Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die räumlichen und zeitlichen zellulären Dynamiken zu identifizieren, die an der Angiogenese beteiligt sind, definiert als das Wachstum neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden. Unter Verwendung eines einfachen, reproduzierbaren Modells wird zunächst die Angiogenese durch kurze Exterieurisierung des Rattenmesenteriums stimuliert und mesenteriale Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation gewonnen. Anschließend werden Gewebeschnitte immunhistochemisch markiert.

Verwenden Sie beispielsweise einen endothelialen Zellmarker, um das gesamte umgestaltete Gefäßsystem innerhalb eines Gewebes sichtbar zu machen und eine wesentliche zweidimensionale Darstellung wachsender mikrovaskulärer Netzwerke zu erstellen. Dieses Modell ist attraktiv, da es innerhalb eines vergleichsweise kurzen Zeitraums eine deutliche Zunahme mehrerer angiogener Parameter zusammen genommen bewirkt. Die Visualisierung von Netzwerken auf Einzelzellebene und die Korrelation dieser Parameter mit multizellulärer Markierung haben sich als äußerst nützlich erwiesen, um neuartige Zellphänotypen, die mit Kapillarauswüchsen verbunden sind, zu identifizieren.

Diese Methode könnte helfen, zentrale Fragen bezüglich der zellulären Dynamik im Zusammenhang mit dem Wachstum mikrovaskulärer Netzwerke zu beantworten. Dazu gehören der Zeitpunkt und die Lokalisation, an denen bestimmte Zellen während des Kapillar-Auswuchserprozesses vorhanden sind. Die Hauptvorteile dieser Methode liegen in ihrer Einfachheit, der geringen chirurgischen Intervention und der Erzeugung einer robusten angiogenetischen Reaktion über einen relativ kurzen Zeitraum.

Außerdem nutzt es das Rap-Mesenterium, ein Gewebe, das die Beobachtung eines intakten Netzwerks bis auf die einzelne Zelle ermöglicht. Nach unserer Erfahrung ist es sehr leicht zu erlernen und folglich von einem Forscher zum anderen reproduzierbar, wie die Demonstration des Verfahrens zeigt. Heute wird Peter Stapler, ein Doktorand in unserem Labor, die Vorbereitung auf den chirurgischen Eingriff gemäß dem begleitenden Text durchführen.

Nachdem der Bauchbereich der Ratte rasiert wurde, positionieren Sie die anesthetisierte Ratte auf dem Rücken auf einer Heizplatte, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Reinigen Sie den Bauchbereich abwechselnd mit sterilen GREs, die in 70% Isopropanol und Jod getränkt sind. Führen Sie etwa einen Zoll unterhalb des Brustbeins einen kleinen Längsschnitt entlang der Haut und dann durch die Linea alba durch. Legen Sie die vorgeschnittene Abdeckung über den Bauchbereich, sodass die Öffnung mit dem Schnitt übereinstimmt. Üben Sie vorsichtig Druck um den Schnitt herum aus, um den Dünndarm freizulegen. Ziehen Sie mit Wattestäbchen vorsichtig einen Abschnitt des Dünndarms heraus, legen Sie das Mesenterium auf die Kunststoffhalterung, die sterile Kochsalzlösung enthält, und lokalisieren Sie das Ileum.

Identifizieren Sie sechs bis acht vascularisierte mesenteriale Fenster, die dünne, durchscheinende Membran zwischen den Arterien- und Venenpaaren, die den Dünndarm versorgen. Notieren Sie die Startzeit der Exposition und stellen Sie einen Timer auf 20 Minuten. Markieren Sie die beiden mittig gelegenen mesenterialen Fenster mit steriler 7-0-Naht im Fettgewebe nahe dem Darm.

Ersetzen Sie die Salzlösung in der Petrischale intermittierend unter Verwendung einer sterilen Fünf-Milliliter-Spritze, um sicherzustellen, dass das Gewebe weiterhin eingetaucht und feucht bleibt. Nach Ablauf der ausgeschalteten Zeitdauer wird das Mesenterium in die Bauchhöhle zurückverlegt. Schließen Sie den Bauchmuskel mit einer Fünf-Null-Monofilnaht in unterbrochener Technik.

