Visualisierung und Analyse des Blutflusses und der Sauerstoffverbrauch in hepatischen Mikrozirkulation: Anwendung auf eine akute Hepatitis-Modell

Es wurde ein optisches System entwickelt, um die hepatische Mikrozirkulation mit fluoreszenzmarkierten Erythrozyten sichtbar zu machen und den Sauerstoffpartialdruck in den Mikrogefäßen mittels laserunterstützter Phosphor-Bildgebung zu messen. Diese Methode kann zur Untersuchung physiologischer und pathologischer Mechanismen eingesetzt werden, indem die mikrovaskuläre Struktur, der Durchmesser, die Blutflussgeschwindigkeit und die Sauerstoffspannung analysiert werden. In der hepatischen Mikrozirkulation fließt das Blut von den portalen ES zu den zentralen ES und erzeugt dabei einen Sauerstoffgradienten zwischen beiden.

Die Sauerstoffkonzentration in der Leber beeinflusst sowohl die Enzymexpression als auch die Pathologie, wodurch die Analyse des Blutflusses und die Sauerstoffmessung zu wichtigen Forschungsthemen werden. Unsere experimentelle Methode beinhaltet die intravenöse Verabreichung von mit Fluoreszenzmarkierung versehenen roten Blutkörperchen.

Um die Mikrozirkulation mittels Fluoreszenz zur Messung des Sauerstoffpartialdrucks sichtbar zu machen, verabreichen wir intravenös Porphyrin-Palladium, das im Blutstrom phosphoreszierend leuchtet, wenn es durch einen Laser angeregt wird, wobei die Emission von der Konzentration des umgebenden Sauerstoffs abhängt. Dieser Prozess ermöglicht eine quantitative Analyse des Sauerstoffs; die Messung des Partialdrucks in der hepatischen Mikrozirkulation zeigte einen portalen und zentralvenösen Sauerstoffpartialdruck von 59,8 bzw. 38,9 Millimeter Quecksilbersäule, was eine effektive Bestimmung der Sauerstoffkonzentration belegt. Anschließend wandten wir diese Methodik auf ein Hepatitis-Modell an.

Wir fanden einen erhöhten Sauerstoffpartialdruck in den portalen ES-sinusoidalen Bereichen und im zentralen ES, jedoch eine verminderte Druckdifferenz zwischen dem portalen und dem zentralen ES. Dies ist wahrscheinlich auf eine verminderte Sauerstoffverbrauch im zentralen Ven-Bereich aufgrund einer Hepatozytennekrose zurückzuführen. Diese Ergebnisse zeigen, dass unsere Methodik, ein optisches System zur Messung der hepatischen Hämodynamik und des Sauerstoffverbrauchs zu verwenden, in der Lage ist, Mechanismen verschiedener Lebererkrankungen in der hepatischen Mikrozirkulation aufzuklären.

Der Sauerstoffgradient ist ein wesentlicher Parameter, der die Expression von Enzymen in periportalen und parazentralen Regionen sowie Arten hepatischer Erkrankungen in Zusammenhang mit mikroverteilungsbedingten Faktoren beeinflusst, weshalb es wichtig ist, den Blutfluss und den Sauerstoffverbrauch zu quantifizieren. Um die Mechanismen aufzuklären, liegt der Vorteil unserer Methode in der berührungslosen und kontinuierlichen optischen Messung, die Blutfluss, Gefäßdurchmesser und Sauerstoffgradient in der hepatischen Mikrozirkulation quantifizieren kann. Vollblut wurde von einer Spendemaus entnommen, und die Erythrozyten wurden zweimal mit PBS durch Zentrifugation bei 400 G für fünf Minuten gewaschen.

Lösen Sie als Nächstes zwei Milligramm FITC in einem Milliliter, 100 Millimolar DI-Natriumhydrogenphosphat, bevor Sie die Lösung durch eine Membran mit 0,2-Mikrometer-Poren filtern. Geben Sie danach ein Milliliter FITC-Lösung in ein Reagenzglas, zusammen mit 0,15 Milliliter dreimillimolarer Dextran-Lösung, 0,25 Milliliter 180 Millimolar DI-Natriumhydrogenphosphat und 1,5 Milliliter 100 Millimolar DI-Natriumhydrogenphosphat, und klopfen Sie leicht, um zu mischen. Lagern Sie die Probe zwei Stunden bei Raumtemperatur, bevor die gefärbten Erythrozyten zweimal mit PBS gewaschen werden.

