In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genexpression in embryonalen Rautenhirn-Progenitoren durch die Einführung von Plasmid-DNA mittels Elektroporation zu früheren Zeitpunkten der Trächtigkeit zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen am 11,5. Tag der Trächtigkeit isoliert und in steriler, phosphatgepufferter Salzlösung mit der dorsalen Seite nach oben ausgerichtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, etwa 50 Mikroliter des Expressionsplasmids in 0,01 % Fast Green einzuspritzen.

Bei einer erfolgreichen Injektion wird das gesamte Ventrikelsystem mit der DNA-Fast-Green-Mischung gefüllt. Anschließend wird der Embryo einem elektrischen Impuls ausgesetzt. Die Seite des Embryos, die der positiv geladenen Elektrode am nächsten liegt, nimmt die Plasmid-DNA auf.

Die andere Seite dient als interne negative Kontrolle. Im letzten Schritt werden die Embryonen für mindestens 24 Stunden in eine Gewebekultur überführt. Letztendlich wird das elektroporierte Gen nach 24-stündiger Kultur exprimiert und kann mittels Immunhistochemie überprüft werden.

Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die Manipulation von embryonalen Nachhirn-Vorläuferzellen zu früheren Zeitpunkten der Tragzeit möglich ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in diesem Forschungsbereich zu beantworten, beispielsweise, wie unterschiedliche ural-Gene das Schicksal embryonaler Vorläuferzellen beeinflussen können. Beginnen Sie dieses Verfahren damit, die Dissektionswerkzeuge und den Lamina-Flow-Hood gemäß dem begleitenden Manuskript zu sterilisieren.

Um die Embryonen zu gewinnen, stellen Sie eine euthanasierte weibliche Maus, die trächtig mit Embryonen am Gestationstag E 11,5 ist, auf das Präparationsbrett in der Abzugshaube. Besprühen Sie anschließend den Bauch der Maus mit 70 % Ethanol. Öffnen Sie die Bauchhöhle und heften Sie die Bauchdecken an das Präparationsbrett.

Ziehen Sie dann die Uterushörner so heraus, dass sie in der Bauchhöhle liegen. Öffnen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Wand des Uterushorns. Entfernen Sie mit einem 20 Millimeter großen Löffel vorsichtig die Embryonen im Dottersack von der Plazenta.

Danach die Embryonen in eine 100 Millimeter große Zellkulturschale geben, die mit 10 Milliliter steriler, vorgewärmter 1× PBS vorbefüllt ist. In diesem Schritt den ersten Embryo in eine neue 100 Millimeter große Schale überführen, die mit 10 Milliliter steriler 1× PBS vorbefüllt wurde und auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde.

Entfernen und entsorgen Sie anschließend vorsichtig den Dottersack. Positionieren Sie dann das Embryo so, dass die dorsale Seite nach oben zeigt. Halten Sie das Embryo unter einem Dissektionsmikroskop vorsichtig mit den sieben Millimeter großen Elektrodenplatten fest.

Platzieren Sie die Elektroden jeweils auf einer Seite des Neuralrohrs auf Höhe des vierten Ventrikels des Zwischenhirns. Danach saugen Sie mit einer 1-cc-Spritze die Mischung aus Plasmid-DNA und 0,01 % Fast Green an; im Allgemeinen sollten 500 Mikroliter der Mischung ausreichen, um mindestens acht bis zehn Embryonen zu elektroporieren. Stich anschließend vorsichtig mit einer 25-Gauge-5/8-Tuberkulin-Nadel, die an der 1-cc-Spritze befestigt ist, die Dachplatte über dem vierten Ventrikel an.

Injizieren Sie anschließend etwa 50 Mikroliter der DNA-DI-Mischung in das Ventrikel. Erfolgreiche Injektionen zeichnen sich dadurch aus, dass die DNA-DI-Mischung das gesamte Ventrikelsystem ausfüllt. Eine alternative Methode zur Applikation der DNA-DI-Mischung besteht darin, über eine Punktion des Vellums, das das Mittelhirn überlagert, auf das Ventrikelsystem zuzugreifen, den Impulsgeber einzuschalten und dann fünf Rechteckimpulse mittels eines Elektrodenimpulsgebers und der sieben Millimeter breiten Elektrodenplatten abzugeben, wobei das Gewebe nahe der positiv geladenen Elektrode am stärksten betroffen ist.

Überführen Sie anschließend das Plasmid in einem laminaren Luftstromgehäuse und füllen Sie die Vertiefungen einer 12-Loch-Kulturschale mit je zwei Milliliter DME MF 12-Medium, das mit 10 % fetalem Rinderserum, 5 % Pferdeserum, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt und auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Greifen Sie dann das Embryo in der Mitte mit einer Pinzette und entfernen Sie den hinteren Teil des Embryos. Legen Sie den vorderen Teil anschließend in eine der befüllten Vertiefungen der Kulturschale.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Embryonen und befüllen Sie nur die äußeren Vertiefungen der 12-Loch-Platte. Um Kontaminationen der Kulturen zu vermeiden, inkubieren Sie die Embryonen 24 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, um das elektroporierte Plasmid exprimieren zu lassen. Falls eine längere Kultivierungszeit gewünscht ist, füllen Sie die äußeren Vertiefungen einer neuen 12-Loch-Schale mit zwei Milliliter D-M-E-M-F-12-Medium.

Überführen Sie die Embryonen mit einem sterilisierten Löffel in die Vertiefungen einer neuen Platte. Stellen Sie sie anschließend wieder in den 37 Grad Celsius Inkubator und kultivieren Sie sie bis zu 48 Stunden, um die Embryonen zur Analyse zu fixieren. Füllen Sie eine 12-Loch-Platte mit einmaligem PBS, überführen Sie dann die Embryonen und waschen Sie sie bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang aus.

Als Nächstes fixieren Sie die Embryonen in 2% Paraldehyd in einer mal PBS für zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Anschließend spülen Sie sie dreimal in einer mal PBS bei vier Grad Celsius je fünf Minuten lang. Wiederholen Sie dies, nachdem Sie eine neue 12-Well-Platte mit 30% Saccharose in einer mal PBS gefüllt haben.

Überführen Sie die Embryonen in diese Vertiefungen und äquilibrieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend werden die Embryonen in der optimalen Schneidetemperatur-Verbindung mit einem Trockeneis-Ethanol-Bad eingebettet oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Abschließend schneiden Sie die Embryonen mit einem Kryostaten in 30-Mikrometer-Schnitte.

Montieren Sie sie auf Objektträgern und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius ab. Später hier gezeigte Ergebnisse stellen repräsentative Ergebnisse der Immunhistochemie für GFP an Querschnitten eines elektroporierten E11,5-Embryos nach 24-stündiger Kultur dar. Die hier gezeigten Pfeile weisen auf die Dachplatte hin, die den sekundären Antikörper festhält.

Die Ergebnisse zeigen, dass der elektroporierte Bereich der unteren ROIC-Lippe begrenzt war und sich nicht über die gesamte anteroposteriore Achse des Neuralrohrs erstreckte. Hier werden die Ergebnisse von zwei der analysierten Proteine gezeigt: MASH1 und Math1. Wir beobachteten, dass der Großteil der Embryonen nach Elektroporation und Kultur im Vergleich zu den Kontrollembryonen normalen Expressionsniveaus bei 11,5 beibehielt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei sachgemäßer Durchführung in ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den in-vitro-Elektroporationsassay verwendet, um die Genexpression in den Vorläuferzellen der embryonalen Mausmembran zu manipulieren.