Name: Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Erfahren Sie ein reproduzierbares Ratten-Mesenterium-Exteriorisationsmodell zur Stimulation und Analyse der Angiogenese. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung mikrovaskulärer Netzwerke auf Einzelzellebene.

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Und der Tulane Hypertonie und Nieren Center of Excellence von NIH finanziert P20RR017659-08 (PI: Diese Arbeit wurde vom Board of Regents des Staates Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (WL Murfee PI) unterstützt : L. Gabriel Navar).

1. Chirurgisches Vorgehen Set-Up Hinweise <ol><li> Vor der Operation zu sterilisieren chirurgisches Material und Instrumente. Zubehör für das sterilen chirurgischen Verfahren für jede Ratte verwendet werden, umfassen ein Abdecktuch an sich als eine sterile Oberfläche für die Platzierung der Instrumente gelegt werden, einem Tuch, mit einer vorgeschnittenen Öffnung etwa 0,5 x 1,5 in der in der Mitte über der Ratte platziert werden und Gaze. Die vorgeschnittene Loch auf dem Abdecktuch wird mit dem Einschnitt an der Ratte angeglichen. Instrumente für die Operation erforderlich sind 1 Standard-Schere verwendet werden, um Nahtmaterial geschnitten werden, zwei Zangen und einer feinen Nadel Halter für den Umgang mit und Greifen des Fadens, und ein Skalpell mit einer Klinge. Wir haben die gemeinsame Instrumente durch unser Labor in der Tabelle der spezifischen chirurgischen Materialien und Werkzeuge verwendet werden aufgelistet. Allerdings hängt endgültige Auswahl-Werkzeug auf Experimentator Präferenzen. </li><li> Bereiten Sie die Operation Raum. Stellen Sie ein 100 ml 0,9% iger steriler Saline-Tasche unter einem Heizkissen um sicherzustellen, dass die Salzlösung, die in Kontakt kommt wit dem Mesenterium Gewebe wird auf ca. 37 vorgewärmt ° C. Als Alternative zur Saline, können Sie mit Ringer-Lösung oder einen anderen physiologischen Puffer. Legen Sie sterilisierte chirurgische Instrumente und Zubehör auf einem sterilen Tuch für einen einfachen Zugang während des Verfahrens Exteriorisation. Außerdem benötigen Sie sterile Wattestäbchen Applikatoren und die entsprechenden 3 Arten von Nähten (4-0, 5-0 und 7-0). Stellt sicher, dass Pakete sind so voreingestellt, dass die Materialien eröffnet mit sterile Handhabung zugegriffen werden kann. Schließlich desinfizieren zuvor modifizierten Kunststoff Stufe durch Eintauchen in 100% Ethanol für mindestens 5 Minuten. Die Bühne ist eine 100 mm Petrischale mit einem elliptischen Loch in der Mitte (Abbildung 1) zu schneiden. Ein Dremel-Tool kann verwendet werden, um zunächst zu machen und, falls erforderlich, erweitern Sie das Loch werden. Nachdem das Loch gemacht wird, werden die Ränder des Schnittes Kunststoff glatt mit Schleifpapier unterschiedlicher Körnung. Die Bühne wird dann gewaschen und schließlich entweder inert Modelliermasse (gekauft von einem lokalen Handwerks speichern) oder Silicam Klebstoff auf des Lochs Kante hinzugefügt, um einen erhöhten, glatte Oberfläche bereitzustellen. Vor mit dem Gewebe in Kontakt, wird die Stufe müssen ausreichend mit steriler Kochsalzlösung gespült werden. </li><li> Für dieses Modell der Angiogenese, wir verwenden in der Regel erwachsenen männlichen Wistar-Ratten (350 ± 25 g). Andere Rattenstämmen und Altersstufen verwendet werden kann. In unserem Labor sind Ratten betäubt durch intramuskuläre Injektion mit Ketamin (80 mg / kg KG), Xylazin (8 mg / kg KG) und Atropin (0,08 mg / kg KG). Nach ca. 5 Minuten, wird die Wirkung der Anästhesie bestätigt und der Ratte Bauchhaut rasiert wird. </li></ol> 2. Rattengekröse Exteriorisation Modell <ol><li> Positionieren Sie den narkotisierten Ratte auf dem Rücken auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur aufrecht zu erhalten. Aseptische Techniken werden während des chirurgischen Eingriffs verwendet. Trage sterile Handschuhe und erlauben keine Apparaten und Materialien zu nicht-sterilen Oberflächen außer den Rattengeweben kontaktieren. </li><li> Säubern Sie Bauch-Bereich mit wechselnden Tücher USIng die sterile Gaze in 70% igem und Jod getränkt. </li><li> Mit dem Skalpell, einen kleinen (ca. 0,75 Zoll) Längsschnitt entlang der Haut und dann der Linea alba ca. 1 cm unterhalb des Brustbeins. </li><li> Platzieren Sie die vorgeschnittenen Tuch über die abdominale Abschnitt so daß die Öffnung ausgerichtet ist mit dem Einschnitt. </li><li> Durch leichten Druck um den Einschnitt. Dies wird in