Name: In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Elektroporation zur Manipulation der Genexpression in embryonalen Hinterhirn-Progenitoren von Mäusen. Diese Methode ermöglicht gezielte DNA-Übertragung in frühen Entwicklungsstadien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren bedanken sich bei Jane Johnson für die Math1, Ngn1 danken und Ptf1a Antikörpern und Connie Cepko für die pCAG :: GFP-Plasmid. Diese Arbeit wurde vom NIH R15 1R15HD059922-01 finanziert.

1. Zubereitungen vor der Elektroporation <ol><li> Amplify die DNA für die Elektroporation von einem Maxi Prep (Prime-It oder Qiagen). Die Konzentration der DNA sollte mindestens 1 mg / ml für eine effiziente Aufnahme sein. </li><li> Nehmen Sie 495 ul von DNA und mischen mit 5 ul von 0,01% Fast Green in 1 X PBS (phosphate buffered saline) in einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 2. Embryonale Ernte <ol><li> Stellen Sie zeitlich Paarungen von CD-1 Mäuse (Harlan). Prüfen auf das Vorhandensein von vaginalen Stecker und betrachten Sie das Datum ein Vaginalpfropf wie embryonale Tag (E) 0,5 eingehalten wird. Die Embryonen werden 11 Tage nach Visualisierung Stecker (E11.5) geerntet werden. </li><li> Platzieren Sie sterilisierten Instrumente in 70% Ethanol. Behandeln eines Laminarbox mit UV-Licht für mindestens eine Stunde vor der Verwendung. Sprayhood, Sezieren Fach, und Binokular mit 70% Ethanol. Vorheizen 1 X PBS auf 37 ° C </li><li> Am E11.5 einschläfern das Weibchen entsprechend den Bedingungen der vom Institut genehmigtionalen Ausschuss für die Pflege und Nutzung von Tieren (ICCUA). Platzieren Sie sezieren Tablett in der Sterilbank. Sprühen Sie den Bauch des Weibchens mit 70% Ethanol. </li><li> Öffnen Sie die Bauchhöhle und Pin die Wände zum Sezieren Fach. Ziehen Sie die Uterushörner so dass diese innerhalb der Bauchhöhle liegt. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig öffnen Sie die Wand der Gebärmutter-Horn. Verwenden Sie eine 20 mm Löffel (Fine Scientific Tools) zur schonenden Entfernung der Embryo im Dottersack weg von der Plazenta. Ort Embryonen in einen 100 mm Gewebe-Kulturschale mit 10 ml sterilem 1 x PBS, die in 2,2 vorgewärmt wurde vorgefüllt. </li><li> Wiederholen Sie für alle Embryonen vorhanden. </li></ol> 3. Elektroporation von E11.5 Embryonen (1) <ol><li> Mit Hilfe eines 20 mm Löffel, übertragen Sie den ersten Embryo auf eine neue 100 mm-Schale mit 10 ml sterilem 1XPBS, die auf 37 vorgeheizt war vorgefüllt ° C. </li><li> Verwenden einer Pinzette 11 cm mit einer 0,05 x 0,02 mm Spitze (Fine Scientific Tools), um ihn wieder vorsichtigbewegen und entsorgen Sie den Dottersack. </li><li> Position Embryo, so dass seine dorsale Seite nach oben zeigt, so dass es die Karikatur in 1A ähnelt. Verwenden 7 mm Elektrode Paddel (Harvard Apparatus) vorsichtig halten den Embryo. Die Elektroden werden auf jeder Seite des Neuralrohrs auf der Ebene des Rautenhirns vierten Ventrikels positioniert werden. Die Kammer ist mit bloßem Auge, sondern unter Verwendung eines Dissektionsmikroskop kann eine genaue Paddel Anordnung zu erleichtern. Positionierung der Paddles ist entscheidend für die Bestimmung der Region, die die DNA elektroporierten empfängt. Wenn die untere Lippe rhombischen (LRL) des dorsalen embryonalen Hinterhirn gewünscht wird, muss Paddel Platz, so dass sie direkt flankieren den breitesten Teil des vierten Ventrikels Öffnung sein. </li><li> Benutzen Sie einen 1-ml-Spritze für die Erarbeitung der Plasmid-DNA mit 0,01% Fast Green gemischt. 