Visualisierung und Analyse des Blutflusses und der Sauerstoffverbrauch in hepatischen Mikrozirkulation: Anwendung auf eine akute Hepatitis-Modell

Es wurde ein optisches System entwickelt, um die hepatische Mikrozirkulation mit fluoreszenzmarkierten Erythrozyten sichtbar zu machen und den Sauerstoffpartialdruck in den Mikrogefäßen mit lasergestützten Phosphobildern zu messen. Mit dieser Methode können physiologische und pathologische Mechanismen untersucht werden, indem die mikrovaskuläre Struktur, der Durchmesser, die Blutflussgeschwindigkeit und die Sauerstoffspannung analysiert werden. Bei der hepatischen Mikrozirkulation fließt das Blut von der Pfortader-ES zum zentralen ES, wodurch ein Sauerstoffgradient zwischen den beiden entsteht.

Die Sauerstoffkonzentration in der Leber beeinflusst sowohl die Enzymexpression als auch die Pathologie, indem sie die Durchblutungsanalyse und die Sauerstoffmessung durchführt. Wichtige Themen der Forschung. Unsere experimentelle Methode beinhaltet die intravenöse Verabreichung von roten Blutkörperchen, die mit Fluoreszenz markiert sind.

Um die Mikrozirkulation mittels Fluoreszenz für die Sauerstoffpartialdruckmessung sichtbar zu machen, verabreichen wir intravenös Palladiumporphyrin, das bei Anregung durch einen Laser in einem von der Konzentration des umgebenden Sauerstoffs abhängigen Maße phosphoreszierend im Blutkreislauf emittiert. Dieses Verfahren ermöglicht die quantitative Analyse von Sauerstoff, die Messung des Partialdrucks und der hepatischen Mikrozirkulation ergab einen portalen und zentralen venalen Sauerstoffpartialdruck von 59,8 bzw. 38,9 Millimetern Quecksilber, was eine effektive Messung der Sauerstoffkonzentration zeigt. Als nächstes haben wir diese Methodik auf ein Hepatitis-Modell angewendet.

Wir fanden einen erhöhten Sauerstoffpartialdruck in portalen ES sinusförmigen und zentralen es, aber eine verringerte Druckdifferenz zwischen portalen und zentralen es. Dies ist wahrscheinlich auf einen verminderten Sauerstoffverbrauch im zentralen Venenbereich aufgrund der Hepatozytennekrose zurückzuführen. Diese Ergebnisse zeigen, dass unsere Methodik, ein optisches System zur Messung der hepatischen Hämodynamik und des Sauerstoffverbrauchs zu verwenden, in der Lage ist, Mechanismen verschiedener Lebererkrankungen in der hepatischen Mikrozirkulation aufzuklären.

Der Sauerstoffgradient ist ein wesentlicher Parameter, der die Expression von Enzymen in periportalen und parazentralen Regionen betrifft, Arten von Lebererkrankungen, die mit Mikroverteilungen zusammenhängen, daher ist es wichtig, den Blutfluss und den Sauerstoffverbrauch zu quantifizieren. Um die Mechanismen zu klären, besteht der Vorteil unserer Methode darin, dass die berührungslose und kontinuierliche optische Messung den Blutfluss, die Durchmesser der Blastengefäße und den Sauerstoffgradienten in der hepatischen Mikrozirkulation quantifizieren kann. Einer Spendermaus wurde Vollblut entnommen und die Erythrozyten wurden zweimal mit PBS durch Zentrifugation bei 400 G für fünf Minuten gewaschen.

Als nächstes lösen Sie zwei Milligramm FITC in einem Milliliter, 100 Millimolar DI-Natriumhydrogenphosphat, bevor Sie durch eine 0,2-Mikron-Porenmembran filtrieren. Als nächstes geben Sie eine FITC-Lösung von einem Milliliter in ein Reagenzglas zusammen mit einer 0,15 Milliliter dreimillimolaren dexteraren Lösung, einem 0,25 Milliliter 180 Millimolar DI Natriumhydrogenphosphat und einem 1,5 Milliliter 100 Millimolar DI Natriumhydrogenphosphat und klopfen Sie es zum Mischen. Halten Sie es zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die verschmutzten Erythrozyten zweimal mit PBS waschen.

Geben Sie als Nächstes eine kleine Menge RBC-Suspension auf einen Objektträger und bestätigen Sie sowohl das normale Erythrozyten-Aussehen als auch eine ausreichende Fluoreszenz suspendieren Sie 0,1 Milliliter RBCs in 0,9 Milliliter PBS und halten Sie es bis zur nächsten Verwendung 500 Milligramm BSA in 10 Millilitern PBS. Fügen Sie dann 30 Milligramm Palladiumporphyrin hinzu und rühren Sie über Nacht Zentrifuge, die Lösung, um ungelöstes Palladiumporphyrin zu entfernen Und filtrieren Sie das SUP Natin durch eine 0,2 Mikron Po-Membran eloquent, einen Milliliter Filtrat in Reagenzgläser und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Darauf geachtet, dass wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermieden wird.

Um die Mikrozirkulation mikroskopisch sichtbar zu machen, schneiden Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 20 Millimetern in eine Kunststoffplatte und decken Sie das Loch mit einem quadratischen Deckglas ab, das 30 Millimeter zur Seite steht. Spreizen Sie den Hauptlebertappen in Bauchlage, nachdem Sie eine Schwanzvene kanüliert haben. Verwenden Sie als Nächstes mehrere drei Millimeter mal acht Millimeter große Abschnitte aus Lebensmittelfolie, um den Bereich um den Lappen herum abzudecken, um Bewegungen durch Atmung und Austrocknen zu verhindern.