der Regel in der Exposition des Dünndarms genug, um es leicht identifiziert werden können führen. </li><li> Mit den Wattestäbchen Applikatoren, ziehen Sie vorsichtig einen Abschnitt des Dünndarms und suchen Sie das Ileum. Da das Mesenterium herausgezogen wird, sollte sie vorsichtig gelegt werden, sind im Kunststoff-Stufe (Abbildung 2). </li><li> Identifizieren 6-8 vaskularisierten mesenterialen Fenstern. Ein mesenterica Fenster wird als dünne durchlässige Membran zwischen den Arterien / Venen Paaren Zuführen des Dünndarms (2) definiert. </li><li> Notieren Sie sich die Startzeit der Entäußerung. Verlassen Sie die mesentery Abschnitt exteriorisiert für 20 Minuten. Während der Periode Exteriorisation, verwenden Sie eine sterile Spritze (5 ml), um intermittierend füllet die Saline in der Petrischale, um sicherzustellen, dass das Gewebe eingetaucht bleibt und nicht austrocknet. </li><li> Während der 20-minütigen Einwirkzeit, markieren Sie die zwei zentral gelegenen mesenterialen Fenster mit sterilem Nahtmaterial 7-0. Die Markierungen sollten in dem Fett in der Nähe des Darmes vorgenommen werden. </li><li> Senden Sie das exteriorisierten Region des Mesenteriums in die Bauchhöhle. </li><li> Schließen Sie die Bauchmuskeln mit 5-0 Monofilamentnaht in Muster unterbrochen. </li><li> Schließen Sie die Haut mit 4-0 Monofilamentnaht in Muster unterbrochen. </li><li> Wischen Sie die Fläche mit wechselnden vernäht Tücher über die sterile Gaze in 70% isopropoyl und Jod getränkt. </li><li> Verbreiten Augensalbe Gel auf beiden Augen der Ratte. Der Zweck der Schmierung des Auges ist, um ein Austrocknen der Hornhaut während des chirurgischen Eingriffs und Wiederherstellung zu verhindern. Die Anwendung von Schmiermittel Auge angewendet werden solltevor Beginn des chirurgischen Eingriffs. Falls nötig, tragen Sie Auge Schmiermittel vor Rückgabe der Ratte in den Käfig für die Verwertung. </li></ol> 3. Tissue Ernte und Fixierung <ol><li> Am Tag der Zinsen nach Stimulation, betäuben und einschläfern die Ratte. In unserem Labor sind Ratten über eine intramuskuläre Injektion mit Ketamin (80 mg / kg KG), Xylazin (8 mg / kg KG) und Atropin (0,8 mg / kg KG) und dann über intrakardiale Injektion von beuthanasia eingeschläfert betäubt. Beuthanasia ist ein Pentobarbital-Natrium / Phenytoin Lösung, die für eine schnelle und schmerzlos Euthanasie verwendet werden können. Pro Ratte unserem Labor üblicherweise injiziert 0,1 bis 0,2 ml. </li><li> Öffnen Sie erneut die Bauchhöhle und entfernen Sie vorsichtig den Dünndarm, und suchen Sie die beiden markierten Fenstern. </li><li> Schneiden Sie jede der exteriorisierten mesenterialen Fenster mit einer Pinzette und Mikro-Schere. Einschließlich einer Grenze von Fett pro Fenster ist von Vorteil für die spätere Verbreitung Gewebe auf Objektträger. SofortTauchen Sie jedes Fenster in PBS. Beim Schneiden, versuchen zu vermeiden, Durchschneiden der Arterien / Venen-Paare innerhalb des Fett-Grenze der Fenster, um potenzielle Blutfüllung der Fenster zu minimieren. Außerdem minimieren Schneiden durch den Darm führt, dass Darminhalt die Fenster Kontakt. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um Gewebe auf positiv geladene Objektträger ausgebreitet. Zwei Gewebe können pro Folie montiert werden. </li><li> Lassen Sie das Gewebe teilweise zu trocknen und mit einem Skalpell entfernen Sie das überschüssige Fett. </li><li> Die Gewebe sind nun bereit, fixiert werden. Typische Befestigungsmethoden verwendet werden. In unserem Labor haben wir häufig zu fixieren Sie die Folien in Methanol (-20 ° C) für 30 min. Erfolgreiche Kennzeichnung hat auch mit nicht fixierten Gewebe durchgeführt. Fixation Methoden könnten auf Ihre bevorzugte Antikörper abhängen. </li></ol> 4. Tissue Immunmarkierung <ol><li> Die Gewebe können in der Regel nun entsprechend den Anweisungen pro Antikörper für die Immunhistochemie gekennzeichnet werden. Da unser Interesse an der Identifizierung der Rollenvaskulärer Perizyten während der Angiogenese, unserem Labor üblicherweise markiert für Endothelzellen und perivaskuläre Zellen 10, 12, 13. Nützliche Markierungen an Endothelzellen entlang der Hierarchie der mikrovaskulären Netzwerken zu identifizieren sind ein anti-PECAM-Antikörper oder BSI-Lektin. Perivaskuläre Zellmarker in diesem Gewebe verwendet werden, umfassen NG2, Desmin, SM-α-Actin, PDFGRβ und Klasse III β-Tubulin. Unten, in Abschnitt 3.3 haben wir Protokolle zur colorimetrischen und fluoreszenten PECAM