500 ul der Mischung sollte ausreichend sein für die Elektroporation von mindestens 8-10 Embryonen (siehe 3.5). </li><li> Sanft Punktion der roofplate overlying den vierten Ventrikel mit einer 25G 08.05 Tuberkulin-Nadel an der 1 cc Spritze aufgezogen und das DNA-Farbstoff-Mischung in die Herzkammer. Erfolgreiche Injektionen werden durch die DNA-Farbstoffmischung Füllen des gesamten Ventrikelsystem (1C) aufweist. Die Menge an DNA-Farbstoffmischung üblicherweise injiziert weniger als 50 ul. Genaue Mengen sind variabel zwischen Embryonen als ein Teil der Mischung entweichen kann, der Herzkammer in die PBS den Embryo umgibt. Eine alternative Möglichkeit der Abgabe der DNA-Farbstoff-Gemisch würde durch den Zugriff auf das Ventrikelsystem durch Punktion des Velum über dem Mittelhirn sein. Wiederum sind erfolgreiche Injektionen durch die DNA-Farbstoffmischung Füllen des gesamten ventrikulären Systems gekennzeichnet sind. </li><li> Deliver fünf Rechteckimpulse mit einem elektrischen Impulsgeber (BTX) und 7 mm Elektrode Paddel. Jeder Impuls ist 50 V dauerhaft 5 ms pro Puls mit 500 ms zwischen jedem Impuls. Das Gewebe am nächsten zu dem positiv geladenen Elektrode wird dann take bis das Plasmid. </li></ol> 4. Kultur von Embryonen <ol><li> In einer Laminarbox füllen die äußeren Vertiefungen einer 12-Well-Kulturschale mit 2 ml DMEM/F12-Medien mit 10% fötalem Rinderserum, 5% Pferdeserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt wurde vorerhitzt, die auf 37 ° C Die Kulturbedingungen wurden von de Diego und Kollegen angepasst. 15 </li><li> In Laminarströmungshaube Prise Embryonen bei Mittelteil (unterhalb des Herzens) mit einer Pinzette entfernen und hinteren Teil des Embryos. Platzieren der vordere Teil in eine der gefüllten Vertiefungen der 12-Well-Kulturschale. </li><li> Wiederholen Sie für alle Embryonen. Füllen nur die äußeren Vertiefungen der Platte mit 12 Vertiefungen, um eine Kontamination der Kulturen zu vermeiden. </li><li> Kultur Embryonen in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. Die Expression des elektroporierte Plasmid sollte innerhalb von 24 Stunden zu beobachten sein. </li><li> Sollten mehr Kultur Zeiten gewünscht werden, füllen die aus Vertiefungen einer neuen 12-Well-Platte mit 2 mldie Medien in 4.1 verwendet. Mit einem sterilisierten Löffel übertragen die Embryonen zu einem Brunnen in der neuen Platte. Platzieren Sie zurück in die 37 ° C Inkubator. Kultur für bis zu 48 Stunden möglich ist. </li><li> Wenn die gewünschte Kultur Zeitpunkt erreicht ist, fixieren Embryonen für die Analyse (siehe unten). </li></ol> 5. Vorbereitung von Embryonen für die Analyse <ol><li> Spülen Embryonen in 1 × PBS bei 4 ° C für fünf Minuten. Wiederholen. </li><li> Befestigen Embryonen zur Analyse in 2% Paraformaldehyd (PFA) in 1XPBS für 2 Stunden bei 4 ° C </li><li> Spülen Embryonen in 1 × PBS bei 4 ° C für fünf Minuten. Wiederholen. </li><li> Äquilibrieren Embryonen in 30% Saccharose in 1 × PBS über Nacht bei 4 ° C </li><li> Einbetten Embryonen in optimaler Temperatur Cutting (OCT) Verbindung mit einem Trockeneis / Ethanol-Bad. Embryonen können bei -20 ° C gelagert werden </li><li> § Embryonen auf einem Kryostat (Leica) in 30 um Abschnitte und montieren auf Objektträgern (VWR, Superfrost Plus). Lagerung bei -20 ° C. </li></ol> 6. Immunohistochemistry Analyse <ol><li> Die Immunhistochemie wurde durchgeführt, wie in 16 beschrieben. Primäre Antikörper-Verdünnungen für diese Studie verwendet werden, gehören Kaninchen α-GFP (Invitrogen) 1:2500; Maus α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; Kaninchen α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; Kaninchen α-Ptf1a (Jane Johnson ) 1:2500; Kaninchen-Math1 (Jane Johnson) 1:100. Inkubieren Dia flach, Probe nach oben auf eine Färbegestell bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Die Objektträger wurden auf einem zusammengesetzten Mikroskop (Olympus BX51) analysiert. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Eine schematische in 1A zeigt die Elektroporation Experiment. 1B zeigt eine sagittale Ansicht eines E11.5 Embryos vor der Manipulation. Derselbe Embryo nach der Injektion des Plasmids, welches CAG :: GFP in 0,01% Fast Green ist in 1C und einem Vertreter unfixierten Embryo aufweist einseitige GFP gezeigtExpression in der dorsalen Rautenhirn 24 Stunden folgende Kultur wird in 1D gezeigt. Das Ausmaß der Fläche der LRL, die erfolgreich elektroporiert wird, ist variabel und wird eine starke Abhängigkeit von der Positionierung der Elektroden. In unseren Studien wurde festgestellt, dass 52 von 65 (80%) der elektroporierte Embryonen erfolgreich exprimierten GFP. Das Gewebe wurde als erfolgreich elektroporiert werden, wenn sie positiv für GFP in räumlich begrenzten Bereichen über mehrere Abschnitte war nach Fixierung und immunhistochemische Analyse (siehe unten). Embryonen, die diese Kriterien erfüllen konnten, wurden als erfolglose Elektroporation erzielt. Eine weitere Beurteilung Elektroporationseffizienz ermittelt werden kann, indem Immunhistochemie gegen GFP auf Querschnitten der elektroporierten Embryonen auf der Ebene des vierten Ventrikels. 2 zeigt repräsentative serielle Schnitte von einem Embryo Anzeigen einseitigeGFP-Expression. 2A zeigt eine schematische Darstellung, die idealisierten, dass die linke Seite des Embryos in Richtung der positiven Elektrode betrug veranschaulicht. Querschnitte (in Konzentrationen von der Mitte cartoons von 2A dargestellt) zeigen lokalisierten GFP-Expression ausschließlich auf der linken Seite des Rautenhirns Gewebe (2C und 2D). Das elektroporierte Bereich der LRL nicht verlängern die gesamte anterior-posterioren Achse des Neuralrohrs als Untersuchung von Schnitten 300 um rostralen oder mehr zu, dass in 2C gezeigt nicht ausdrücklich GFP (Abbildung 2B). Die Nützlichkeit dieser Methode für Manipulation der Genexpression ist abhängig von der Stabilität der Expression Domänen für die endogene Proteine. Die LRL als Vorläuferzellen, die einzigartige Domänen, die unterschiedliche Expression von proneurale Transkriptionsfaktoren (Übersicht in 1) dadurch gekennzeichnet.Ein Teil dieser Faktoren (Mash1, Math1, Ngn1 und Ptf1a) wurden für die Analyse aufgrund ihrer geplanten und / oder gekennzeichnet Rollen in der Spezifikation der neuronalen Subtypen precerebellar in der LRL, ein Thema weiterer Studien 16-18 gewählt. Alle vier Proteine ​​haben sehr charakteristischen Ausdruck Domains im kaudalen Hirnstamm bei E11.5 16-18. Wir beobachteten, dass Embryonen, die Kulturen gelegt wurden, um an Größe zu und scheiterte ebenfalls keine Produktion von Epithel des Plexus choroideus und Invagination der LRL und roofplate, morphologischen Ereignisse, die zwischen E11.5 und E12.5 5 auftreten zu initiieren. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde festgestellt, dass eine normale Entwicklung in diesen Embryonen gestoppt wurde oder grob verzögert und die vergleichbare Regelung für den kultivierten Embryonen sollten unkultivierten Embryonen bei E11.5 sein. Um sicherzustellen, dass Kultur und Elektroporation nicht stören Konzentrationen endogener Proteine, analysierten wir vier verschiedene Proteine, die von immunohistochemistry (IHC) in 34 verschiedenen Embryonen, die Elektroporation und wurden dann kultiviert für mindestens 24 Stunden. Tabelle I zeigt die Anzahl der Embryonen für jeden Marker und der prozentuale Anteil der Embryonen analysiert, dass beibehalten normalen Protein-Spiegel. Abbildung 3 zeigt repräsentative Daten IHC analysiert von zwei der Proteine ​​analysiert, Mash1 (3A und 3B) und Math1 (3C und 3D). Wir beobachteten, dass die Mehrheit der Embryonen ein normales Niveau der Expression nach der Elektroporation und die Kultur (3B und 3D) gehalten zu den Kontrolltieren Embryonen E11.5 (3A und 3C) verglichen. Wichtig ist, wurden die charakteristischen Ausdruck Domänen dieser Proteine ​​nicht gestört. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. Elektroporation von Embryonen bei E11.5. (A) Schematische Darstellung the Elektroporation Experiment. Ein E11.5 Embryo isoliert und das Expressionsplasmid in 0,01% Fast Green in den vierten Ventrikel injiziert. Der Embryo wird dann durch die Elektrode Schaufeln flankiert und einer 50 V-Impuls, bevor sie in Kultur (B) Sagittal Ansicht eines E11.5 Embryos vor der Injektion angeordnet. (C) Das gleiche E11.5 Embryos nach der Injektion von Plasmid in 0,01% Fast Green. (D) Einseitige Hinterhirn Expression von GFP beobachtet in E11.5 Embryo nach 24 Stunden der Kultur. mb-Mittelhirn; 4V-vierten Ventrikels. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig2.jpg" alt="2"/> Abbildung 2. Die Expression von GFP in elektroporiertem Tissue. (A) Die Karikatur auf der linken Seite zeigt die Platzierung der Elektroden um einen E11.5 Embryos. Mittlerer cartoons zeigt Aufnahme und Expression von GFP-codierende Plasmid auf der linken Seite des Embryos. Cartoon auf der rechten Seite ist schematisch von einer idealisierten Querschnitt durch den Embryo in l genommenevels bezeichnet mit schwarzen Linien in der Mitte Karikatur. (B-D) Immunhistochemie für GFP auf Querschnitten durch eine elektroporierte E11.5 Embryo nach 24 Stunden Kultur. Die Pfeile zeigen die roofplate (RP), hält den sekundären Antikörper. Die Bilder werden mit 10facher Vergrößerung. Die relativen Werte der Abschnitte dargestellt sind durch die horizontalen Linien in der Mitte Karton in (A) dargestellt. mb-Mittelhirn; l 4V-vierten Ventrikels; rp-roofplate. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Die Expression von endogenen Proteinen in der unteren Lippe rhombische Immunhistochemie für Mash1 (A und B) oder Math1 (C und D) Vergleichen Querschnitte E11.5 Embryonen, die nicht kultiviert (A, C) mit Embryonen, die mit CAG elektroporiert wurden.: : GFP und für 24 h (B und D). Bilder mit 10facher Vergrößerung. <table border="1"><tbody><tr><td> Proneurale TranscriptiFactor auf Analysierte </td><td> Anzahl der Embryonen Analysierte </td><td> Prozentsatz Beibehaltung normaler Expression Patterns </td></tr><tr><td> Math1 </td><td> 15 </td><td> 86,7% </td></tr><tr><td> Mash1 </td><td> 12 </td><td> 83,3% </td></tr><tr><td> Ngn1 </td><td> 7 </td><td> 71,4% </td></tr><tr><td> Ptf1a </td><td> 6 </td><td> 100% </td></tr></tbody></table> Tabelle I. Anteil der elektroporiert und kultivierten Embryonen Zurückhalten der proneurale Transkriptionsfaktors Domains in der LRL.

