Name: Ein System für Ex vivo Kultivierung von embryonalen Pankreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Lernen Sie die ex vivo-Kultivierung embryonaler Pankreasanlagen zur Untersuchung von Morphogenese und Differenzierung. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung der Pankreasentwicklung in Mausmodellen.

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Research in Die Spagnoli Labor. wird von der Helmholtz-Gemeinschaft, FP7-IRG-2008-ENDOPANC Zuschuss und ERC-2009-Ab HEPATOPANCREATIC Stipendium finanziert.

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Technik, die ursprünglich in Percival und Slack 9 beschrieben und optimiert für die konfokale Mikroskopie angepasst. Ein. Beschichtung von Glass Bottom Kultur Dishes Die folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt werden. <ol><li> Pancreatic Explantate werden in 35-mm-Petrischalen mit 20-mm Durchmesser Glas Mikrowell Boden (zB MatTek Corporation) kultiviert. Verwenden Sie ein Glasboden Gericht pro Explantat Kultur und für die gesamte Dauer der Kultur. Am Tag vor der Präparation und Isolierung der Pankreas Knospen, beschichten Glasboden Vertiefungen, die mit Fibronektin. </li><li> Verdünnen sterile Fibronektin in Zellkultur-grade Wasser zu einer 50 ug / ml Endkonzentration und fügen Sie eine minimale Lautstärke von ihm (~ 150 ul) in der 20-mm Mikrotiter der MatTek Platten über die gesamte Glasfläche (1E). Die Schalenin einem 4 ° C Kühlschrank für Übernacht-Inkubation. </li><li> Am Tag der Dissektion absaugen Fibronektin, spülen Sie die Mikrotiterplatten mit Zellkultur-grade Wasser und ein Mindestvolumen von 150 ul BME (Basal Medium Eagle) Medium mit Pen / Strep (1%), Glutamin (1% ergänzt ) und 50 ug / ml Gentamicin [Dissection Medium]. Lassen Sie die beschichteten Platten in der Laminarströmungshaube bis zu seiner Platte die Explantate. </li></ol> Wenn nicht alle Fibronektin-beschichteten Schalen verwendet werden, können diese gespeichert werden für bis zu 1 Woche bei 4 ° C. Lassen Sie sich nicht die Gerichte trocknen, füllen sie mit Dissection Medium und legen Sie sie in den Kühlschrank stellen. Neben Fibronektin wurden Pankreas Explantate wurden erfolgreich auf verschiedenen Substraten, wie Laminin 9, Matrigel 10,11 oder mikroporösen Membranen 12 kultiviert. Wegen ihrer Auswirkungen auf Verzweigungen, verwenden wir Fibronektin 9 als Substrat. 2. Dissection von DØrsal Pancreatic Bud E11.5 - E12.5 Maus Embryonen <ol><li> Zeitgesteuerten-schwangeren weiblichen Mäusen während der embryonalen Tag (E) 11,5 oder 12,5 geopfert und Embryonen werden gesammelt, indem Sezieren Instrumenten zuvor mit 70% Ethanol gereinigt. Legen Sie die seziert Gebärmutter in 10-cm-Platten mit eiskaltem PBS mit 50 ug / ml Gentamicin ergänzt. </li><li> Unter einem Stereomikroskop mit Beleuchtung von oben, separate der Gebärmutter in einzelne Embryo Segmenten mit kleinen Schere oder Dumont Pinzette vorsichtig abziehen dem Muskel der Gebärmutter und entfernen Sie die einzelnen Embryonen, die durch die decidua umgeben sind. Verwenden Sie Standard-Embryos Präparation Techniken 13 um die Embryonen zu entlarven und entfernen Sie den Dottersack und Amnion. Anschließend Entfernen des Oberkörpers des Embryos (oberhalb der Leber) und der Schwanzbereich. Dies ermöglicht Exposition der inneren Organe (1B). Übertragen der Mittelkörper der Embryonen in 10-cm-Platten mit eiskaltem BME Dissektion Medium. </li><li> JetztVerwenden Sie nur Durchleuchtung von unten zu visualisieren und zu den dorsalen Pankreas Knospe unter dem Stereomikroskop sezieren. Sanft, öffnen Sie die Mitte Körper des Embryos, indem Sie einen seitlichen Einschnitt mit einer Pinzette. Suchen Sie den Magen und die Milz. Die dorsale Pankreas Knospe ist seitlich an dem hinteren Bereich des Magens (1C) befestigt. Mit Dumont Pinzette, sezieren entfernt die dorsale Pankreas Knospe von benachbarten Strukturen, wie der Magen und Milz, aber verlassen einige Mesenchym um die Epithel (Abbildung 1D). Mit einem Glas Pasteurpipette, übertragen die isolierte Keim in eine 35-mm-Petrischale mit kaltem BME Dissektion Medium mit 10% fötalem Kälberserum [Kultur Medium] ergänzt. