Name: Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Lernen Sie einen Fluoreszenz-Reporter-Assay zur Untersuchung von Genen, die die Aufrechterhaltung und Selbsterneuerung von Maus-embryonalen Stammzellen regulieren. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Bewertung der Genfunktion.

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Wir bedanken uns bei Brad Lackford zum Lesen und Editieren des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Research Program Intramural Z01ES102745 (GH) unterstützt.

1. Oct4GiP Maus-ES-Zell-Wartung Oct4GiP Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Austin Smith zur Verfügung gestellt. Sie wurden von den Mäusen, die eine 129/Ola Oct4-Transgen GFPiresPac 4,5 abgeleitet. Sie werden in mit Gelatine beschichteten Gewebekulturplatten in der Esgro komplette plus klonale Grad Medium (Millipore), oder in der M15-Medium: DMEM (Invitrogen) mit 15% FBS, 1000 U / ml Esgro (Millipore), 1x Nicht-ergänzt essentiellen Aminosäuren (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore) und 10 &amp;mgr; M β-Mercaptoethanol. <ol><li> Mantel-Platten mit 0,1% Gelatine (Sigma) bei Raumtemperatur für 30 Minuten (0,1 ml Gelatinelösung / cm 2). </li><li> Tafel Oct4GiP Zellen in mit Gelatine beschichteten Platten bei ~ 2 x 10 4 / cm 2. </li><li> Teilen Sie die Zellen alle zwei Tage mit 0,05% Trypsin. </li></ol> 2. siRNA Transfektion in Oct4GiP Cells Die Oct4GiP Reporter-Assay ist am convenienoder 384-Well-Platten (Corning oder BD) in der M15 Medium - TLY in Gelatine beschichtete Flachboden-96 durchgeführt. Der gesamte Vorgang ist in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> siRNA-Lipid-Komplexen Montage: <ol><li> Für die Transfektion in 96-well Platten, montieren siRNA-Lipid-Komplexen in U-Boden 96-well Platten. </li><li> In jede Vertiefung, mischen 10 pl OptiMEM (Invitrogen) und 0,3 ul Lipofectamin 2000 (Invitrogen) und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> In 5 pmol siRNA an die Lipid-OptiMEM Mischung und Inkubation für weitere 15 Minuten. Die siRNA: Lipid-Verhältnis ist 100 pmol: 6UL. </li><li> Übertragen Sie die siRNA-Lipid-Komplexen in OptiMEM aus der U-Bodenplatte zur Gelatine beschichtete Flachboden-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. </li><li> Für die Transfektion in 384-Well Platten, bereiten Sie die siRNA-Lipid-Komplexen mit 0,1 pl Lipofectamin 2000 und 2 pmol siRNA in 10 ul OptiMEM. </li></ol></li></ol> Hinweis: Die endgültige siRNA-Konzentration inDie Transfektionen beträgt 50 Nm. Führen Sie 3-4 biologischen Wiederholungen für jede siRNA-Transfektion. Richten Sie Master Mischungen der siRNA-Lipid-Komplexen in der U-Bodenplatte und Aliquot in die Flachboden-Gelatine beschichtete Platte. <ol start="2"><li> Oct4GiP Zelle Plating und Transfektion: <ol><li> Für die Transfektion in 96-well Platten, sammeln die Oct4GiP Zellen resuspendieren und sie in frischem Medium M15 bis 9 x 10 4 Zellen / ml. </li><li> Geben Sie 100 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette. </li><li> Mischen der Zellsuspension mit dem Standard-aliquotierte siRNA-Komplexe Lipide in der Vertiefung durch Pipettieren nach oben und unten 3-5 mal. Ändern Sie Tipps für die verschiedenen siRNA Transfektionen. </li><li> Für die Transfektion in 384-Well-Platten, resuspendieren Oct4GiP Zellen zu 6 x 10 4 Zellen / ml und 30 ul Aliquot Zellsuspension in jede Vertiefung. </li></ol></li></ol> Hinweis: Die optimale Zell-Beschichtungs-Dichte ist in der Regel 