<ol><li>Ray, R. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rautenlippe+Redux+--+toward+a+unified+view+of+the+precerebellar+rhombic+lip%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip.</a> Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhombic+lip+and+early+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The rhombic lip and early cerebellar development.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).</li>
<li>Wingate, R. J., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+rhombic+lip+in+avian+cerebellum+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The role of the rhombic lip in avian cerebellum development.</a> Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+Cerebellar+System%3A+In+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+function%22">Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function</a>. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).</li>
<li>Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+brainstem+cochlear+nuclear+complex+is+revealed+by+intersectional+and+subtractive+genetic+fate+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps.</a> Neuron. 50, 205-218 (2006).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li>
<li>Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+the+precerebellar+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Origin of the precerebellar system.</a> Neuron. 27, 475-486 (2000).</li>
<li>Taber-Pierce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+nuclei+griseum+ponitis%2C+corporis+pontobulbaris+and+reticularis+tegmenti+pontis+%28bechterew%29+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse.</a> J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).</li>
<li>Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zic1+levels+regulate+mossy+fiber+neuron+position+and+axon+laterality+choice+in+the+ventral+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem.</a> Neuroscience. 162, 560-573 (2009).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li>
<li>Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classic+cadherins+regulate+tangential+migration+of+precerebellar+neurons+in+the+caudal+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain.</a> Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).</li>
<li>Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+nucleogenesis+by+precerebellar+neurons%3A+involvement+of+ventricle-directed%2C+radial+fibre-associated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration.</a> Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).</li>
<li>Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+and+nucleogenesis+of+mouse+precerebellar+neurons+visualized+by+in+utero+electroporation+of+a+green+fluorescent+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene.</a> Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).</li>
<li>de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+influences+on+the+migration+of+precerebellar+neurons+in+the+caudal+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla.</a> Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).</li>
<li>Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+rhombic+lip+is+comprised+of+discrete+progenitor+cell+populations+allocated+by+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6.</a> Neuron. 48, 933-947 (2005).</li>
<li>Hoshino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a%2C+a+bHLH+transcriptional+gene%2C+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47, 201-213 (2005).</li>
<li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+climbing+fiber+neurons+and+their+developmental+dependence+on%5BTitle%5D)+AND+%22Ptf1a.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on.</a> Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die In-vitro-Elektroporation Technik in dieser Studie vorgestellt ist eine neuartige Methodik, die effizient genutzt werden können, um die Genexpression in Embryonen zu manipulieren jünger als 12 Tagen der Trächtigkeit. Die Platzierung der Embryonen in Kultur erlaubt die Expression des eingeführten Gens und umgeht die Letalität beobachtet, wenn elektroporierten Embryonen erlaubt, in vivo bleibt. Diese Technik erlaubt die Manipulation der Genexpression in der embryonalen Vorläufer, die bisher nicht zugä...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica </td><td> CM-1850 </td><td></td></tr><tr><td> Biologie Spitze Dumoxel behandelt DUMONT Pinzetten </td><td> Feine Wissenschaftliche Werkzeuge </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mm MORIA Schaumlöffel </td><td> Feine Wissenschaftliche Werkzeuge </td><td> 10370-17 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Square Wave Generator Elektroporation </td><td> BTX (VWR) </td><td> 47745-928 </td><td></td></tr><tr><td> Harvard Apparatus 7 mm * Elektroden Tweezertrodes </td><td> BTX (Fisher) </td><td> BTX450165 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher Isotemp CO 2-Inkubator </td><td> Fischer </td><td> 1325525 </td><td></td></tr><tr><td> NAPCO CO 2-Gas Regulator </td><td> Fischer </td><td> 15497020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 well-Zellkulturplatten </td><td> BD Falcon (Fisher) </td><td> 877229 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); mit L-Glutamin und HEPES; 500mL </td><td> Thermo Scientific (Fisher) </td><td> SH3002301 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone * Donor Pferdeserum </td><td> Thermo Scientific (Fisher) </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderfötenserum, Qualifizierte, hitzeinaktiviertem </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-063 </td><td></td></tr><tr><td> CellGro * 10.000 IE Penicillin, 10.000 ug / ml Streptomycin </td><td> Mediatech (Fisher) </td><td> MT-30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HyClone * L-Glutamin L-Glutamin, 200 mM in 0,85% NaCl </td><td> Thermo Scientific (Fisher) </td><td> SH3003401 </td><td></td></tr><tr><td> Fast-Grün </td><td> Fischer </td><td> AC41053-0250 </td><td> 0,01% </td></tr></tbody></table>