Visualisieren Sie den Leberkreislauf mit einem Transmissionsmikroskop und bestätigen Sie, dass es mindestens 15 Minuten lang keine Stasis des Blutflusses im Sichtfeld gibt. Um den Blutfluss zu beobachten, injizieren Sie allmählich. Zeigen Sie zwei Milliliter fluoreszenzmarkierter Erythrozyten.

Zur Messung des Sauerstoffpartialdrucks werden 0,2 Milliliter Palladium-Porphyrin-Lösung injiziert. FITC-markierte RBCs machen ein 50stel aller im Umlauf befindlichen RBCs im sichtbaren Bereich aus, regen Sie den FITC an, indem Sie ihn mit einer Quecksilberlampe bestrahlen, die durch einen 450 bis 490 Nanometer Bandpassfilter geleitet wird, und zeichnen Sie die Fluoreszenz mit einer CCD-Kamera auf. Die Palladium-Porphyrin-Phosphoreszenz ist relativ schwach und erfordert einen hochempfindlichen Detektor und einen abgedunkelten Raum.

Die Absorptionsspitzen von Palladiumporphyrin liegen bei etwa 410 und 532 Nanometern, und die zweite harmonische Wellenlänge von 532 Nanometern wird empfohlen. Diese Wellenlänge wird von einem Neodym-YAG-Pulslaser erzeugt, der den Laserstrahl mit einem inversen Mikroskop verbindet und sich so einstellt, dass der Strahl die Mitte der Brennebene beleuchtet. Die räumliche Auflösung des Lasers ist abhängig von der Spotgröße, die durch den Durchgang des Strahls durch eine Lochblende eingestellt werden kann.

Befestigen Sie ebenfalls einen Langpassfilter und eine Photomultiplier-Röhre am Mikroskop, um Phosphoreszenz zu erkennen. Das PMT sollte empfindlich auf rote Wellenlängen reagieren, insbesondere auf etwa 700 Nanometer. Samplen Sie das phosphoreszierende Signal ab und berechnen Sie die Abklingzeitkonstante, indem Sie eine Exponentialfunktion anwenden.

In diesem Experiment haben wir 500 Punkte bei 200 Kilohertz abgetastet. Zur Kalibrierung werden zwei Palladiumporphyrinlösungen mit einem Sauerstoffpartialdruck von je 150 und null Millimeter Quecksilber hergestellt. Für die null Millimeter Quecksilberlösung fügen Sie den Proben 1 %Dihi-Natrium hinzu, um den Zustand zu schaffen, in dem während der Kalibrierung kein Sauerstoff vorhanden ist.

Halten Sie einen pH-Wert der Probe von 7,4 und eine Temperatur von 37 Grad Celsius aufrecht. Positionieren Sie die Maus auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie die Mikrogefäße, für die Sie die hepatische Mikrozirkulation visualisieren möchten, auf den Punkt ein, an dem der Laser schnelle Mäuse mit freiem Zugang zu Wasser über Nacht erkennt, injizieren Sie Paracetamol in einer Dosis von 200 Milligramm pro Kilogramm intraperitoneal 24 Stunden nach der Injektion, betäuben Sie die Maus und legen Sie die Leber mit einem mittleren Schnitt frei. Liegt eine Hepatitis vor, ist diese durch eine Nekrose im parazentralen Bereich mit bloßem Auge gut sichtbar.

Unsere Messung des Sauerstoffpartialdrucks und der hepatischen Mikrogefäße bei Mäusen zeigte einen mittleren Sauerstoffdruck für Pfortader, Sinusböden und zentrale V-Strahlen von 59,8, 48,2 bzw. 38,9 Millimetern Quecksilber. Mit anderen Worten, der Sauerstoffgradient vom Portal zum zentralen ES deutet auf eine ausreichende Freisetzung von Sauerstoff aus den Erythrozyten hin, wenn sie die Sinuskurven passieren. Wir präparierten Paracetamol-induzierte Hepatitis-Mäuse zur Messung von hepatischen Mikrogefäßen.

Als Beispiel für ein pathologisches Modell fanden wir heraus, dass die Sauerstoffpartialdrücke in Pfortadersten, sinusförmigen und zentralen Es in der Paracetamol-Gruppe im Vergleich zu normalen Mäusen höher waren. Die Sauerstoffpartialdruckdifferenz zwischen Portal- und Zentral-V betrug 20,9 Millimeter Quecksilbersäule für normale Mäuse und 16,9 Millimeter Quecksilbersäule für die Hepatitis-Modellmäuse. Die Sauerstoffpartialdruckdifferenz zwischen Portal- und Zentral-V betrug 20,9 Millimeter Quecksilbersäule für normale Mäuse und 16,9 Millimeter Quecksilbersäule für die Hepatitis-Modellmäuse.

Der Sauerstoffgradient in der hepatischen Mikrozirkulation entsteht hauptsächlich aufgrund der Zufuhr von Sauerstoff aus dem Pfortader, der von den Hepatozyten verbraucht wird, die durch Paracetamol verursachte Hepatozytennekrose im zentralen venalen Bereich führt zu einem verminderten Sauerstoffverbrauch, einer nachgeschalteten Mikrozirkulation und damit zu Problemen im Zusammenhang mit der Hämodynamik. Die Sauerstoffversorgung und der Sauerstoffverbrauch sind an vielen Formen von Lebererkrankungen beteiligt. Wir haben ein Modell der akuten Hepatitis erstellt und einen Anstieg der Sauerstoffspannung in den Mikrogefäßen festgestellt.

Mit unserem optischen System können physiologische und pathologische Mechanismen untersucht werden, indem die mikrovaskuläre Struktur, eher die Strömungsverteilung und der Sauerstoffverbrauch analysiert werden.