Immunomarkierung Protokolle aufgelistet. </li><li> Vor der ersten primären Antikörper Inkubation sind Dias Vakuum getrocknet, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Auch werden die Gewebe zunächst mit einem Wachsschreiber erläutert, um unkontrollierten Antikörperlösungen vom Gewebe zu verhindern. Schließlich werden alle Schritte Kennzeichnung von Wasch-Schritte folgen. Für Waschschritte werden gleitet im Inneren Färbeschalen platziert. Die Pufferlösung wird 3-mal während des Waschvorgangs Dauer ausgetauscht. </li><li> Endothelzellen Antikörpermarkierung Verfahren: &lt;p class = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM Kolorimetrische Lableing <ol><li> Inkubationszeit des primären Antikörpers: Drip ca. 100-200 ml primären Antikörper-Lösung (1:200 biotinylierten monoklonalen Maus-Antikörper CD31-Antikörper in Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite, um jedes Gewebe, stellen Sie sicher, das ganze Gewebe ist überzogen mit Antikörper-Lösung. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. </li><li> Sekundäre Antikörper-Inkubation: Drip sekundären Antikörper-Lösung (Vectastain Elite ABC-Lösung von Vector Laboratories, ein Streptavidin-Peroxidase sekundären Antikörper-Lösung) auf der Oberseite des Gewebes. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. </li><li> Inkubieren Gewebe mit Vector Red Nova für 15 Minuten. Dann steigen Gewebe mit Wasser. </li><li> Berg Dias: Dip Slides in 95% Ethanol 10 mal. Objektträger in 100% Ethanol für 2 Minuten. Objektträger in einem anderen 100% Ethanol sosung für 2 Minuten. Dann Objektträger in aufeinander folgenden 100% Xylol-Lösungen für jeweils 2 Minuten. Trocknen lassen und decken Gewebe mit einer dünnen Schicht aus VectaMount und einem Deckglas. </li></ol> PECAM Fluorescent Labeling <ol><li> Inkubationszeit des primären Antikörpers: Drip ca. 100-200 ml primären Antikörper-Lösung (1:200 biotinylierten monoklonalen Maus-Antikörper CD31-Antikörper in Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite, um jedes Gewebe, stellen Sie sicher, das ganze Gewebe ist überzogen mit Antikörper-Lösung. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. </li><li> Sekundäre Antikörper-Inkubation. Drip sekundären Antikörper-Lösung ((1:100 Streptavidin-CY3 in Antikörper-Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite des Gewebes bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. </li><li> Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. </li><li> Berg Dias: Drip 50:50 PBS mit Glycerin auf der Oberseite des Gewebes. Deckenmit Deckglas. Dann verwenden Nagellack, die Lücke zwischen Deckglas und Objektträger zu versiegeln. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Bilder Rattengekröse Gewebe immunhistochemisch für PECAM beschriftet sind in Abbildung 3 dargestellt. PECAM Kennzeichnung identifiziert alle Schiffstypen entlang der Hierarchie der Umbau mikrovaskuläre Netzwerke und können verwendet werden, um angiogenen Metriken zu bestimmten Zeitpunkten nach Stimulation zu quantifizieren. PECAM Kennzeichnung ermöglicht auch die Bestimmung von Arteriolen gegenüber Venolen. Zuführen Arteriolen typischerweise kleinere Durchmesser und länglichen Endothelzell-Morphologie im Vergleich zu paarenden Venolen (Abbildung 4). Kapillaren und Kapillare Sprossen können auf Basis ihrer Gefäßdurchmesser und die relative Position in einem Netzwerk identifiziert werden. Typische Merkmale der Umbau Netzwerke sind eine erhöhte Kapillar sprießen, Gefäßdichte, vaskularisierten Bereich und venulären tortuosITY. Quantifizierung verschiedener Metriken angiogenen identifiziert den zeitlichen Verlauf der das Wachstum des Netzwerks (5). Kapillar sprießen aus bereits bestehenden Gefäßen, Spitzen zwischen Tag 3 und Tag 5 und kehrt in den unstimulierten Niveau von Tag 10. Diese vorübergehenden Anstieg der Keimung wird durch Erhöhung der Gefäßdichte und vaskularisierten Bereich folgten. Als Beweis für die Neugestaltung von größeren Schiffen in diesem Modell ist die Zahl der Arteriolen und Venen Segmenten erhöht sich auch über den Zeitverlauf. In unserem Labor ist dieses Modell verwendet, um zelluläre phänotypische Veränderungen bei bestimmten Zeitpunkt während dieser Umbauprozess 10, 11 zu identifizieren. Zum Beispiel identifiziert Klasse III β-Tubulin-Perizyten entlang angiogenetischen Gefäßen (Abbildung 6). In nicht stimulierten Geweben, ist der Klasse III β-Tubulin-Expression spezifischer Nerven. Im Gegensatz dazu auf dem Höhepunkt der Kapillare sprießen, wird der Klasse III β-Tubulin durch perivaskuläre Zellen exprimiert. Diese Artvon Ergebnis unterstreicht die Verwendung dieser einfachen und robusten angiogenen Modell, um neue Zelltypen im angiogenen Prozess beteiligt sind. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bilder des Kunststoff-Bühne Pre-und Post-Modifikation. Die zuvor modifizierten Stufe ist ein 100 mm Petrischale. Modifikationen umfassen einen elliptischen Schnitt Loch in der Mitte und die anschließende Zugabe von Knetmasse oder Silikonkleber auf das Loch der Rand für die Schaffung einer erhöhten, glatte Oberfläche. Diese Oberfläche bietet eine innere Grenze, die Superfusion der exteriorisierten mesenterialen Fenstern erleichtert. Maßstabsbalken ist 1 cm. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> Abbildung 2. Das Bild von exteriorisierten mesenterialen Region. Mesenteriale Fenster sind wie die dünne lichtdurchlässige Membranen zwischen den Arterien / Venen-Paare Fütterung der Dünndarm definiert. Während der ExteriorisationDauer ist die mesenterialen Bereich angelegt und in Kochsalzlösung eingetaucht in einem modifizierten Petrischale. Inerten gelben Modelliermasse bietet eine glatte Oberfläche für das Mesenterium, um durch die vorgestanzten Löcher gezogen werden. Maßstabsbalken ist 1 cm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Bilder mesenterialen mikrovaskuläre Netzwerke von nicht stimulierten Gewebe und Gewebe bei 3 und 10 Tage nach der Entäußerung des Mesenteriums. PECAM Kennzeichnung identifiziert die Hierarchie der mikrovaskulären Netzwerken, einschließlich, Arteriolen (A), Venolen (V) und Kapillaren (C). Beitrag Stimulation, erscheint mikrovaskulären Netzwerken eine Zunahme der Kapillare sprießen (Pfeilspitzen) und Gefäßdichte. Maßstabsbalken ist 100 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Bilder Arteriole / Venole Paare innerhalb erwachsenen Ratte mesenterialen mikrovaskulären Netzwerks. In beiden Abbildungen können Arteriolen (A) von Venolen (V) basierend auf einem kleineren Durchmesser und relativ länglichen Endothelzell-Morphologie unterschieden werden. Scale-Bars sind 20 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> Abbildung 5. Vertreter Quantifizierung der Angiogenese-Metriken über den zeitlichen Verlauf der mikrovaskulären Wachstum Beitrag Mesenterium Exteriorisation. A) Vascular Fläche pro Gewebebereich. B) Zahl der kapillaren Sprossen pro vaskulären Bereich. C) Gesamt vaskulären Länge pro vaskulären Bereich. * Steht für signifikanten Unterschied im Vergleich zu nicht stimulierten Gruppe. Statistische Vergleiche wurden mit einem One-Way ANOVA durch Dunn-Test gefolgt. (P &lt;0,05). UN stellt unstimulierten. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> Abbildung 6. Vertreter fluoreszierende Bilder von mesenterialen mikrovaskuläre Netzwerke von nicht stimulierten Gewebe und Gewebe bei 3 und 10Tag posten Exteriorisation des Mesenteriums. Immunfluoreszenz PECAM Kennzeichnung (rot) identifiziert Endothelzellen und Klasse III β-Tubulin-Kennzeichnung (grün) identifiziert Nerven (Pfeilspitzen) und perivaskulären Zellen (Pfeile). Perivaskulären Zellen transient hochreguliert Klasse III β-Tubulin während Kapillare sprießen. In unstimulierten mikrovaskulären Netzwerken ist Klasse III β-Tubulin-spezifischen Nerv und keine perivaskulären Zellen zu identifizieren. 3 Tage nach der Stimulation, Klasse III β-Tubulin-positiv markiert perivaskulären Zellen entlang Mikrogefäße. Am Tag 10, beginnt der Klasse III β-Tubulin-Expression auf den unstimulierten Szenario zurückkehren. Scale-Bar ist 50 um. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> Abbildung 7. Bilder unterstützen die Machbarkeit der Tracking voretikettiert lokal applizierten Zellen während der mikrovaskulären Netzwerk Wachstum durch das Mesenterium Exteriorisation stimuliert. Die Zellen wurden über Mesenter superfundiertIC-Fenster während des 20-minütigen Zeitraum Exteriorisation. 1 Tag nach der Operation, DiI-markierten Zellen (rot) in der Brennebene Dame mit PECAM positiven Mikrogefäße (grün) beobachtet. A, B) Beispiele für DiI markiertem Knochenmarkszellen aufweist gerundet und Morphologien verlängert. In einigen Fällen (Pfeile)-Zellen wurden zusammen Mikrogefäße verlängert. C) Beispiel eines Clusters von DiI markiertem mesenchymalen Stammzellen in der Nähe der Spitze einer Kapillare sprießen (Pfeil). Scale-Bars sind 50 um (A), und 20 um (B, C).