in-vitro-elektroporation von der unteren rhombischer lip von der schwangerschaft ab muriner embryonen

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

Das rautenförmige Lippe ist eine embryonale Neuroepithels im Rautenhirn an der Verbindungsstelle zwischen dem Rohr und dem neuronalen roofplate des vierten Ventrikels (Übersicht in 1) angeordnet ist. Die rhombischen Lippe in den oberen rhombischen Lippe (URL), die Rhombomer 1 (R1) umfasst und erzeugt Neuronen des Kleinhirns und des unteren rhombischen Lippe (LRL), die Anlass zu vielfältigen neuronalen Hirnstamm Linien 2-4 unterteilt werden. LRL Derivate umfassen die auditorischen Neuronen des Cochlea-Kerne und die der precerebellar Kerne, die bei der Regulierung der Balance und motorische Kontrolle 8.5 beteiligt sind. Neurogenese aus dem LRL tritt über eine große zeitliche Fenster, das embryonalen Tag (E) 9,5 bis 16,5 5, 9 umfasst. Unterschiedliche neuronale Linien ergeben sich aus der LRL als postmitotischen Zellen (oder geboren sind) während der verschiedenen Entwicklungs-Tag während dieser neurogenen Fenster. Elektroporation von Genexpression Konstrukte können verwendet werdenManipulation der Genexpression in LRL Vorläuferzellen und kann potentiell verändern das Schicksal der Neuronen aus dieser Region von 10 bis 12 produziert. Veränderung der Genexpression von LRL Vorläuferzellen der Maus über die in utero Elektroporation ist sehr erfolgreich für die Manipulation von Linien an embryonalen Tag E12.5 oder später 10, 12-14 geboren. In utero Elektroporationen vor E12.5 erfolglos waren in erster Linie auf die Letalität mit Punktion des vierten Ventrikels roofplate, ein notwendiger Schritt bei der Bereitstellung von exogenen DNA, die in die LRL elektroporiert assoziiert ist. Allerdings ergeben sich viele LRL abgeleitet Abstammungslinien von der LRL früher als E12.5 9. Diese früher geboren Linien sind die Neuronen, die den lateralen retikulären umfassen, externe keilig, und olivaris inferior Kerne der precerebellar System, das auf Eingaben aus dem Rückenmark und Cortex zum Kleinhirn 5 verbinden funktionieren. Um zu manipulieren Expression in der LRLvon Embryonen jünger als E12.5, entwickelten wir ein in vitro System, in dem Embryonen in Kultur nach Elektroporation platziert werden. Diese Studie stellt eine effiziente und effektive Methode zur Manipulation der Genexpression von LRL Vorläuferzellen bei E11.5. Embryonen mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) aus der aktiven weitgehend CAG-Promotor gesteuert elektroporiert reproduzierbar GFP exprimierten nach 24 Stunden Kultur. Ein kritischer Aspekt dieses Assays ist, dass die Genexpression wird nur wegen der Expression des exogenen Gens und nicht wegen Nebenwirkungen verändert, die durch die Elektroporation und Kulturverfahren. Es wurde festgestellt, dass das endogene Gen-Expressionsmuster ungestört bleiben in elektroporierte und kultivierten Embryonen. Dieser Test kann verwendet werden, um das Schicksal von Zellen, die aus dem LRL von Embryonen jünger als E12.5 durch die Einführung von Plasmiden zur Überexpression zu verändern oder knock down (durch RNAi) werden von verschiedenen pro-neuronalen Transkriptionsfaktoren.

Diese Studie beschreibt die Entwicklung eines<em&gt; In-vitro-</em&gt; Elektroporation Technik, die für die Manipulation der Genexpression in der unteren rhombischen Lippe Schwangerschaft ab Embryonen erlaubt.