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Pankreas isoliert sind. Wenn Bauchspeicheldrüsen von verschiedenen Genotypen isoliert sind, bewahren Sie diese getrennt mit Nunc 4-Well-Platten. </li></ol> 3. Plating und Kultur Pancreatic Explantate Finale platten der Explantate erfolgt in Gewebekultur Raum und / oder in unmittelbarer Nähe zu der Gewebekultur-Inkubator durchgeführt, um physische Bewegung der Kulturen zu minimieren. <ol><li> Unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube ersetzt die BME Dissection Medium in den fibronektinbeschichtete MatTek Gerichte mit ~ 150 ul BME Kulturmedium bei 37 vorgewärmt ° C. </li><li> Vorsichtig, übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse Explantate in beschichteten MatTek Gerichte (ein Explantat pro Schale) für langfristige Kultur mit einem Glas Pasteur Pipette. Um sicherzustellen Ausbreitung während der Kultur kann die Mesenchym umgebenden Explantate leicht zerrissen werden, falls notwendig, mit einer feinen Nadel. </li><li> Sanft legen die Kulturen in einer Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für einige Stunden, bis die Explantate auf den Glasboden Vertiefungen anzubringen. Sobald sie gebunden sind, füllen die MatTek Gerichte mit 1,5 ml bis 2 ml BME Kulturmedium vorgewärmt bei 37 ° C. Der Tag der Dissektion wird als Tag 0 bezeichnet. </li><li> Mannipulation der pankreatischen Explantatkulturen wird unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt. Die BME Kulturmedium wird jeden zweiten Tag gewechselt, sofern experimentellen Anforderungen unterschiedlichen Zeitpunkten (z. B. Inkubation der Explantate mit chemischen Mitteln) diktieren. Die Explantate können in diesem Zustand für 5 Tage bis zu einer Woche kultiviert. </li></ol> 4. Whole-mount Immunfluoreszenz Färbeprotokoll für Pancreatic Explantate Alle Schritte des Immunfluoreszenz-Protokoll (ab Fixierung an Bildgebung) sind in der gleichen MatTek Gericht, das bessere Bilder liefert als ein Kunststoff-Boden versehenen Schale durchgeführt. Nach der Fixierung kann Pankreas Explantatkulturen daher keine unter sterilen Bedingungen gehalten werden. <ol><li> Absaugen BME Kulturmedium und waschen das Explantat einmal mit 2 ml 1X PBS. </li><li> Für Explantat Fixierung ersetzen PBS mit 2 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) und die Schale auf Eis für 20 min. Schwenken Sie die Platte vorsichtig von Zeit zuZeit, sondern vermeiden rocken Plattformen, wie das Explantat könnte zu lösen. </li><li> Entfernen PFA und waschen Sie die Explantat dreimal mit 2 ml 1X PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Block mit 2 ml Blockierungslösung (PBS 1X + 0,1% Triton-X + 3% Serum Esel) für mindestens 30 min bei RT. </li><li> Verdünnte Primärantikörpers in Blockierungslösung und füge ~ 150 ul der Verdünnung direkt in das 20-mm Mikrovertiefung der MatTek Platten über die gesamte Oberfläche Explantat für eine Inkubation über Nacht bei 4 ° C. Um körperliche Bewegungen zu minimieren, fügen primären Antikörpers an den Explantaten direkt in den Kühlraum (4 ° C). Um Verdunstung zu verhindern, vor der Zugabe des