Danach die Haut mit vier Einzelknopfnähten aus monofiler Nahtmaterial der Stärke Null verschließen, den Nahtbereich mit steriler Gaze, die in 70 % Isopropanol getränkt ist, abwechselnd mit Alkohol und Jod abwischen, Augenschmiergel auf beide Augen der Ratte auftragen und das Tier in seinen Käfig zur Erholung zurückbringen. Am gewünschten Tag nach der Stimulation die Ratte gemäß den institutionellen Richtlinien anästhesieren und euthanasieren. Anschließend die Bauchhöhle erneut öffnen und den Bauchbereich mit einer Folie abdecken. Nun vorsichtig den Dünndarm herausziehen und die beiden markierten Fenster mit Pinzette und Mikroschere lokalisieren.

Schneiden Sie jedes der ausgestülpten mesenterischen Fenster aus, wobei ein Rand aus Fettgewebe mit einbezogen werden sollte. Vermeiden Sie es, Arterien- und Venenpaare innerhalb des fetten Randes der Fenster zu durchtrennen, um eine mögliche Blutansammlung in den Fenstern zu minimieren. Minimieren Sie außerdem das Durchtrennen des Darms, das zu Darminhalt führen kann.

Die Fenster sofort nach dem Kontakt in PBS eintauchen. Anschließend mit einer Pinzette die Gewebe auf einer positiv geladenen Mikroskopobjektträgerplatte ausbreiten. Pro Objektträger zwei Gewebe präparieren. Nachdem die Gewebe teilweise getrocknet sind, überschüssiges Fett mit einer Skalpellklinge entfernen.

Fixieren Sie die Proben 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius in Methanol, indem Sie sie in den Gefrierschrank stellen. Trocknen Sie die Objektträger im Vakuum, um überschüssige Pufferlösung zu entfernen. Umreißen Sie außerdem das Gewebe mit einem Wachsstift, um eine unkontrollierte Ausbreitung der Antikörperlösungen außerhalb des Gewebes zu verhindern.

Geben Sie nun etwa 200 Mikroliter der verdünnten Primärantikörperlösung tropfenweise auf, sodass das gesamte Gewebe bedeckt ist. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur und waschen Sie das Gewebe mit PBS plus 0,1 % Sapin in drei Pufferwechseln. Fügen Sie anschließend die Strep-Adin-Peroxidase-Sekundärantikörperlösung hinzu und inkubieren Sie nach drei Waschungen eine Stunde bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Proben danach 15 Minuten in Vector Nova Red.

Mit Wasser spülen, um Objektträger zu montieren. 10-mal in 95 % Ethanol eintauchen, gefolgt von sukzessiven Dehydrierungsschritten. Objektträger trocknen lassen, Gewebe mit einer dünnen Schicht bedecken, Menge und Position der Deckgläser nach dem Vakuumtrocknen und Markieren anpassen.

Die Objektträger. Bedecken Sie die Gewebeproben mit verdünnter Primärantikörperlösung. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur.

Dreimal mit PBS mit 0,1 % Saponin je 10 Minuten waschen. Anschließend den sekundären Antikörper hinzufügen und eine Stunde inkubieren. Die Waschschritte in PBS mit 0,1 % Saponin durchführen, die Objektträger in PBS mit Glycerin eindeckeln und mit Nagellack versiegeln.

Hier beschreiben wir die Modifikation einer üblichen Petrischale zur Verwendung als Operationsplattform. Gelber Modellierknet wurde verwendet, um eine glatte Oberfläche zu schaffen, durch die das Mesenterium hindurchgezogen werden kann, und zwar durch die vorgeschnittene Öffnung. Nochmals: Die hier während der Ausschleusungsphase in der Plattform gezeigten mesenterischen Fenster werden definiert als die dünnen, durchscheinenden Membranen zwischen den Arterien- und Venenpaaren, die den Darm in diesem Bereich versorgen.