In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen

Die rhombische Lippe ist ein embryonales Neuroepithel im Hinterhirn an der Verbindungsstelle zwischen dem Neuralrohr und der Dachplatte des vierten Ventrikels ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genexpression in embryonalen Rautenhirn-Progenitoren durch die Einführung von Plasmid-DNA mittels Elektroporation zu früheren Zeitpunkten der Trächtigkeit zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen am 11,5. Tag der Trächtigkeit isoliert und in steriler, phosphatgepufferter Salzlösung mit der dorsalen Seite nach oben ausgerichtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, etwa 50 Mikroliter des Expressionsplasmids in 0,01 % Fast Green einzuspritzen.Bei einer erfolgreichen Injektion wird das gesamte Ventrikelsystem mit der DNA-Fast-Green-Mischung gefüllt. Anschließend wird der Embryo einem elektrischen Impuls ausgesetzt. Die Seite des Embryos, die der positiv geladenen Elektrode am nächsten liegt, nimmt die Plasmid-DNA auf.Die andere Seite dient als interne negative Kontrolle. Im letzten Schritt werden die Embryonen für mindestens 24 Stunden in eine Gewebekultur überführt. Letztendlich wird das elektroporierte Gen nach 24-stündiger Kultur exprimiert und kann mittels Immunhistochemie überprüft werden.Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die Manipulation von embryonalen Nachhirn-Vorläuferzellen zu früheren Zeitpunkten der Tragzeit möglich ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in diesem Forschungsbereich zu beantworten, beispielsweise, wie unterschiedliche ural-Gene das Schicksal embryonaler Vorläuferzellen beeinflussen können. Beginnen Sie dieses Verfahren damit, die Dissektionswerkzeuge und den Lamina-Flow-Hood gemäß dem begleitenden Manuskript zu sterilisieren.Um die Embryonen zu gewinnen, stellen Sie eine euthanasierte weibliche Maus, die trächtig mit Embryonen am Gestationstag E 11,5 ist, auf das Präparationsbrett in der Abzugshaube. Besprühen Sie anschließend den Bauch der Maus mit 70 % Ethanol. Öffnen Sie die Bauchhöhle und heften Sie die Bauchdecken an das Präparationsbrett. Ziehen Sie dann die Uterushörner so heraus, dass sie in der Bauchhöhle liegen. Öffnen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Wand des Uterushorns. Entfernen Sie mit einem 20 Millimeter großen Löffel vorsichtig die Embryonen im Dottersack von der Plazenta.Danach die Embryonen in eine 100 Millimeter große Zellkulturschale geben, die mit 10 Milliliter steriler, vorgewärmter 1× PBS vorbefüllt ist. In diesem Schritt den ersten Embryo in eine neue 100 Millimeter große Schale überführen, die mit 10 Milliliter steriler 1× PBS vorbefüllt wurde und auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde.Entfernen und entsorgen Sie anschließend vorsichtig den Dottersack. Positionieren Sie dann das Embryo so, dass die dorsale Seite nach oben zeigt. Halten Sie das Embryo unter einem Dissektionsmikroskop vorsichtig mit den sieben Millimeter großen Elektrodenplatten fest.Platzieren Sie die Elektroden jeweils auf einer Seite des Neuralrohrs auf Höhe des vierten Ventrikels des Zwischenhirns. Danach saugen Sie mit einer 1-cc-Spritze die Mischung aus Plasmid-DNA und 0,01 % Fast Green an; im Allgemeinen sollten 500 Mikroliter der Mischung ausreichen, um mindestens acht bis zehn Embryonen zu elektroporieren. Stich anschließend vorsichtig mit einer 25-Gauge-5/8-Tuberkulin-Nadel, die an der 1-cc-Spritze befestigt ist, die Dachplatte über dem vierten Ventrikel an. Injizieren Sie anschließend etwa 50 Mikroliter der DNA-DI-Mischung in das Ventrikel. Erfolgreiche Injektionen zeichnen sich dadurch aus, dass die DNA-DI-Mischung das gesamte Ventrikelsystem ausfüllt. Eine alternative Methode zur Applikation der DNA-DI-Mischung besteht darin, über eine Punktion des Vellums, das das Mittelhirn überlagert, auf das Ventrikelsystem zuzugreifen, den Impulsgeber einzuschalten und dann fünf Rechteckimpulse mittels eines Elektrodenimpulsgebers und der sieben Millimeter breiten Elektrodenplatten abzugeben, wobei das Gewebe nahe der positiv geladenen Elektrode am stärksten betroffen ist.Überführen Sie anschließend das Plasmid in einem laminaren Luftstromgehäuse und füllen Sie die Vertiefungen einer 12-Loch-Kulturschale mit je zwei Milliliter DME MF 12-Medium, das mit 10 % fetalem Rinderserum, 5 % Pferdeserum, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt und auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Greifen Sie dann das Embryo in der Mitte mit einer Pinzette und entfernen Sie den hinteren Teil des Embryos. Legen Sie den vorderen Teil anschließend in eine der befüllten Vertiefungen der Kulturschale.Wiederholen Sie den Vorgang für alle Embryonen und befüllen Sie nur die äußeren Vertiefungen der 12-Loch-Platte. Um Kontaminationen der Kulturen zu vermeiden, inkubieren Sie die Embryonen 24 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, um das elektroporierte Plasmid exprimieren zu lassen. Falls eine längere Kultivierungszeit gewünscht ist, füllen Sie die äußeren Vertiefungen einer neuen 12-Loch-Schale mit zwei Milliliter D-M-E-M-F-12-Medium.Überführen Sie die Embryonen mit einem sterilisierten Löffel in die Vertiefungen einer neuen Platte. Stellen Sie sie anschließend wieder in den 37 Grad Celsius Inkubator und kultivieren Sie sie bis zu 48 Stunden, um die Embryonen zur Analyse zu fixieren. Füllen Sie eine 12-Loch-Platte mit einmaligem PBS, überführen Sie dann die Embryonen und waschen Sie sie bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang aus.Als Nächstes fixieren Sie die Embryonen in 2% Paraldehyd in einer mal PBS für zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Anschließend spülen Sie sie dreimal in einer mal PBS bei vier Grad Celsius je fünf Minuten lang. Wiederholen Sie dies, nachdem Sie eine neue 12-Well-Platte mit 30% Saccharose in einer mal PBS gefüllt haben.Überführen Sie die Embryonen in diese Vertiefungen und äquilibrieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend werden die Embryonen in der optimalen Schneidetemperatur-Verbindung mit einem Trockeneis-Ethanol-Bad eingebettet oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Abschließend schneiden Sie die Embryonen mit einem Kryostaten in 30-Mikrometer-Schnitte.Montieren Sie sie auf Objektträgern und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius ab. Später hier gezeigte Ergebnisse stellen repräsentative Ergebnisse der Immunhistochemie für GFP an Querschnitten eines elektroporierten E11,5-Embryos nach 24-stündiger Kultur dar. Die hier gezeigten Pfeile weisen auf die Dachplatte hin, die den sekundären Antikörper festhält.Die Ergebnisse zeigen, dass der elektroporierte Bereich der unteren ROIC-Lippe begrenzt war und sich nicht über die gesamte anteroposteriore Achse des Neuralrohrs erstreckte. Hier werden die Ergebnisse von zwei der analysierten Proteine gezeigt: MASH1 und Math1. Wir beobachteten, dass der Großteil der Embryonen nach Elektroporation und Kultur im Vergleich zu den Kontrollembryonen normalen Expressionsniveaus bei 11,5 beibehielt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei sachgemäßer Durchführung in ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den in-vitro-Elektroporationsassay verwendet, um die Genexpression in den Vorläuferzellen der embryonalen Mausmembran zu manipulieren.