3 x 10 5 Zellen / cm 2, aber es may erfordern eine weitere Optimierung für siRNAs, die einen dramatischen Einfluss auf das Zellwachstum oder die Lebensfähigkeit. Niedrige Plattierungsdichte kann zu einer schlechten Überleben der Zellen während der Transfektion führen. Hohe Beschichtungs-Dichte führt zu hohen Hintergrund durch hohe Zellkonfluenz induzierte Differenzierung führen. Wenn nötig, Test Beschichtungs-Dichte zwischen 2-4 x 10 5 Zellen / cm 2. <ol start="3"><li> Mittlere Veränderung: <ol><li> Entfernen Sie alte Medium unter Verwendung von Multi-Channel-Aspirator (Corning) oder Vakuum-Zauberstab (VP-Scientific). Achten Sie darauf, um die Zellen an der Unterseite der Platten zu kratzen. </li><li> Führen Sie die Zellen mit frischem ES-Zell-Medium (100 ul für 96-Well-Platte und 30 ul für 384-Well-Platte) mit Mehrkanal-Pipette jeden Tag. </li></ol></li></ol> 3. FACS-Analyse <ol><li> Zelldissoziation: <ol><li> Vier Tage nach der Transfektion zu entfernen Medium mit Mehrkanal-Saugvorrichtung (Corning) oder Vakuum-Stab (VP-Scientific). </li><li> Für 96-well Platten, spülen Sie die Zellen einmal mit 100μl PBS. </li><li> In 25 ul 0,25% Trypsin in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten unter gelegentlichem Schütteln, und die Inaugenscheinnahme zur vollständigen Ablösung der Zellen zu gewährleisten. </li><li> In 90 ul PBS mit 10% FBS, um das Trypsin zu inaktivieren und distanzieren Zellen zu einer einzigen Zellsuspension durch wiederholtes Pipettieren. </li><li> Für 384-well Platten, distanzieren Zellen mit 10 ul Trypsin und Quench mit 30 ul PBS mit 10% FBS. </li></ol></li><li> FACS-Analyse: <ol><li> Analysieren Sie die GFP-Fluoreszenz auf der BD LSRII FACS-Analyzer mit dem HTS-Gerät oder einen anderen ähnlich ausgestatteten FACS-Analyser (wie Accuri oder Intellicyt) ausgestattet. </li><li> Verwenden Sie das High-Throughput-Modus auf der HTS und analysieren 10 ul Zellsuspension. Sie können die Anzahl Schwellenwert bis 1,0 x 10 4 Zellen. </li><li> Passen PMT-Spannung und Schwelle, um die Zellen in der Vorwärts-vs-Seite Streudiagramm zu erfassen. Tor für die Live-Zell-Population in der vorwARD vs side-Streudiagramm. </li><li> Erstellen Sie ein Histogramm Plot für die GFP-Kanal. Sie das Tor in der GFP-Kanal, so dass ~ 10% der Zellen zu sein GFP-negativen in den mock-Steuerelement oder-siRNA transfizierten Zellen zu sehen. </li><li> Bestimmen% GFP-negativen Zellen aus jeder Behandlung: Differenzierte Zellen% =% GFP-negativen Zellen. Vergleichen Sie die% Differenzierte Zellen zwischen Experimental-und Kontroll-siRNA-Transfektionen mit 2-tailed t-Test, und erreichen Sie die positive Treffer mit p-Werte &lt;0,01. </li></ol></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Oct4, Nanog und Sox2 sind drei Gene, die eine entscheidende Rolle spielen bei der Aufrechterhaltung der ES-Zell-Selbsterneuerung 6,7,9-11. Abbildung 2 zeigt, dass die Oct4GiP Reporter-Assay leicht erkennen kann, die Differenzierung durch Schweigen zu dieser Faktoren in der verursachte Oct4GiP ES-Zellen. 2A zeigt die Oct4GiP ES-Zellen sind GFP-positive, wenn sie als ES beibehalten<html> Zellen. 