Antikörpers, platzieren die MatTek Platten in einer feuchten Kammer inkubiert. </li><li> Am nächsten Tag Entfernen der Antikörper-Lösung und dreimal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) für jeweils 30 min bei RT. </li><li> Verdünnen sekundären Antikörper in Blockierungslösung [nach den Empfehlungen des Herstellers, wir benutzen Esel Alexa Fluor Farbstoffe sekundären antiGremien auf 1:750 verdünnt] und fügen Sie ~ 150 ul der Verdünnung direkt in der 20-mm Mikrotiter der MatTek Platten, die das gesamte Explantat Oberfläche, für 1-2 h Inkubation bei RT im Dunkeln. Für nukleare Gegenfärbung gehören Hoechst zusammen mit sekundären Antikörper Verdünnung. Um Verdunstung zu verhindern, vor der Zugabe des Antikörpers, platzieren die MatTek Platten in einer feuchten Kammer inkubiert. </li><li> Waschen dreimal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) für jeweils 30 min bei RT. </li><li> Vor der Montage, einmal abwaschen mit 1X PBS Tween-20 zu entfernen. Montieren, indem ein Tropfen wässrigen Medium (mit Anti-Fading) in den 20-mm Mikrotiter der MatTek Platten. Sanft, decken die Explantat mit einem Deckglas. Luftblasen vermeiden. </li><li> Explantate auf MatTek Platten können unter Standardbedingungen Phasenkontrastmikroskopie oder konfokalen Mikroskopie angesehen werden, abhängig von den Zielen des Experiments. Für die konfokale Mikroskopie Analyse verwenden wir ein Zeiss LSM 700 invertierten Einstellung. Richten Sie geeignete Laser für Fluorophore unsed.. Wählen Sie ein Ziel, das will Bild den gewünschten Bereich des Pankreas Explantat. Ein Wasser-10X Immersionsobjektiv geeignet ist, die gesamte Explantat in dem Sichtfeld zu halten. A 40X Wasser-oder Öl-Immersions-Ziele sind geeignet, um auf spezifische Bereiche des Pankreas Explantats mit einer höheren Auflösung zu konzentrieren. Die Explantate kann optisch geschnitten und dann die erworbenen Z-Stapel rekonstruiert in 3D, mit der entsprechenden Software. </li></ol> 5. Live-cell Imaging Protokoll von Bauchspeicheldrüsenkrebs Explantate <ol><li> Klimakammer Setup: Verwenden Sie eine Schutzgehäuse und eine kleine Inkubationskammer [mit Temperatur-und CO 2-Regelung], die auf dem Mikroskoptisch sitzt. Ordnungsgemäße Kultivieren der embryonischen Bauchspeicheldrüse erfordert eine stabile Temperatur von 37 ° C und einer kontrollierten Atmosphäre von befeuchteten 5% CO 2. Geeignete Räume sind von verschiedenen Herstellern erhältlich (ZB Zeiss, Nikon, Olympus). Montieren Sie die Heizung ein und schalten Sie ihn eint mindestens 1 Stunde vor Imaging startet, damit die Geräte zum Aufwärmen und Gleichgewicht CO 2-Gehalt von 5%. </li><li> Für Zeitraffer-Aufnahmen von Pankreas Explantatkulturen, verwenden wir einen Zeiss LSM 700 inversen Mikroskop. Für Laser und objektive Auswahl siehe Punkt 4.10. </li><li> Lassen Sie das Pankreas Explantat gut mit dem Glasboden-Teller legen, bevor die Live-Bildgebung. [Wir in der Regel live imaging ab Tag 1]. In einer Laminarströmungshaube absaugen und ersetzen Sie das Explantat Medium durch frisches BME Kulturmedium mit optimaler nährstoffarmen Bedingungen starten. </li><li> Übertragen Sie leicht die Explantate auf dem Mikroskop Zimmer und legen Sie die MatTek Gericht im Inkubationskammer in den Probenhalter des konfokalen Mikroskops. </li><li> Bereiten Sie das Ziel (z. B. fügen Öl oder Wasser-Medium nach der Wahl Immersionsobjektiv) und konzentrieren sich auf die Region von Interesse in dem Explantat. Schließen Sie die Klimakammer richtig. Um die Verdunstung während der Zeitraffer zu verhindernAkquisition mit Wasser-Immersions-Objektive, an Stelle von Wasser empfiehlt es sich, viskose