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Exteriorisation Modell wurde im Jahr 2006 gemeldet und wird von früheren mechanischen Verletzung Rattengekröse Modellen der Angiogenese 7.4 angepasst und führt zu ähnlichen Ergebnissen zu etablierten ip Injektion Modelle, die Nutzen aus der Rattengekröse 9. Die 20 Minuten Exteriorisation Zeit wurde experimentell bestimmt, um eine robuste angiogene Reaktion zu erzeugen. Während dieses Zeitraums konnte variiert werden, gestattet aber die für die lokale Anwendung von angiogenen Inhibitoren 4 für mechanistische Studien und direkte Anwendung von exogenen Zellen für die Zelllinie Studien. Machbarkeit der Zelle Einbau in Umbau mesenterialen Gewebe wird durch Voruntersuchungen in unserem Labor mit voretikettiert Knochenmarkszellen und mesenchymalen Stammzellen (Abbildung 7), und durch den Erfolg der Untersuchung des Schicksals der menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen Injektion IP 14 unterstützt . In unserem Labor haben wir dieses Modell verwendet, um Perizyten phen identifizierenotypic Veränderungen über den Zeitverlauf der angiogene Antwort 10 und die angiogene Potential bei pathologischen Bedingungen, wie Bluthochdruck 12 zu bewerten. Die angiogene Reaktion und Zell-Phänotyp bei diesem Modell Veränderungen verbunden sind, können auch in anderen Ratte mesenterica angiogenen Modelle einschließlich chronischer Hypoxie Exposition 10, 11 beobachtet werden. Eine Begrenzung der Exteriorisation Modells ist, dass die genauen Mechanismen der Angiogenese auszulösen unbekannt sind. Veräußerlichung des Mesenteriums hat Mastzelldegranulation und erhöhte Histamin-Spiegel 6 in Verbindung gebracht worden, dennoch sind weitere Untersuchungen nötig, um mehr Einblick zu gewinnen. Die angiogenen Stimulus ist zweifellos multifaktorielle und produziert einen robusten Umbau Reaktion über die Hierarchie eines mikrovaskulären Netzwerk. Während die unbekannte Mechanismen eine große Kritik an diesem Modell zu bleiben, machen ihre Reproduzierbarkeit und Einfachheit sie attraktiv für die Identifizierung von zellulären Dynamik INVOLved in der Natur aus komplex Kapillare Keimenprozeß. Die Reproduzierbarkeit des Modells wird durch angiogenen vergleichbar Metriken über den zeitlichen Verlauf der mikrovaskulären Netzwerk Wachstum über mehrere Rattenstämmen (männliche Wistar und weiblichen Sprague-Dawley) in zuvor veröffentlichten Studien aus unserem Labor 10, 12 unterstützt. Da die Mehrheit der erwachsenen Ratte mesenterica Gewebe vaskularisiert sind, erlaubt das Modell auch für mehrere Gewebe für jedes Tier untersucht werden. Leider ist dieses Modell nicht für offensichtlich genetische Mausmodelle als Maus mesenterialen Fenster weniger nativen Vaskularisierung haben und nach unserer Erfahrung, häufig fehlt es beobachtbar Verzweigung Netzwerke. Zukünftige Anwendungen umfassen die Untersuchung von Schiff-Funktionalität während der Angiogenese mit intra-vital-Mikroskopie zu bestimmten Zeitpunkten und die Untersuchung der damit verbundenen zellulären Dynamik in Lymphangiogenese und Neurogenese beteiligt. Obwohl das Ausmaß der nativen Vaskularisierung pro mesenterialen Fenster scheint rou seinHinzu kommen rd proportional mit dem Alter haben wir beobachtet, Verzweigung mikrovaskulärer Netzwerke in männlichen Wistar-Ratten im Alter von 4-5 Wochen alt. Diese Beobachtungen legen nahe, dass das Modell auch konnte Exteriorisation angewandt, um die Unterschiede zwischen den Altersgruppen angiogenen zu vergleichen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Zusätzliche Kommentare </td></tr><tr><td> Drapieren </td><td> Cardinal Health </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot; Bio-Shield Regelmäßige Sterilisationstücher </td></tr><tr><td> Noyes Micro Scissor </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes Micro Dissecting Frühling Schere; Gerade, spitz-stumpfen Spitzen; 13mm Cutting Edge; 0,25 mm Strichstärke, 4 1/2 &quot;Gesamtlänge </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-5135 </td><td> Micro Dissektionszangen; Serrated; leichten Kurve, 0,8 mm Strichstärke; 4 &quot;Länge </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-5130 </td><td> Micro Dissektionszangen, gezahnt, gerade, 0,8 mm Strichstärke; 4 &quot;Länge </td></tr&gt; <tr><td> 4-0 Naht </td><td> ETHICON </td><td> 699g </td><td> (1,5 metric) Ethilon Nylonnaht Schwarz Monofilament </td></tr><tr><td> 5-0 Naht </td><td> ETHICON </td><td> 8556 </td><td> (1,0 metric) PROLENE Polyprolene Suture Blau Monofilament </td></tr><tr><td> 7-0 Naht </td><td> ETHICON </td><td> 1647G </td><td> (0,5 metric) Ethilon Nylonnaht Schwarz Monofilament </td></tr><tr><td> Castroviejo Micro Nadelhalter </td><td> Fine Science Tools </td><td> 12060-02 </td><td> Tipp Breite: 0,6 mm Einspannlänge: 5mm Länge: 9cm Gerade Spitze </td></tr><tr><td> Castroviejo Nadelhalter </td><td> Fine Science Tools </td><td> 12565-14 </td><td> Tipp Form: Gerade Tipp Breite: 1.5mm Einspannlänge: 10mm Schere: Keine Anschluss: Ja Länge: 14cm Serrated: Ja </td></tr><tr><td> Skalpellgriff </td><td> Roboz für chirurgische Instrumente </td><td> RS-9843 </td><td> Skalpellgriff, # 3, Massive, 4 &quot;Länge </td></tr><tr><td> Sterile chirurgische Klinge </td><td> Cincinnati Surgical </td><td> 0110 </td><td> Edelstahl, Größe 10 </td></tr><tr><td> Petrischale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td> Abgeschrägte Ridge, rutschfähigen </td></tr></tbody></table> Tabelle der spezifischen chirurgischen Materialien und Werkzeugen. