Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, menschliche Stammzellkolonien auf schnelle und effiziente Weise zu isolieren. Dies wird erreicht, indem menschliche embryonale Zellen auf einer dichten Schicht von murinen embryonalen Fibroblasten kultiviert werden. Mit der Zeit führt die Expansion der Stammzellpopulation zu einer Zunahme der Anzahl menschlicher Stammzellen, ermöglicht es diesen aber auch, in der MEF-Schicht kolonieartige Inseln zu bilden.

Anschließend wird die Meth-Schicht durch Aspiration entfernt, wodurch die einzelnen Kolonien menschlicher embryonaler Stammzellen zurückbleiben. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung für Stammzellmarker zeigen, dass dies eine wirksame Isolationsmethode zur Beseitigung von Fütterungszellen und zur Aufrechterhaltung der Kolonieintegrität ist. Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals während der Co-Kultivierung von Zellen in unserem Labor, als ich die Stammzellkulturen vor überkonfluenten Kultursystemen retten wollte.

Das Hauptproblem, das die meisten Personen bei der Anwendung dieses Systems aufgrund mangelnder Erfahrung mit der Kultur menschlicher Stammzellen haben werden, betrifft die Handhabung. Wir haben diese Technik als besonders nützlich empfunden, wenn große Mengen menschlicher embryonaler Stammzellen für Experimente isoliert werden müssen. Im Vergleich zu anderen Methoden wie der Sortierung oder dem manuellen Auswählen von Stammzellkolonien ist diese Methode schneller und effizienter, um Kolonien aus hochdichten Kulturen zu isolieren.

Die embryonalen Fibroblasten der Maus sollten vor der Koinkubation mit embryonalen Stammzellen mit Mitomycin C behandelt oder bestrahlt werden, um eine Zellteilung zu verhindern. Zwei Stunden vor der Aussaat der meph beschichten Sie jede 60-Millimeter-Kulturschale mit plasmaaktivierter Oberfläche mit zwei Milliliter 0,05 % Gelatine. Tauchen Sie eine Charge behandelte Mes auf, zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 1.500 U/min und säen Sie aus. Säen Sie eine Dichte von etwa 20.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf die mit Gelatine beschichtete Schale aus und inkubieren Sie die Kultur über Nacht, um eine Ansiedlung der adhärenten Zellen zu ermöglichen. Neue Kulturen können aus kryokonservierten Zellen initiiert oder durch Übertragung bestehender Kulturen auf mit Gelatine beschichtete Schalen angelegt werden. Wenn Sie mit einer Platte beginnen, die große Kolonien menschlicher embryonaler Stammzellen enthält, waschen Sie diese einmal mit drei Milliliter vorgewärmter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus.

Geben Sie drei Milliliter einer Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase vier hinzu und inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Die Zellen werden sich nicht abgrenzen oder zu Kügelchen zusammenziehen, wie Sie es bei Trypsin beobachten. Erstellen Sie mit der Kante einer fünf-Milliliter-Pipettenspitze ein Rastermuster auf den Kolonien und zerkleinern Sie diese in kleine Zellklumpen.

Halten Sie nun das Ende der Pipettenspitze im rechten Winkel zur Kulturplatte, kratzen Sie den Boden der Kulturplatte ab und lösen Sie alle Zellen von der Oberfläche. Überführen Sie die Zellen in ein Falcon-Gefäß, um die Zellen bei 1000 U/min fünf Minuten lang zu zentrifugieren, und entfernen Sie anschließend das Medium durch Absaugen. Danach saugen Sie das Medium von den am Vortag gepflanzten embryonalen Mausfibroblasten ab.

Ansäen Sie dann die humanen embryonalen Stammzellen im Verhältnis eins zu drei ausgehend von der ursprünglichen Platte und versorgen Sie sie mit drei Milliliter Medium für humane embryonale Stammzellen. Die humanen HECS werden bei hoher Dichte über einen Zeitraum von 10 bis 14 Tagen kultiviert. Plazieren Sie die Spitze einer Aspirationspipette am Rand der Platte und ziehen Sie vorsichtig mit Hilfe von Saugkraft den Rand des Meth-Blattes nach oben.

Entfernen Sie das Medium von der Schale. Lassen Sie die Pipettenspitze die Zellschicht erfassen und bewegen Sie die Spitze dann langsam in einem Bogen über die Platte. Wenn die Schicht die Pipette häufig verstopft, entfernen Sie die Schicht aus der Kultur.

Tippen Sie mit einem Aspirator auf die Oberseite der Kulturschale, um die Zellen vollständig zu lösen, und entfernen Sie die Zellen durch vollständige Aspiration. Ersetzen Sie das humane embryonale Stammzellmedium unverzüglich und kehren Sie die Kultur nach der Aussaat in die Kulturschalen in einen Zellkultur-Inkubator zurück. Dieses Co-Kultursystem führt zu dichten Kolonien humaner embryonaler Stammzellen, die von embryonalen Mausfibroblasten umgeben sind.

Die Aspirationstechnik entfernt die MES und erzeugt kleine, ungestörte Kolonien menschlicher embryonaler Stammzellen. Mit nur wenigen MES um die intakte Kolonie herum können sich die Kolonien aus embryonalen Stammzellen erheblich zu sehr großen Kolonien ausdehnen. Beispielsweise dehnte sich diese gezeigte Kolonie menschlicher embryonaler Stammzellen unmittelbar nach der Meth-Entfernung zu einer sehr großen Kolonie aus, wobei die immunfluoreszenzbasierte Identifizierung von Kolonien bis zu 10 Tage nach der Meth möglich war.

Die Ausschöpfung zeigt, dass Kolonien ihre Expression von Pluripotenzmarkern beibehalten und keine Differenzierung in Richtung mesodermaler Schicksale aufweisen. Diese Auflichtbilder zeigen die Morphologie immunfluoreszenzmarkierter Kolonien bei unterschiedlichen Vergrößerungen. DAPI färbt die Kerne der Zellen an.

Wichtig ist, dass die humanen embryonalen Stammzellen die humanen Stammzellmarker SSEA-4, TRA-1-60 und TRA-1-81 exprimieren. Beachten Sie, dass die Bilder eine Kolonie mit typischen glatten Rändern zeigen. Sie exprimieren nicht FLK-1, einen frühen Marker der Mesodifferenzierung, und enthalten keine Fibroblasten, wie durch das Fehlen von DDR2-Färbung gezeigt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie menschliche Stammzellkolonien unter Verwendung von Kultivierungstechniken zur Beeinflussung natürlicher Umgebungen isoliert werden können. Nachdem Sie dies beherrschen, kann dies innerhalb von Sekunden durchgeführt werden. Vergessen Sie außerdem nicht, dass Ihre Kulturen beim Entfernen des Mediums und der Schmutzschichten nicht austrocknen dürfen.