronische Abstoßungspathologie. Darüber hinaus war die Prävalenz der literativen Bronchiolitis in den Allotransplantatkombinationen signifikant höher als in den ISO-Transplantaten an den Tagen 21 und 28 nach der Transplantation.
Die Makrobefunde und die Histopathologie 28 Tage nach der Lungentransplantation sind hier dargestellt. Diese Bilder zeigen Makrobefunde und H- und E-gefärbte ISO-Transplantatlunge und rechte naive Lunge. Diese Bilder zeigen h und e und masen trireme gefärbtes BL 10 Lungen-Allotransplantat, das in einen BL 6-Mausempfänger transplantiert wurde, der OB bzw. Nicht-OB entwickelte.
Der weiße Pfeil in einem B kennzeichnet die OB-Läsionen. Dieses Bild zeigt ein BL-Allotransplantat mit sechs Lungen, das in einen BL 10-Mausempfänger transplantiert wurde, sobald es gemeistert wurde. Diese Technik kann in fast einer halben Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Der Nutzen dieser Technik besteht darin, dass sie zur Beantwortung mechanistischer Fragen in Bezug auf primäre Transplantatdysfunktion, akute Abstoßung und ablative Bronchiolitis nach Lungentransplantation eingesetzt werden kann.
Übersicht
Diese Studie präsentiert ein Modell für obliterative Bronchiolitis nach orthotoper Einzellunge-Transplantation bei Mäusen. Das Modell zielt darauf ab, menschliche Bedingungen nachzubilden und die Herausforderungen in der Immunpathogenese von Lungentransplantationen zu adressieren.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Transplantationsimmunologie
- Bronchiolitis-Pathologie
- Mausmodelle in der biomedizinischen Forschung
Hintergrund
- Obliterative Bronchiolitis ist ein Haupthindernis für den Erfolg von Lungentransplantationen.
- Bestehende Modelle ahmen die menschlichen Lungentransplantationsbedingungen nicht ausreichend nach.
- Jüngste Fortschritte haben die vaskularisierte Mauslungentransplantation ermöglicht.
- Diese Studie stellt ein neues Modell zur Untersuchung obliterativer Bronchiolitis vor.
Zweck der Studie
- Ein zuverlässiges Modell für die Untersuchung obliterativer Bronchiolitis zu etablieren.
- Die Untersuchung der Immunpathogenese bei Lungentransplantationen zu erleichtern.
- Das Verständnis von Komplikationen nach der Transplantation zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Entnahme von Spenderlungen von C57BL/10 Mäusen.
- Vorbereitung von Manschetten für Bronchus-, Pulmonalarterie- und Venenanastomosen.
- Transplantation der Spenderlungen in C57BL/6 Empfängermäuse.
- Durchführung einer histologischen Analyse nach der Transplantation zur Beurteilung der Bronchiolitis-Läsionen.
Hauptergebnisse
- Das Modell ahmt erfolgreich die menschliche obliterative Bronchiolitis nach.
- Die histologische Analyse zeigte signifikante Läsionen in transplantierten Lungen.
- Es wurde eine höhere Ablehnungspathologie bei Allotransplantaten im Vergleich zu Isotransplantaten festgestellt.
- Das Modell bietet eine Plattform für zukünftige Forschung in der Lungentransplantations-Immunologie.
Schlussfolgerungen
- Dieses neue Modell ist ein wertvolles Instrument zur Untersuchung von Komplikationen nach Lungentransplantationen.
- Es verbessert das Verständnis der Mechanismen der obliterativen Bronchiolitis.
- Zukünftige Studien können dieses Modell für therapeutische Fortschritte nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Establishing a murine model of obliterative bronchiolitis addresses a critical unmet need in lung transplant research by replicating human pathophysiology. This model enables mechanistic interrogation of immunopathogenic processes driving chronic allograft dysfunction. It supports preclinical de-risking of therapeutic strategies targeting fibroproliferative airway lesions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of alloimmune mechanisms underlying fibroproliferative bronchiolar lesions.
- Operational Value: Provides a vascularized, orthotopic system for functional target validation in transplant immunology.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing of pathways involved in epithelial-mesenchymal transition and fibrosis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histopathological endpoints for assessing lesion burden and progression.
- Operational Value: Standardized surgical procedure enables reproducible model generation across laboratories.
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery through longitudinal analysis of allograft tissue.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Mirrors human obliterative bronchiolitis pathology, enhancing translational relevance of preclinical findings.
- Operational Value: Allows evaluation of candidate therapeutics in a clinically relevant microenvironment.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by isolating variables in alloimmune versus ischemia-reperfusion injury.
Pipeline & Workflow Integration
The model integrates into discovery workflows by providing a disease-relevant system for target validation prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of immunomodulatory targets.
- Screening: Delivers quantitative histological readouts for compound effect assessment.
- Analytics: Enables statistical comparison of lesion prevalence across experimental groups.
- Translational Research: Connects immunological mechanisms to histopathological outcomes in a preclinical setting.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for chronic rejection studies across therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by modeling human-like fibro-obliterative lesions.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized cuff-based anastomosis and postoperative monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in chronic rejection pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of interventions based on histopathological efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques and murine anesthesia management.
- Dependent on specialized instrumentation for vascular and airway cuff preparation.
- Necessitates standardized histological scoring protocols for cross-functional consistency.
- Involves adaptation considerations for different murine genetic backgrounds.
- Limited by the technical complexity of orthotopic lung transplantation in small mammals.