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Zusätzliche Kommentare </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering-Plough Animal Health Corp Union (bestellt MWI Veterinary Supply) </td><td> MWI #: 011.168 </td><td> Wirkstoff: pro 100ml, 390 mg Pentobarbital-Natrium, 50mg Phenytoinnatrium </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Fort Dodge Animal Health (bestellt MWI Veterinary Supply) </td><td> MWI #: 000.680 </td><td> Kateset 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> LLOYD. Inc. (Bestellt MWI Veterinary Supply) </td><td> MWI #: 009.307 </td><td> Anased 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Saline </td><td> Hospira Inc. </td><td> 94 bis 217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td> Vectastain Elite ABC </td><td> Vector Laboratories </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Vector Red Nova </td><td> Vector Laboratories </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle der spezifischen Reagenzien

rattengekröse exteriorisation: ein modell für die untersuchung der zelluläre dynamik an der angiogenese beteiligt

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular Netzwerk Wachstum und Umbau sind kritische Aspekte der Wundheilung, Entzündung, diabetische Retinopathie, Tumorwachstum und anderen Krankheitszuständen 1, 2. Netzwerk-Wachstum wird im Allgemeinen Angiogenese, wie das Wachstum neuer Gefäße aus bereits bestehenden Gefäßen definiert zugeschrieben. Die angiogenen Prozess wird auch direkt an Arteriogenese verbunden, definiert als der Kapillare Erwerb einer perivaskuläre Zelle Beschichtung und Behälter Erweiterung. Unnötig zu sagen, ist die Angiogenese komplex und beinhaltet viele Spieler auf zellulärer und molekularer Ebene 3. Zu verstehen, wie ein mikrovaskulären Netzwerk wächst erfordert die Ermittlung der räumlichen und zeitlichen Dynamik entlang der Hierarchie eines Netzwerks über den zeitlichen Verlauf der Angiogenese. Diese Informationen sind kritisch für die Entwicklung von Therapien zu manipulieren Schiff Wachstum ausgerichtet. Die Exteriorisation Modell in diesem Artikel beschrieben stellt ein einfaches, reproduzierbares Modell für stimuliertLating Angiogenese im Rattengekröse. Es wurde von Wundheilung Modelle der Rattengekröse 4-7 ausgebildet, und ist eine Alternative, um die Angiogenese im Mesenterium über ip Injektionen von pro-angiogenen Mittel 8, 9 zu stimulieren. Die Exteriorisation Modell ist attraktiv, weil es eine minimale chirurgische Eingriffe erfordern und für dramatische, reproduzierbare Erhöhung der Kapillare Sprossen, Gefäßbereich und Gefäßdichte innerhalb eines relativ kurzen zeitlichen Verlauf in einem Gewebe, das für die zweidimensionale Darstellung der gesamten mikrovaskulären Netzwerken ermöglicht bis zu einzelnen Zellebene. Das stimulierte das Wachstum spiegelt natürliche angiogene Antworten in physiologischer Umgebung ohne Störungen von ausländischen angiogenen Molekülen. Mit immunhistochemischen Methoden Kennzeichnung, ist dieses Modell als äußerst hilfreich erwiesen bei der Identifizierung neuer zellulärer Ereignisse an der Angiogenese beteiligt. Forscher können leicht korreliert die angiogenen Metriken während des Zeitverlaufs der Umbau mit der Zeit specific Dynamik, wie zum Beispiel zellulare phänotypischen Veränderungen oder zelluläre Wechselwirkungen 4, 5, 7, 10, 11.

Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Modell für die Stimulierung der Angiogenese im Rattengekröse. Das Modell stellt eine dramatische Steigerung der Kapillare sprießen, vaskulären Bereich und vaskuläre Dichte über einen relativ kurzen Zeit natürlich in einem Gewebe, das en face Visualisierung der gesamten mikrovaskulären Netzwerken bis auf die Ebene einzelner Zellen ermöglicht.

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Das Wachstum und Remodeling mikrovaskulärer Netzwerke sind entscheidende Aspekte der Wundheilung, von Entzündungen, der diabetischen Retinopathie, des Tumorwachstums und anderer Erkrankungen ...

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die räumlichen und zeitlichen zellulären Dynamiken zu identifizieren, die an der Angiogenese beteiligt sind, definiert als das Wachstum neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden. Mit einem einfachen, reproduzierbaren Modell wird zunächst die Angiogenese ausgelöst, indem das Rattenmesenterium kurzzeitig exponiert wird, und mesenteriale Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation gewonnen. Anschließend werden Gewebeschnitte immunmarkiert.Verwenden Sie beispielsweise einen endothelialen Zellmarker, um das gesamte umgestaltete Gefäßsystem innerhalb eines Gewebes sichtbar zu machen und eine wesentliche zweidimensionale Darstellung wachsender mikrovaskulärer Netzwerke zu erstellen. Dieses Modell ist attraktiv, da es insgesamt innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums einen deutlichen Anstieg mehrerer angiogener Parameter hervorruft. Die Visualisierung der Netzwerke auf Einzelzell-Ebene sowie die Korrelation dieser Parameter mit multizellulärer Markierung haben sich als äußerst nützlich erwiesen, um neuartige Zellphänotypen, die mit Kapillarauswüchsen verbunden sind, zu identifizieren.Diese Methode könnte helfen, zentrale Fragen bezüglich