in-vitro-electroporation-lower-rhombic-lip-midgestation-mouse

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Techniken zur Manipulation der Genexpression in murinen retinalen Ganglienzellen (RGC)...

In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen

Eine Methode für die Einbeziehung von Plasmid-DNA in murinen Zellen der Netzhaut zum Zwecke der Durchführung entweder gewinnen oder Verlust der Funktion...

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des...

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Wir demonstrieren eine Methode zur Transplantation von kultivierten Zellen in definierte Stellen von frühen Mausembryonen, um ihr in vivo Potenzial zu bestimmen. Wir stellen auch eine optimierte Elektroporationsmethode vor, bei der Glaskapillaren mit bekanntem Durchmesser verwendet werden, was die präzise Abgabe von exogener DNA in einige wenige Zellen in den Embryonen ermöglicht.

Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie verschiedene Regionen im Zentralnervensystem C57BL/6 mittels in utero-Elektroporation spezifisch transfiziert werden. In diesem Protokoll sind detaillierte Anweisungen für Transfektionen von Regionen enthalten, die sich zum Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus lateralis septum lateralis und Striatum entwickeln.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

In dieser Arbeit beschreiben wir eine zeitspezifische Methode, um kritische Entwicklungswege in der Plazenta der Maus in vivo effektiv zu manipulieren. Dies geschieht durch die Injektion und Elektroporation von CRISPR-Plasmiden in die Plazenta trächtiger Muttertiere am Embryonaltag 12.5.

Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

Lernen Sie die In-vitro-Elektroporation zur Manipulation der Genexpression in embryonalen Hinterhirn-Progenitoren von Mäusen. Diese Methode ermöglicht gezielte DNA-Übertragung in frühen Entwicklungsstadien.

In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen

Weitere Videos entdecken