2B zeigt die Seite nach vorne vs Streudiagramm und das Histogramm des GFP-Kanal der Oct4GiP Zellen mit dem Kontroll-oder Oct4-siRNAs transfiziert. Es ist notwendig, Gate für lebende Zellen in der vorderen Seite vs Streudiagramm, wie die toten Zellen und Zelltrümmer zu GFP-negativ sind und Hintergrund zu erhöhen. Auf der anderen Seite, Wams, um mögliche Diskriminierungen Zellklumpen auszuschließen ist nicht immer erforderlich. In den Kontroll-siRNA transfizierten Zellen sollte die überwiegende Mehrheit der Zellen zu sein GFP-positiven. Wenn offensichtlich GFP-negativen Populationen in den Kontroll-siRNA transfiziert Brunnen sind, können die Start Oct4GiP Zellen oder die Transfektion Verfahren kompromittiert worden sind und das Ergebnis kann nicht interpretiert werden. 2C zeigt die Balkenanzeige von% Differenzierte Zellen (% Differenzierte Zellen =% GFP-negativen Zellen) von Kontroll-, Oct4-, Nanog-und Sox2-siRNA transfizierten Zellen. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Gliederung des Oct4GiP Reporter-Assay. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> Abbildung 2. Oct4GiP Reporter-Assay kann erkennen, ES-Zell-Differenzierung durch Nanog, Oct4, Sox2 oder Silencing verursacht. A) E14Tg2a (Wild-Typ, schwarze Linie) und Oct4GiP (grüne Linie) Zellen wurden durch FACS analysiert. Histogramm der GFP-Kanal zeigt, dass Oct4GiP Zellen GFP-positiv sind. B) Oct4GiP Zellen wurden in 96-well Platten mit dem Control-oder Oct4-siRNA transfiziert und FACS analysiert 4 Tage nach der Transfektion. Vorwärts vs Seite Streudiagramme und Histogramme des GFP-Kanal der transfizierten Zellen gezeigt werden. C) Oct4GiP Zellen wurden mit der Steuer-, Nanog-, Oct4-oder siRNA-Sox2. Die% differenzierten Zellen vom% GFP-negativen Zellen 4 Tage nach der Transfektion bestimmt und wurde aufgetragen als Mittelwert + / - Standardfehler des Mittelwertes (n = 4).f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+potency+by+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
<li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li>
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<li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li>
<li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li>
<li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
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<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Oct4GiP Reporter-Assay beschreiben wir oben kann quantitativ messen das Ausmaß der Selbst-Erneuerung vs Differenzierung. Im Vergleich zu anderen verfügbaren Verfahren, wie die Morphologie-basierten 12 und Proliferation / Lebensfähigkeit-basierten Assays, bietet eine höhere Empfindlichkeit und Durchsatz sowie eine direkte Messung der ES-Zelle Zustand. Es wird daher auch für große Bildschirme und genetische Analyse Epistasie geeignet. In der Tat haben wir und andere erfolgreich das Oct4GiP Reporter-Assay fü...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Esgro komplette plus klonale Klasse Medium </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (high Glucose-1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (Serum-Medium zu reduzieren) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Esgro mLIF (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (Nicht-essentielle Aminosäuren) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> 100x Nucleosides für ES-Zell- </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-qualifizierte Rinderfötenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> Nanog siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046.256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058.489-01 </td></tr></tbody></table> Kontroll-siRNA: siRNA-Duplex Targeting Glühwürmchen-Luciferase (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) durch Dharamcon synthetisiert.

