Ein System für Ex vivo Kultivierung von embryonalen Pankreas

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, embryonale Pankreasknospen von Mäusen ex vivo zu präparieren und zu kultivieren, um eine direkte Visualisierung der sich entwickelnden Bauchspeicheldrüse zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zuerst Mausembryonen am 11,5. oder 12.5. Tag präpariert und der Oberkörper und die Schwanzregion entfernt werden, um den Mittelkörper des Embryos zu isolieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Zwölffingerdarmregion und den Magen für die Lokalisation freizulegen und dann die dorsale Pankreasknospe zu dissektionieren.

Als nächstes werden die Blüten in die Mikrovertiefung einer MacTech-Schale überführt und bis zu einer Woche lang kultiviert. Schließlich kann der Explan für die Bildgebung lebender Zellen analysiert werden, oder der Explan kann fixiert, ganztägig gefärbt und durch Immunfluoreszenzbildgebung analysiert werden. Letztendlich können die Differenzierung von Pankreaszellen, die Organisation des Zytoskeletts sowie die Zellpolarität und die Verzweigungsmorphogenese ausgewertet werden.

Die Ex-vivo-Kultivierung von Pankreas-Explantaten kann helfen, Schlüsselfragen der Pankreas-Organogenese zu beantworten, wie z. B. die Verzweigungsmorphogenese. Wie findet es in der sich entwickelnden Bauchspeicheldrüse statt und wie hängt dieses Ereignis mit Wachstum und Differenzierung zusammen? Beschichten Sie am Tag vor dem Experiment die Mikrovertiefungen mit Glasboden mit einem Durchmesser von 20 Millimetern von 35 Millimetern MacTech Petrischalen mit etwa 150 Mikrolitern Fibronektin, die die gesamte Glasoberfläche bedecken.

Stellen Sie das Geschirr dann für die Inkubation über Nacht in einen vier Grad Celsius heißen Kühlschrank. Am Tag der Dissektion aspirieren Sie das Fibronektin. Spülen Sie die Mikrovertiefs mit Wasser in Zellkulturqualität und geben Sie ein Mindestvolumen von 150 Mikrolitern Dissektionsmedium in jede Vertiefung.

Um den Erfolg der Dissektion zu gewährleisten, ist es unerlässlich, die anatomische Struktur des Embryos gut zu kennen und die dorsale Pankreasknospe unter einem Stereomikroskop mit Beleuchtung von oben lokalisieren zu können. Verwenden Sie eine Dumont-Pinzette, um die Gebärmutter in einzelne Embryosegmente zu teilen. Schälen Sie dann vorsichtig den Muskel der Gebärmutter ab und entfernen Sie die einzelnen Embryonen, die von der Dezidua umgeben sind.

Legen Sie die Embryonen mit den üblichen Embryodissektionstechniken frei und entfernen Sie den Dottersack und das Amnion. Entfernen Sie anschließend die Schwanzregion und den Oberkörper des Embryos oberhalb der Leber. Verwenden Sie nun nur noch eine durchleuchtende Beleuchtung von unten und verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig einen seitlichen Schnitt zu machen, um den Mittelkörper des Embryos zu öffnen und so die Freilegung der inneren Organe zu erleichtern.

Lokalisiere den Magen und die Milz. Die dorsale Pankreasknospe ist seitlich an der hinteren Region des Magens befestigt. Präparieren Sie mit einer Dumont-Pinzette die dorsale Pankreasknospe vom Magen und der Milz weg, lassen aber etwas Mesenchym um das Epithel herum, wie bei der in dieser Abbildung gezeigten Pankreasknospe

Zum Schluss kannst Du die isolierten Blüten mit einer Weidepipette aus Glas in eine 35-Millimeter-Petrischale mit kaltem Nährmedium überführen. Ersetzen Sie nach dem Vorwärmen des Nährmediums das Seziermedium in den mit Faser Nin beschichteten matten Tech-Schalen durch etwa 150 Mikroliter des Nährmediums. Bei einer sterilen Laminar-Flow-Haube ist es wichtig, den Pankreasexponenten vorsichtig in der Mitte der Matt-Platte zu platzieren, um die Befestigung und Ausbreitung der Zellen zu gewährleisten.

Verwenden Sie dann eine Weidepipette aus Glas, um vorsichtig einen Pankreas-Explan in jede der beschichteten matten Tech-Schalen zu übertragen. Um eine Ausbreitung während der Kultur zu gewährleisten, reißen Sie die Mesenchyme, die den Explan umgeben, mit einer feinen Nadel teilweise auf. Legen Sie die Explan nun vorsichtig für einige Stunden in einen Gewebekultur-Inkubator, damit sie sich am Glasboden der Mikrovertiefungen befestigen lassen.

Sobald der Explan angebracht ist, füllen Sie die Mat-Tech-Schalen mit 1,5 bis zwei Millilitern vorgewärmtem Nährmedium. Wechseln Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag für fünf Tage bis zu einer Woche. Beginnen Sie mit dem Ansaugen des Nährmediums und waschen Sie das Explan einmal mit zwei Millilitern PBS.