Immersionsflüssigkeiten, die im Handel erhältlich sind (z. B. Zeiss Immersol W) verwenden. </li><li> Richten Sie Laserintensität, Z-Stapel Erfassungsparameter und Zeitintervall (siehe auch Beiträge zu Troubleshooting). Starten Sie das Experiment. </li><li> Nach der Bebilderung, Export Z-Stacks und allen Zeitpunkten und analysieren sie mit geeigneter Software (zB ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Dorsalen Pankreas Knospen (zusammen mit dem umgebenden Mesenchym) wurden aus Mausembryonen zwischen E11.5 und E12.5 und plattiert direkt am Glasboden Kulturschalen (Abbildung 1) seziert. Blutgefäße sind in dem Mesenchym umgebenden Epithel und visualisiert werden kann durch Immunfärbung für den endothelialen Marker PECAM 12 (Daten nicht gezeigt). Nach zwei Tagen der Kultur-, Bauchspeicheldrüsen-Explantaten underwent signifikanten Wachstum und begonnen, sich in verzweigte epithelialen Strukturen, deren Kerne waren positiv für den pankreatischen Transkriptionsfaktor Pdx1 (2A-C) anzuordnen. Die durchschnittliche Dicke der z-Pankreas-Explantate am Tag 3 der Kultur ist 60-80 um. Die Oberfläche und das Volumen der Explantate können unter Verwendung geeigneter Software (zB Huygens) werden. Morphologie und Immunfluoreszenz Analysen zeigten, dass Pankreas Explantate mit diesem Protokoll in vivo frühen pankreatischen Differenzierung und morphogenetischen Ereignisse 5,10,11,14 (Abbildung 2) rekapituliert kultiviert. Pancreatic Explantate am Tag 4 der Kultur erlebte typischen &quot;Spitze und Stamm&quot; Segregation des Epithels 8, Anzeige CPA1 + Vorläuferzellen an den Spitzen der epithelialen Filialen (2C) und differenzierten Insulin + und Glucagon + Zellen als Cluster im Kofferraum organisiert (Abbildung 2D ). Darüber hinaus ist die Bauchspeicheldrüsenc Epithel in den ex vivo Kulturen zeigten ordnungsgemäße Organisation des Cytoskeletts und Zellpolarität, mit apikalen Lokalisation von F-Aktin (Abbildung 2E, in grün) und b1-Integrin an den Basalmembranen (2E, in rot). (; Mausstamm ist am Jackson Laboratory mT / mg) (Abbildung 3) Pankreas Verzweigung in Echtzeit zu untersuchen, wurden embryonale Pankreas Explantate aus dem Dual-color fluoreszierenden Reporter Mausstamm membrane-Tomato/membrane-Green 15 isoliert. Standbilder aus einem Zeitraffer-Film mT / mg Pankreas Explantate in Kultur gezüchtet werden in Abbildung 3 dargestellt. Die Lokalisation des mT fluoreszierendes Protein an Membranstrukturen umreißt Zellmorphologie und ermöglicht Auflösung feiner zelluläre Prozesse, so dass die Zelle Umbau und Migration über die Zeit zu verfolgen. Nach einer 12-Stunden-Zeitraffer-Experiment mT Fluoreszenzsignal lebensfähig bleibt und VerschlechterungCTable, obwohl dessen Intensität reduziert wird, wahrscheinlich aufgrund Lichtschäden (Abbildung 3). Technische Lösungen zur Vermeidung oder Verringerung Lichtschäden und Phototoxizität sind in der Diskussion Abschnitt diskutiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des dorsalen Pankreas Knospe Dissektion von E12.5 Maus-Embryo. (A) Hellfeld Bild von E12.5 Maus-Embryo. Der Oberkörper des Embryos (oberhalb der Leber) und Heckbereich werden entfernt, um den mittleren Körper (B) zu isolieren. Die Schnitte werden durch rote gestrichelte Linien dargestellt. (C) Ferner Dissektion Ergebnissen der Exposition des Magens und Duodenums Region (angedeutet durch den gestrichelten Kasten). Die dorsale Pankreas Knospe (siehe roter gestrichelter Kreis) ist an der Basis des Magens und neben der Milz Primordium. Der seziert dorsalen Pankreas Knospe (D) mit einer Pasteurpipette in die Mikrotiterplatten von einem Glasboden Schale mit BME Kulturmedium (E transferiert, F). Abkürzungen: sto (Magen), sp (Milz), dp (dorsalen Pankreas Knospe), Duo (Zwölffingerdarm). Maßstabsbalken, 1000 um (A, C). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> Abbildung 2. Whole-mount konfokalen Immunfluoreszenz Analyse des Pankreas Explantatkulturen. (A) Hellfeld Bilder von Pankreas-Explantate am Tag 1 und Tag 2 von ex vivo Kultur. Red gepunktete Linie zeigt Einleitung Verzweigung des Epithel. (B) 3D-Rekonstruktion von whole-mount Immunfärbung für Pdx1 am Tag 3 Pankreas Kultur. Pancreatic Explantate zeigten Tubuli Pdx1 + Zellen, die eine umfangreiche Verzweigung um 48 hr der Kulturen. (C) Whole-Mount-Immunfärbung von Tag 3 Pankreas Explantat mit Antikörpern gegen den basolateralen Membran Marker E-Cadherin (ECAD), tip Vorläuferzellen Marker, Carboxypeptidase 1 (CPA1) und Phospho-Histon H3 (pHH3). Die meisten der mitotischen aktive pHH3 +-Zellen kolokalisiert an den peripheren Tipps mit CPA1 + Zellen. Gestrichelte lines anzuzeigen Spitze der Zweige. (D) Whole-Mount-Immunfärbung für endokrine Linie Marker, Insulin (Ins) und Glucagon (Gluca) am Tag 3. Gelbe Pfeile zeigen Cluster Ins + und Gluca + Zellen. Einsatz (D &#39;) mit höherer Vergrößerung von einer der endokrinen Zellen-Clusters. (E) Whole-Mount-Immunfärbung von Tag 3 Pankreas Explantat für Pdx1, β1 Integrin (β1int) und F-Aktin (Fact). Mesenchymale Zellen (Sternchen) unter Pdx1-positive Epithelzellen durchsetzt. Bilder in C, D und E dargestellt sind einzelne Abschnitte des konfokalen optischen Z-Reihe. Maßstabsbalken, 100 um (A, B); 50 um (CE). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter Live-Cell-Imaging von ex vivo kultivierten pankreatischen Explantat. (AD) Frames von einem Zeitraffer-Film eines Pankreas Explantat aus einer mT / mG Maus transgenen Embryos. Minute: Time of Imaging wird in Stunden angezeigt. Das Explantat wurde abgebildet ab Tag 1. Z-Stapel-Aufnahmenwurden mit einem 40X Ölimmersionsobjektiv alle 12 min für insgesamt 15 Stunden erfasst. Die gestrichelten Linien zeigen den Filialen und Grenze zwischen Epithel und Mesenchym kippen. Maßstab, 50 um.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Sobald pankreatischen Schicksal angegeben, durchlaufen Pankreas-Vorläuferzellen umfangreiche Proliferation, Differenzierung und Morphogenese zu bilden schließlich ein reifes und funktionalen Organs 2,4. Derzeit dauert, wie Verzweigen in der Bauchspeicheldrüse und wie es um Vorläuferzellen Proliferation und Differenzierung verbunden ist weitgehend unbekannt. Pancreatic Explantatkulturen stellen ein ideales System zur Aufklärung dieser Prozesse ex vivo 5,9,11. Durch die Kombination von Live-...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Antikörper: Carboxypeptidase E-Cadherin F-Actin Glucagon Insulin β1-Integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histon H3 </td><td> AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma Bank Zelluläre Signalübertragung </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Zellkultur Wasser </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Kulturschalen (Glasboden), 35-mm- </td><td> MatTek Konzern </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> Donkey Serum </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum Gold- </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Lager Sol. 1 mg / ml in Zellkultur-Wasser </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> 4-well Multischalen </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskope: Inverted konfokalen Mikroskop (LSM 700) Stereomikroskop (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Ziele: C-Apochromat 