oct4gip reporter assay auf gene, die maus embryonalen stammzellen wartungs-und self-study erneuerung regulate

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotenz und Selbsterneuerung sind zwei definierenden Eigenschaften von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen). Das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismus wird dadurch wesentlich erleichtert den Einsatz von ES-Zellen für Entwicklungsbiologie Studien, Krankheit Modellierung, der Wirkstoffforschung und in der regenerativen Medizin (Übersicht in 1,2). Um die Identifizierung und Charakterisierung neuer Regulatoren der ES-Zell-Wartungs-und Selbst-Erneuerung beschleunigen, entwickelten wir eine Fluoreszenz-Reporter-basierter Assay zur quantitativen Messung der Selbst-Erneuerung Status in Maus-ES-Zellen unter Verwendung des Oct4GiP Zellen 3. Die Oct4GiP Zellen exprimieren das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des Oct4-Gen Promotor-Region 4,5. Oct4 ist für ES-Zell-Selbsterneuerung benötigt, und ist stark in ES-Zellen exprimiert und schnell herunter reguliert während der Differenzierung 6,7. Als ein Ergebnis korreliert GFP-Expression und Fluoreszenz in den Reporter-Zellen treumit dem ES-Zell-Identität 5 und Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-Analyse kann verwendet werden, die sorgfältige Überwachung der Selbst-Erneuerung Status der Zellen auf der Ebene der Einzelzelle 3,8 sein. Gekoppelt mit RNAi, kann die Oct4GiP Reporter Assay verwendet, um schnell zu identifizieren und zu untersuchen Regulatoren der ES-Zell-Wartungs-und Selbst-Erneuerung 3,8 sein. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Bestimmung von Selbst-Erneuerung, ist es bequemer, einfühlsam, quantitative und von geringeren Kosten. Es kann in 96 durchgeführt werden - oder 384-Well-Platten für eine groß angelegte Studien wie High-Throughput-Screens oder genetische Analyse Epistasie. Schließlich wird unter Verwendung anderen Linie-spezifischen Reporters ES-Zelllinien, kann der Assay hier beschriebenen auch modifiziert werden, Determination während der ES-Zelldifferenzierung zu untersuchen.

Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Reporter-Assay schnell zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Selbst-Erneuerung zu regulieren.

Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

Pluripotenz und Selbsterneuerung sind zwei definierende Merkmale embryonaler Stammzellen (ES-Zellen). Das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen wird ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, schnell die Rolle des interessierenden Gens bei der Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung von embryonalen Stammzellen der Maus oder ES-Zellen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Transfektions-Master-Mix hergestellt wird, das zur Stilllegung der Gene von Interesse verwendet wird. Als zweiter Schritt.Die Transfektions-Master-Mix wird auf eine mit Gelatine beschichtete Platte übertragen und die T 4G IP-Zellen werden hinzugefügt. Die Zellen werden anschließend unter normalen Kulturbedingungen für ES-Zellen kultiviert, um die Wirkung der Genstilllegung sichtbar werden zu lassen. Nach vier Tagen Kultivierung werden die Zellen von der Platte gelöst und ihr Selbstvermehrungsstatus mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Letztendlich können Unterschiede im Prozentsatz der GFP-negativen Zellen zwischen den kontroll- und experimentell mit siRNA transfizierten T 4G IP-Zellen mittels FACS ausgewertet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Analyse der Zellmorphologie oder der Analyse von Linienmarkern liegt darin, dass sie eine höhere Empfindlichkeit und Durchsatzleistung bietet und sich daher besser für genetische Bildschirme mittlerer bis großer Skala oder für die Analyse genetischer Epistasen eignet. Diese Methode kann die Untersuchung der für die ESL-Maintenanz und -Selbsterneuerung wichtigen Gene erheblich vereinfachen. Außerdem kann sie an die während der ESL-Differenzierung auftretenden Selbstspezifikationsereignisse angepasst werden.T 4G IP-Zellen werden in mit Gelatine beschichteten Platten kultiviert. Sie werden mit einer Dichte von etwa zwei mal 10 hoch vier pro Quadratzentimeter ausgesät und alle zwei bis drei Tage für die Transfektion weitergepasst. Beginnen Sie in 96-Well-Flachbodenplatten damit, die Platte mit 0,1 % Gelatine zu beschichten, bereiten Sie anschließend die Master-Mix-Lösung aus Optum und Lipectomy 2000 vor und portionieren Sie diese in eine 96-Well-U-Bodenplatte.Die Platte fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann fünf Pikomol I a zur Lipid-Optimum-Mischung hinzufügen und weitere 15 Minuten inkubieren. Anschließend Gelatine von der 96-Well-Flachbodenplatte entfernen und mit einer Mehrkanalpipette die i a-Lipid-Komplexe in Optimum von der U-Bodenplatte auf die Flachbodenplatten übertragen. Danach die OC 4G IP-Zellen sammeln und in frischem M 15-Medium auf neun mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter resuspendieren.Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter der Zellsuspension in jedes Loch einer 96-Loch-Flachbodenplatte zu geben, und pipettieren Sie drei bis fünf Mal auf und ab, um die Zellsuspension mit dem vorherigen Eloqua zu mischen. Sir, Lipidkomplexe, wobei die Pipettenspitzen für verschiedene Sira gewechselt werden, transfectieren Sie anschließend und stellen Sie die Platten in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Kultivieren Sie die Zellen vier Tage lang. Entfernen Sie an jedem Kultivierungstag vorsichtig das alte Medium mit einem Mehrkanal-Aspirator, wobei Sie darauf achten müssen, die Zellen am Boden der Platten nicht zu beschädigen.Verwenden Sie dann vier Tage nach der Transfektion eine Mehrkanalpipette, um die Zellen mit 100 Mikroliter frischem ES-Zellmedium zu versorgen. Entfernen Sie das Medium mit einem Mehrkanal-Aspirator und waschen Sie die Zellen einmal mit 100 Mikroliter PBS. Geben Sie anschließend mit einer Mehrkanalpipette 25 Mikroliter 0,25 %iger Trypsin-Lösung zu jeder Probe hinzu.Die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur unter gelegentlicher Schüttelung gut inkubieren. Danach die Platte visuell überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig abgelöst sind. 90 Mikroliter PBS mit 10 % FBS hinzufügen, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen, und die Zellsuspension mehrmals auf- und abpipettieren, um die Zellen in eine Einzelzell-Suspension zu dissoziieren.Verwenden Sie abschließend den Hochdurchsatzmodus der HTS-Einheit eines Fax-Analysators, um 10 Mikroliter der Zellsuspension zu analysieren. Stellen Sie die Zähl-Schwelle auf 1,0 × 10⁴ Zellen ein und passen Sie die PMT-Spannung an, um die Zellen im Vorwärts- versus Seitenstreuungsdiagramm darzustellen. Legen Sie das Analysefenster für die Population lebender Zellen im Vorwärts- versus Seitenstreuungsdiagramm fest und erstellen Sie anschließend ein Histogrammdiagramm für den GFP-Kanal.Einstellen des Tors im GFP-Kanal, sodass etwa 10 % der Zellen in den unbehandelten oder kontrollierten SINA-transfizierten Zellen als GFP-negativ erscheinen, um den Prozentsatz differenzierter Zellen basierend auf dem Anteil der GFP-negativen Zellen zu bestimmen. Für jede Behandlung. Vergleich des Prozentsatzes differenzierter Zellen zwischen experimentellen und Kontroll-iRNA-transfizierten Zellen.Diese erste Abbildung zeigt, dass die Wildtyp-E14-TG2A-Zellen, dargestellt durch das schwarze Histogramm, negativ für GFP sind, während die T4G-IP-Zellen, dargestellt durch das grüne Histogramm, positiv für GFP sind, solange sie als ES-Zellen kultiviert werden, wie in den folgenden beiden Abbildungen gezeigt. Vorwärts- versus Seitwärtsstreuungsdiagramme und Histogramme des GFP-Kanals von T4G-IP-Zellen vier Tage nach Transfektion mit Kontroll- oder T4-siRNAs sind in den Streudiagrammen dargestellt. Lebende Zellen werden zunächst im Vorwärts- versus Seitwärtsstreuungsdiagramm ausgewählt, da tote Zellen und Zelltrümmer GFP-negativ sind und eine erhöhte Hintergrundfluoreszenz aufweisen, wie an den Histogrammdaten in den Kontrollen zu erkennen ist. In den mit irna transfizierten Zellen sind die überwiegende Mehrheit der Zellen GFP-positiv.Diese Balkendiagramme zeigen den Prozentsatz differenzierter Zellen von Kontroll-Nano OCT vier und SOX zwei, siRNA-transfizierten OCT 4G IP-Zellen vier Tage nach der Transfektion. In allen Fällen wiesen die siRNA-transfizierten Zellen, wie erwartet, höhere Differenzierungsgrade auf als die Kontrollen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie pro 96-Well-Platte innerhalb einer Stunde Hands-on-Zeit durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Oxford GIP-Reporter-Assay verwendet, um schnell die Rolle Ihres Gens von Interesse bei der Aufrechterhaltung der mausartigen ESL zu bestimmen.