Entfernen Sie dann das PBS und fixieren Sie die X-Implantate mit zwei Millilitern eiskaltem, 4%igem Formaldehyd und stellen Sie die matte Tech-Schale 20 Minuten lang auf Eis, wobei Sie die Platte von Zeit zu Zeit leicht schwenken. Entfernen Sie anschließend das Paraform-Aldehyd und waschen Sie den Explan dreimal mit zwei Millilitern PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen blockieren Sie mit zwei Millilitern Blockierlösung für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bringen Sie nun die Mat Tech Platten in den Kühlraum und legen Sie sie in eine Feuchtkammer.

Um eine Verdunstung zu verhindern, geben Sie mindestens 150 Mikroliter des in Blockierungslösung verdünnten Primärantikörpers direkt in die Mitte der 20-Millimeter-Mikrovertiefung. Vertiefung der Matten-Tech-Platten, die die gesamte Explan-Oberfläche für die Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius bedecken. Am nächsten Tag entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie den ungebundenen Antikörper dreimal mit zwei Millilitern PBS plus Tween 20 für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur ab.

Nach dem Waschen entfernen Sie PBT und bedecken Sie den gesamten Explan mit mindestens 150 Mikrolitern des Sekundärantikörperwahns und inkubieren Sie den Explan nach der Färbung mit dem Sekundärantikörper ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie den Explan dreimal mit zwei Millilitern PBS plus Tween. 20 für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur und dann einmal nur mit PBS, um die Tween 20 zu entfernen.

Entfernen Sie abschließend PBS und geben Sie wässriges Einbettmedium mit Antifading tropfenweise in die 20-Millimeter-Mikrovertiefung der mat tech Platten. Decken Sie dann den Explan vorsichtig mit einem Glasdeckglas ab, um Luftblasen zu vermeiden. Nachdem der Pankreas-Explan fest mit der Glasbodenschale verbunden ist, montieren Sie die Heizbox und schalten Sie sie mindestens eine Stunde vor der Bildgebung ein, während sich das Gerät aufwärmt. Aspirieren Sie das Explan-Medium und ersetzen Sie es durch frisches Kulturmedium in einer Laminar-Flow-Haube. Transportieren Sie dann die Implantate vorsichtig in den Mikroskopraum und setzen Sie die Mat Tech Dish in den Probenhalter des Konfokalmikroskops ein.

Füge dem Objektiv Medium Wasser hinzu. Schließen Sie die Klimakammer, und konzentrieren Sie sich dann auf den Bereich, der im Explan von Interesse ist. Nach zwei Tagen Kultur durchlaufen die Explantate der Bauchspeicheldrüse ein signifikantes Wachstum und beginnen, sich in verzweigten Epithelstrukturen zu organisieren.

Notieren Sie sich den Bereich, in dem die Verzweigung initiiert wurde. Diese repräsentative 3D-Rekonstruktion der Immunfärbung des gesamten Mount am dritten Tag der Pankreaskultur, die im rechten Bild durch die rote gestrichelte Linie abgegrenzt ist, zeigt, wie die Explantate Tubuli von PDX one-positiven Zellen aufweisen, die nach 48 Stunden Kulturexplantat eine ausgedehnte Verzweigung durchlaufen Am vierten Tag der Kultur durchlaufen sie eine typische Spitzen- und Rumpfsegregation des Epithels. Färbung für EC Ahern in Rot und Phospho-Histon in Blau, Carboxypeptidase One oder CPA One in Grün erscheint in Vorläuferzellen an den Spitzen der Epitheläste, die ebenfalls durch die gestrichelten Linien abgegrenzt sind. An diesem repräsentativen Tag ist die Immunfärbung von drei ganzen Bergen für endokrine Linienmarker in der Bauchspeicheldrüse explan, die Insulinfärbung ist in grün dargestellt, Glucagon erscheint in blau und eca herrin ist in rot, wobei die gelben Pfeile Cluster von Insulin- und Glucagon-positiven Zellen anzeigen.

Im Einschub ist eines der endokrinen Cluster vergrößert. Darüber hinaus zeigt das Pankreasepithel in ex vivo-Kulturen eine korrekte Organisation des Zytoskeletts und eine Zellpolarität mit apikaler Lokalisation von F-Aktin, das hier in grün erscheint, und beta-eins-Integrin an den Basalmembranen, das hier in rot erscheint. Beachten Sie, dass die mesenchymalen Zellen, die durch das Sternchen gekennzeichnet sind, zwischen P pdx one positiven Epithelzellen durchsetzt sind.

In dieser Abbildung sind immer noch Bilder zu sehen, die alle 12 Minuten für insgesamt 15 Stunden aus einem Zeitrafferfilm von Membran-, Tomaten- und Pankreasexplantaten aufgenommen wurden, die in Kultur gezüchtet wurden. Die gestrichelten Linien zeigen die Spitze der Äste und die Grenze zwischen Epithel und Mesenchym. Beachten Sie, dass nach einem 12-stündigen Zeitrafferexperiment das Fluoreszenzsignal der Membrantomate auch dann noch lebensfähig und nachweisbar ist, wenn seine Intensität reduziert wird.

Nachdem Du Dir dieses Video angesehen hast, solltest Du ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pankreasknospen präpariert und kultiviert, und dies wird Dir helfen, verschiedene Aspekte der Pankreasentwicklung zu studieren, einschließlich des Wachstums der Morphogenese und der Differenzierung.