der zellulären Dynamik im Zusammenhang mit dem Wachstum mikrovaskulärer Netzwerke zu beantworten. Dazu gehören die zeitliche Abfolge und der Ort, an dem bestimmte Zellen während des Kapillar-Auswuchsprozesses vorhanden sind. Die Hauptvorteile dieser Methode liegen in ihrer Einfachheit, dem geringen chirurgischen Aufwand und der hervorragenden angiogenen Antwort innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums.Außerdem nutzt es das Raphe-Mesenterium, ein Gewebe, das die Beobachtung eines intakten Netzwerks bis auf die Ebene der einzelnen Zelle ermöglicht. Nach unserer Erfahrung ist es sehr einfach zu erlernen und folglich von einem Forscher zum anderen reproduzierbar, was die Durchführung des Verfahrens demonstriert. Heute wird Peter Stapler, ein Doktorand in unserem Labor, die Vorbereitung auf die Operation gemäß dem beigefügten Text durchführen.Nachdem der Bauchbereich der Ratte rasiert wurde, positionieren Sie die anästhesierte Ratte auf dem Rücken auf einer Heizplatte, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Reinigen Sie den Bauchbereich abwechselnd mit sterilen GREs, die in 70 % Isopropanol, Alkohol und Jod getränkt sind. Führen Sie etwa einen Zoll unterhalb des Brustbeins einen kleinen Längsschnitt entlang der Haut und dann entlang der Linea alba durch. Legen Sie das vorgeschnittene Tuch über den Bauchbereich, sodass die Öffnung mit dem Schnitt übereinstimmt. Üben Sie vorsichtig Druck um den Schnitt herum aus, um den Dünndarm freizulegen. Ziehen Sie mit Wattestäbchen vorsichtig einen Abschnitt des Dünndarms heraus, legen Sie das Mesenterium auf die Kunststoffplatte, die sterile Kochsalzlösung enthält, und lokalisieren Sie das Ileum.Identifizieren Sie sechs bis acht vascularisierte mesenteriale Fenster, die dünne, durchscheinende Membran zwischen den Arterien- und Venenpaaren, die den Dünndarm versorgen. Notieren Sie die Startzeit der Exposition und stellen Sie einen Timer auf 20 Minuten. Markieren Sie die beiden mittig gelegenen mesenterialen Fenster mit steriler 7-0-Naht im Fettgewebe nahe dem Darm. Ersetzen Sie die Kochsalzlösung in der Petrischale intermittierend unter Verwendung einer sterilen Fünf-Milliliter-Spritze, um sicherzustellen, dass das Gewebe weiterhin eingetaucht und feucht bleibt. Nach Ablauf der ausgeschalteten Zeitdauer wird das Mesenterium in die Bauchhöhle zurückverlegt. Schließen Sie den Bauchmuskel mit einer Fünf-Null-Monofilnaht in unterbrochener Technik. Danach die Haut mit vier Einzelknopfnähten aus monofilem Nahtmaterial der Stärke 0 verschließen, den Nahtbereich mit steriler Gaze, die in 70 % Isopropanol getränkt ist, abwechselnd mit Alkohol und Jod abwischen, Augenschmiergel auf beide Augen der Ratte auftragen und das Tier in seinen Käfig zur Erholung zurückbringen. Am gewünschten Tag nach der Stimulation die Ratte gemäß den institutionellen Richtlinien anästhesieren und euthanasieren. Anschließend die Bauchhöhle erneut öffnen und den Bauchbereich mit einer Folie abdecken. Nun vorsichtig den Dünndarm herausziehen und die beiden markierten Fenster mithilfe von Pinzette und Mikroschere lokalisieren.Schneiden Sie jedes der ausgestülpten mesenterischen Fenster aus, wobei ein Rand aus Fettgewebe mit einbezogen werden sollte. Vermeiden Sie es, Arterien- und Venenpaare innerhalb des fetten Randes der Fenster zu durchtrennen, um eine mögliche Blutansammlung in den Fenstern zu minimieren. Minimieren Sie außerdem das Durchtrennen des Darms, das zu Darminhalt führen könnte.Die Fenster sofort nach dem Entnehmen in PBS tauchen. Anschließend mit einer Pinzette die Gewebe auf positiv geladenen Objektträgern ausbreiten. Pro Objektträger zwei Gewebe präparieren. Nachdem die Gewebe teilweise getrocknet sind, überschüssiges Fett mit einer Skalpellklinge entfernen.Fixieren Sie die Proben in Methanol für 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius, indem Sie sie in den Gefrierschrank stellen. Die Objektträger im Vakuum trocknen, um überschüssige Pufferlösung zu entfernen. Umranden Sie außerdem das Gewebe mit einem Wachsstift, um eine unkontrollierte Ausbreitung der Antikörperlösungen außerhalb des Gewebes zu verhindern.Geben Sie nun etwa 200 Mikroliter der verdünnten Primärantikörperlösung tropfenweise auf, um das gesamte Gewebe zu bedecken. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur und waschen Sie das Gewebe mit PBS plus 0,1 % Sapin bei drei Pufferwechseln. Fügen Sie anschließend die Strep-Adin-Peroxidase-Sekundärantikörperlösung hinzu und inkubieren Sie nach drei Waschungen eine Stunde bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Proben danach 15 Minuten in Vector Nova Red.Mit Wasser spülen, um die Objektträger zu montieren. 10-mal in 95 % Ethanol eintauchen, gefolgt von aufeinanderfolgenden Dehydrierungsschritten. Die Objektträger trocknen lassen, sodass die Gewebe mit einer dünnen Schicht bedeckt werden; beeinflussen Sie Menge und Position der Deckgläschen nach dem Vakuumtrocknen und Markieren. Die Objektträger. Bedecken Sie die Gewebeproben mit verdünnter Primärantikörperlösung. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur.Dreimal mit PBS plus 0,1 % Saponin je 10 Minuten waschen. Anschließend die sekundäre Antikörperlösung hinzufügen und eine Stunde inkubieren. Die Waschschritte in PBS plus 0,1 % Saponin durchführen, die Objektträger in PBS mit Glycerin auflegen und mit Nagellack versiegeln.Hier beschreiben wir die Modifikation einer üblichen Petrischale für die Verwendung als Operationsplattform. Gelber Modellierknet wurde verwendet, um eine glatte Oberfläche zu schaffen, durch die das Mesenterium durch die vorher ausgeschnittene Öffnung gezogen werden kann. Nochmals, die hier während der Ausschleusungsphase in der Plattform gezeigten mesenterischen Fenster werden definiert als die dünnen, durchscheinenden Membranen zwischen den Arterien- und Venenpaaren, die den Darm versorgen.Die PCAM-Markierung identifiziert alle Gefäßtypen entlang der Hierarchie von umgestaltenden mikrovaskulären Netzwerken zu bestimmten Zeitpunkten nach der Externalisierung. Diese Bilder können verwendet werden, um angiogenetische Parameter zu bestimmten Zeitpunkten zu quantifizieren. Nach der Stimulation.Die PCAM-Markierung ermöglicht die Unterscheidung von Arterien gegenüber Venen. Beachten Sie, dass die speisenden Arterien typischerweise kleinere Durchmesser und eine längliche Endothelzellmorphologie im Vergleich zu den zugehörigen Venen aufweisen. Typische Merkmale umgestalteter Netzwerke umfassen den vascularisierten Bereich, Kapillarwachstum und die Gefäßdichte.Die Quantifizierung dieser verschiedenen angiogenen Parameter beschreibt den zeitlichen Verlauf des Netzwerkwachstums. Die Kapillar-Auswucherung aus bereits bestehenden Gefäßen erreicht zwischen Tag drei und Tag fünf einen Höhepunkt und kehrt bis zum Tag 10 auf das Niveau der unbehandelten Kontrolle zurück. Diesem vorübergehenden Anstieg der Auswucherung folgen in unserem Labor erhöhte Werte für den vascularisierten Bereich und die Gefäßdichte.Dieses Modellsystem wurde verwendet, um neuartige zelluläre phänotypische Veränderungen zu bestimmten Zeitpunkten während dieses Umbauprozesses zu identifizieren. Die immunfluoreszenzmarkierte PCA-Färbung färbt Endothelzellen rot, während die Markierung von Klasse-drei-Beta-Tubulin Nerven und Parasiten entlang angiogener Gefäße grün anfärbt. Interessanterweise ist die Expression von Klasse-drei-Beta-Tubulin in nicht stimulierten Geweben auf Nerven beschränkt.Im Gegensatz dazu wird Klasse-drei-Beta-Tubulin während des Höhepunkts der Kapillar-Aussprossung von perivaskulären Zellen exprimiert. Diese Art von Ergebnis unterstreicht die Anwendung dieses einfachen und robusten angiogenen Modells zur Identifizierung neuartiger Zelltypen, die am Angiogeneseprozess beteiligt sind. Ab Tag 10 beginnt das Expressionsmuster von Klasse-drei-Beta-Tubulin sich wieder dem unstimulierten Zustand anzunähern.Dieses Modell könnte zudem potenziell für Zelllinien-Studien verwendet werden. Die Machbarkeit der Einlagerung von Zellen in umgestaltendes mesenteriales Gewebe wird durch diese Vorläuferuntersuchungen gestützt, bei denen vorgefärbte Knochenmarkzellen oder mesenchymale Stammzellen während des 20-minütigen Expositionszeitraums über mesenteriale Fenster fusioniert wurden. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie unser Ratten-Mesenterium-Innerialisierungsmodell genutzt werden kann, um die zellulären Dynamiken während des Wachstums mikrovaskulärer Netzwerke zu untersuchen.Diese einfache Technik kann in etwa 45 Minuten bis einer Stunde durchgeführt werden. Denken Sie daran, dass es entscheidend ist, das Mesenterium vorsichtig zu behandeln und nach einem chirurgischen Eingriff das Durchstechen von Gefäßen zu vermeiden. Mithilfe einer Immunfärbung können mehrere Zelltypen entlang von Blutgefäßen identifiziert werden.Sie können auch lymphatische Gefäße und Nerven markieren. Dies ermöglicht es uns, nicht nur die zellulären phänotypischen Veränderungen, die an der Angiogenese beteiligt sind, zu untersuchen, sondern auch die Koordination zwischen Angiogenese, Neurogenese und lymphatischer Angiogenese.

rat-mesentery-exteriorization-model-for-investigating-cellular

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Normalen Erwachsenen vaskularisierten Säugetiergewebe, dass physiologische Angiogenese fehlt und die nicht zur chirurgischen Intervention wird verwendet, um Studie ausgesetzt worden: (i) die Initiierung und Entwicklung der Angiogenese nach intraperitonealer Verabreichung von Test-Agenten, und (ii) die Veränderung der Angiogenese nach systemischer Gabe von ausgewählten Test-Agenten.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

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Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

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Dieses Protokoll beschreibt die intravitalen Bildgebung von transgenen Mäusen zellspezifische fluoreszierenden Marker zum Ausdruck zu bringen. Intravitalen Bildgebung stellt eine nicht-invasive Methode für hochauflösende Beobachtungen an lebenden Tieren mit implantierbaren Windows durch die mikroskopische Visualisierung von Prozessen möglich ist. Diese Methode ist besonders nützlich, um längs Prozesse zu studieren.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Angiogenese beinhaltet Interaktionen zwischen mehreren Zellen und mehreren Systemen, die in einer physiologisch relevanten Umgebung untersucht werden müssen. Das Ziel dieser Studie ist es, die Fähigkeit des Rattenmesenterienkulturmodells zu demonstrieren, Zeitraffervergleiche von intakten mikrovaskulären Netzwerken während der Angiogenese durchzuführen.

Ein<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

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