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Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Die Stemgent Dox Inducible Maus TF Lentivirus Set kann embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) neu zu programmieren. Hier haben wir das Protokoll für DOX-induzierbare Expression von Maus Umprogrammierung Transkriptionsfaktoren Oct4 zu demonstrieren, Sox2, Klf4 und c-Myc iPS Kolonien, die ausdrückliche gemeinsamen mES Pluripotenz Marker zu generieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

SC1 Funktionen durch duale Hemmung des Ras-GAP und ERK1. Wir testeten die Funktion von SC1 in Unterstützung von Maus ES-Zell-Selbst-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF und zeigte, dass SC1 in der Lage, sich selbst zu erneuern von Maus-ES-Zellkulturen zu halten ist.

Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support

Dieses Video zeigt eine Technik zur Beurteilung der Retinsäureaktivität in Mausembryonen. Nach der Isolierung von Zellen aus den Mausembryonen werden die Zellen mit Retinsäure (RA)-Reporterzellen co-kultiviert. Embryonale Zellen produzieren RA, die die Beta-Galactosidase-Expression in Reporterzellen induziert, was auf die RA-Aktivität in den embryonalen Zellen hinweist.

Einsatz von Reporterzellen in einer Co-Kultur zur Untersuchung der Retinsäureproduktion durch embryonale Zellen der Maus

Einzelzell-Genexpression Test wird für das Verständnis der Stammzell Heterogenitäten benötigt.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

In dieser Studie erzeugen wir induzierte pluripotente Stammzellen aus Fruchtwasserzellen der Maus unter Verwendung eines nicht-viralen Transposon-Systems.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Hier stellen wir ein quantitatives und skalierbares Protokoll vor, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchzuführen.

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.

Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

Dieses Protokoll misst quantitativ die Stabilität und Halbwertszeit intergener und intragenischer Enhancer-RNAs in embryonalen Mausstammzellen mittels Actinomycin-D-Behandlung, RT-qPCR und nichtlinearer Regressionsanalyse. Positionsspezifische Normalisierungsstrategien werden integriert, um die Zerfallsdynamik von eRNA kontextabhängig genau zu modellieren.

Optimierte quantitative Bewertung der Stabilität der Enhancer-RNA in embryonalen Mausstammzellen

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Lernen Sie einen Fluoreszenz-Reporter-Assay zur Untersuchung von Genen, die die Aufrechterhaltung und Selbsterneuerung von Maus-embryonalen Stammzellen regulieren. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Bewertung der Genfunktion.

Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

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