10x / 0,45 W M27 (Arbeit. dist 1,8 mm;. Bildtiefe ~ 100 mm); C-Apochromat 40x / 1,2 W Korr M27 (Arbeit. dist 0,28 mm;. ~ Bildtiefe 50 um) Durchleuchtung von unten und Glasfaser-Beleuchtung von oben </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Roth </td><td> 0.335,3 </td><td> Stammlösung 20% </td></tr><tr><td> Pasteur Pipette (Glas), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> Gehalten in sterile cEDINGUNGEN </td></tr><tr><td> Petrischalen, 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen, 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Federschere 8 mm Klinge gebogen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> Uhrmacher-foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

ein system für<em&gt; ex vivo</em&gt; kultivierung von embryonalen pankreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Die Bauchspeicheldrüse steuert wichtige Funktionen unseres Körpers, einschließlich der Produktion von Verdauungsenzymen und Regulierung des Blutzuckerspiegels 1. Obwohl in den letzten zehn Jahren viele Studien zu einer festen Grundlage für das Verständnis der Bauchspeicheldrüse Organogenese beigetragen haben, bestehen große Lücken in unserem Wissen über frühe Bauchspeicheldrüse Bildung 2. Ein vollständiges Verständnis dieser frühen Ereignisse Einblick in die Entwicklung dieses Organs zu schaffen, sondern auch in unheilbaren Krankheiten, die die Bauchspeicheldrüse zielen, wie Diabetes oder Bauchspeicheldrüsenkrebs. Schließlich werden diese Informationen generieren Konzept für die Entwicklung Zell-Ersatz-Therapien im Rahmen des Diabetes. Während der Embryogenese, stammt die Bauchspeicheldrüse aus unterschiedlichen embryonalen Auswüchse der dorsalen und ventralen foregut Endoderm am embryonalen Tag (E) 9,5 im Maus-Embryo 3,4. Beide Auswüchse evaginate in das umgebende Mesenchym als feste Epithelienl Knospen, die Proliferation unterziehen, Verzweigung und Differenzierung eine ausgereifte Orgel 2,5,6 generieren. Jüngste Beweise haben vorgeschlagen, dass das Wachstum und die Differenzierung von Pankreas-Zelllinien, einschließlich der Insulin produzierenden β-Zellen, auf ordnungsgemäße gewebespezifischen Architektur, epitheliale Zelle Remodellierung und Positionierung innerhalb des Pankreas Epithel Verzweigungsmittel 7,8 abhängt. Doch wie Verzweigungen Morphogenese auftritt und mit der Proliferation und Differenzierung in der Bauchspeicheldrüse koordiniert ist weitgehend unbekannt. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass die derzeitigen Wissen über diese Entwicklungsprozesse bisher fast ausschließlich auf der Analyse von festen Proben herangezogen, während morphogenetischen Ereignisse hochdynamisch sind. Hier berichten wir über eine Methode zum Präparieren und Kultivieren von embryonalen Maus-Pankreas Knospen ex vivo am Glasboden Gerichte, die direkte Visualisierung der Entwicklung von Pankreas (Abbildung 1) zu ermöglichen. Dieser Kulture-System ist ideal für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie entwickelt und vor allem Live-Cell-Imaging. Pancreatic Explantate können nicht nur von Wildtyp-Maus-Embryonen hergestellt werden, sondern auch aus gentechnisch veränderten Mauslinien (zB transgenen oder Knockout), so dass Echtzeit-Studien von mutierten Phänotypen. Darüber hinaus ist diese ex vivo Kultursystem wertvolle um die Wirkungen von chemischen Verbindungen auf Bauchspeicheldrüsenentwicklung studieren, ermöglicht, um quantitative Daten über die Proliferation und das Wachstum, die Dehnung, Verzweigungsgrad, Tubulogenese und Differenzierung zu erreichen. Zusammenfassend stellt die Entwicklung eines ex vivo Pankreas Explantatkultur Methode mit hochauflösenden bildgebenden kombiniert eine starke Plattform für die Beobachtung morphogenetischen und Differenzierung Ereignisse, wie sie in den Entwicklungsländern Maus-Embryo auftreten.