Die PCAM-Markierung identifiziert alle Gefäßtypen entlang der Hierarchie von umgestalteten mikrovaskulären Netzwerken zu bestimmten Zeitpunkten nach der Externalisierung. Diese Bilder können verwendet werden, um angiogenetische Parameter zu bestimmten Zeitpunkten zu quantifizieren. Nach der Stimulation.

Die PCAM-Markierung ermöglicht die Unterscheidung von Arterien und Venen. Beachten Sie, dass die versorgenden Arterien typischerweise einen kleineren Durchmesser und eine längliche Endothelzellmorphologie im Vergleich zu den zugehörigen Venen aufweisen. Typische Merkmale von umgebildeten Netzwerken sind der vascularisierte Bereich, das Auswachsen von Kapillaren und die Gefäßdichte.

Die Quantifizierung dieser verschiedenen angiogenen Parameter beschreibt den zeitlichen Verlauf des Netzwerkwachstums. Die Kapillar-Auswucherung aus bereits bestehenden Gefäßen erreicht zwischen Tag drei und Tag fünf ein Maximum und kehrt bis zum Tag 10 auf das Niveau der unbehandelten Kontrolle zurück. Dieser vorübergehende Anstieg der Auswucherung wird in unserem Labor durch Zunahmen der vascularisierten Fläche und der Gefäßdichte gefolgt.

Dieses Modellsystem wurde verwendet, um neuartige zelluläre phänotypische Veränderungen zu bestimmten Zeitpunkten während dieses Umbauprozesses zu identifizieren. Die immunfluoreszenzmarkierte PCA-Färbung färbt Endothelzellen rot, während die Markierung von Klasse-drei-Beta-Tubulin Nerven und Parasiten entlang angiogener Gefäße grün anfärbt. Interessanterweise ist die Expression von Klasse-drei-Beta-Tubulin in nicht stimuliertem Gewebe auf Nerven beschränkt.

Im Gegensatz dazu wird Klasse-drei-Beta-Tubulin während des Höhepunkts der Kapillar-Aussprossung von perivaskulären Zellen exprimiert. Diese Art von Ergebnis unterstreicht die Eignung dieses einfachen und robusten angiogenen Modells zur Identifizierung neuartiger Zelltypen, die am Angiogeneseprozess beteiligt sind. Ab Tag 10 beginnt das Expressionsmuster von Klasse-drei-Beta-Tubulin sich wieder dem Zustand der unbehandelten Kontrolle anzunähern.

Dieses Modell könnte außerdem potenziell für Zelllinien-Studien verwendet werden. Die Machbarkeit der Einbindung von Zellen in umgestaltendes mesenteriales Gewebe wird durch diese vorläufigen Untersuchungen gestützt, bei denen vorgefärbte Knochenmarkzellen oder mesenchymale Stammzellen während des 20-minütigen Expositionszeitraums über mesenteriale Fenster fusioniert wurden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie unser Modell der Mesenterium-Interiorisierung bei der Untersuchung der zellulären Dynamik im Zusammenhang mit dem Wachstum mikrovaskulärer Netzwerke angewendet wird.

Diese einfache Technik kann in etwa 45 Minuten bis einer Stunde durchgeführt werden. Denken Sie daran, dass es entscheidend ist, das Mesenterium vorsichtig zu behandeln und nach einem chirurgischen Eingriff das Durchstechen von Gefäßen zu vermeiden. Mithilfe einer Immunfärbung können mehrere Zelltypen entlang von Blutgefäßen identifiziert werden.

Sie können auch lymphatische Gefäße und Nerven markieren. Dies ermöglicht es uns, nicht nur die zellulären phänotypischen Veränderungen, die an der Angiogenese beteiligt sind, zu untersuchen, sondern auch die Koordination zwischen Angiogenese, Neurogenese und lymphatischer Angiogenese.