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine hervorragende<em&gt; Ex vivo</em&gt; System zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Bauchspeicheldrüse Entwicklung, einschließlich der Morphogenese, Differenzierung und Wachstum. Pankreas Knospe Explantate kann für mehrere Tage kultiviert werden und in einer Reihe von verschiedenen Anwendungen, einschließlich whole-mount Immunfluoreszenz und Live-Bildgebung.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

Die Bauchspeicheldrüse steuert lebenswichtige Funktionen unseres Körpers, einschließlich der Produktion von Verdauungsenzymen und der Regulierung des Blutzuckerspiegels1. Obwohl in der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die embryonalen Pankreasanlagen von Mäusen ex vivo zu isolieren und zu kultivieren, wodurch eine direkte Visualisierung der sich entwickelnden Bauchspeicheldrüse ermöglicht wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen von Tag 11,5 oder 12,5 der Maus isoliert und der obere Körperbereich sowie der Schwanz entfernt werden, um den mittleren Körperteil des Embryos zu gewinnen. Im zweiten Schritt werden der Dünndarmbereich und der Magen lokalisiert, um anschließend die dorsale Pankreasanlage zu präparieren.Anschließend wird der Keim in die Mikrovertiefung einer MacTech-Schale überführt und bis zu einer Woche lang kultiviert. Abschließend kann das Explantat für die Live-Zell-Bildgebung analysiert werden, oder das Explantat kann fixiert, als Ganzpräparat gefärbt und mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung analysiert werden. Letztendlich können die Differenzierung der Pankreaszellen, die Organisation des Cytoskeletts, die Zellpolarität sowie die verzweigte Morphogenese bewertet werden.Die ex vivo-Kultivierung von Pankreas-Explantaten kann helfen, zentrale Fragen zur Pankreas-Organogenese, wie beispielsweise die Verzweigungsmorphogene

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die aktuelle Studie beschreibt eine gerichtete Differenzierung Ansatz bei der Induktion von Pankreas-Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen. Von großer Bedeutung ist der Befund, dass Endothelzellen Co-Kultur vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin exprimierenden Zellen.

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

In dieser Veröffentlichung beschreiben wir eine schnelle und bequeme Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von primären Azinuszellen des Pankreas von dem murinen Bauchspeicheldrüse. Diese Methode stellt einen wertvollen Ansatz, um die Physiologie der frischen primären normal / transformierten exokrinen Pankreas-Zellen zu studieren.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

Ein Protokoll zur Isolierung und Kultur und Bildinselzellclustern (ICC) von humanen fötalen Pankreaszellen abgeleitet wird beschrieben. Die Methode beschreibt die erforderlich sind, um Chipkarten aus Gewebe, Kultur als Monoschichten oder in Suspension als Aggregate und Bild für Marker der Proliferation und Pankreaszellschicksal Entscheidungen erzeugen Schritte.

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Lernen Sie die ex vivo-Kultivierung embryonaler Pankreasanlagen zur Untersuchung von Morphogenese und Differenzierung. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung der Pankreasentwicklung in Mausmodellen.

Ein System für

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