Als Nächstes eine kleine Menge der Erythrozytensuspension auf einen Objektträger geben und sowohl das normale Erscheinungsbild der Erythrozyten als auch eine ausreichende Fluoreszenz überprüfen. 0,1 Milliliter Erythrozyten in 0,9 Milliliter PBS suspendieren und bis zur weiteren Verwendung bei 4 Grad Celsius lagern. Danach 500 Milligramm BSA in 10 Milliliter PBS lösen. Anschließend 30 Milligramm Palladium-Porphyrin zugeben und über Nacht umrühren. Die Lösung zentrifugieren, um ungelösten Palladium-Porphyrin zu entfernen, und das Überstand durch eine 0,2-Mikrometer-Filtermembran filtrieren. Einen Milliliter des Filtrats in Reagenzgläser abfüllen und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Dabei darauf achten, wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.

Um die Mikrozirkulation mikroskopisch darzustellen, schneiden Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 20 Millimetern in eine Kunststoffplatte und bedecken Sie das Loch mit einem quadratischen Deckglas von 30 Millimetern Seitenlänge. Legen Sie das Hauptleberlappen nach Kanülierung einer Schwanzvene in Bauchlage auf eine Kunststoffplatte. Bedecken Sie anschließend den Bereich um das Leberlappen mit mehreren Abschnitten aus Kunststoff-Folie der Größe drei Millimeter mal acht Millimeter, um Bewegungen durch die Atmung und Austrocknung zu verhindern.

Visualisieren Sie den hepatischen Kreislauf mit einem Durchlichtmikroskop und bestätigen Sie, dass mindestens 15 Minuten lang keine Stase des Blutflusses im Sichtfeld auftritt. Um den Blutfluss zu beobachten, injizieren Sie schrittweise 0,2 mL fluoreszenzmarkierter Erythrozyten.

Um den Sauerstoffpartialdruck zu messen, injizieren Sie 0,2 Milliliter Palladium-Porphyrin-Lösung. Die mit FITC markierten Erythrozyten machen ein Fünfzigstel aller im durchbluteten Bereich zirkulierenden Erythrozyten aus. Erregen Sie das FITC, indem Sie es mit einer Quecksilberlampe bestrahlen, die durch einen 450 bis 490 Nanometer Bandpassfilter geleitet wird, und nehmen Sie die Fluoreszenz mit einer CCD-Kamera auf. Die Phosphoreszenz von Palladium-Porphyrin ist relativ schwach und erfordert einen hochsensitiven Detektor sowie einen abgedunkelten Raum.

Die Absorptionsmaxima von Palladium-Porphyrinen liegen bei etwa 410 und 532 Nanometern, wobei die zweite Harmonische mit 532 Nanometern empfohlen wird. Diese Wellenlänge wird mit einem gepulsten Neodym-YAG-Laser erzeugt, dessen Laserstrahl mit einem umgekehrten Mikroskop verbunden und so justiert wird, dass der Strahl die Mitte der Fokusebene beleuchtet. Die örtliche Auflösung des Lasers hängt von der Spotgröße ab, die durch das Durchleiten des Strahls durch eine Lochblende angepasst werden kann.

Befestigen Sie einen Langpassfilter und eine Photomultiplier-Röhre am Mikroskop, um die Phosphoreszenz zu detektieren. Die PMT sollte empfindlich gegenüber roten Wellenlängen sein, insbesondere im Bereich von 700 Nanometern. Nehmen Sie das phosphoreszierende Signal auf und berechnen Sie die Zerfallszeitkonstante durch Anwendung einer exponentiellen Funktion.

In diesem Experiment haben wir 500 Punkte bei 200 Kilohertz abgetastet. Zur Kalibrierung bereiten Sie zwei Palladium-Porphyrin-Lösungen mit einem Sauerstoffpartialdruck von jeweils 150 und null Millimeter Quecksilber vor. Für die Lösung mit null Millimeter Quecksilber geben Sie 1 % Dihi-Natrium zu den Proben hinzu, um die bedingungslose Abwesenheit von Sauerstoff während der Kalibrierung herzustellen.

Halten Sie einen pH-Wert der Probe von 7,4 und eine Temperatur von 37 Grad Celsius aufrecht. Positionieren Sie die Maus auf dem Mikroskopstadium und justieren Sie die Mikrogefäße, für die Sie die hepatische Mikrozirkulation visualisieren möchten, auf den Punkt des Laserflecks. Stellen Sie Mäusen freien Zugang zu Wasser über Nacht zur Verfügung, injizieren Sie 24 Stunden vor der Untersuchung Acetaminophen intraperitoneal mit 200 Milligramm pro Kilogramm. Betäuben Sie die Maus und legen Sie die Leber durch einen medianen Schnitt frei. Bei Vorliegen einer Hepatitis wird diese durch Nekrose im parazentralen Bereich leicht mit bloßem Auge sichtbar sein.

Unsere Messung des partiellen Sauerstoffdrucks und der hepatischen Mikrogefäße bei Mäusen zeigte mittlere Sauerstoffdrücke für die portalen Äste, Sinusoidböden und zentralen Venen von 59,8, 48,2 bzw. 38,9 Millimeter Quecksilber. Mit anderen Worten weist der Sauerstoffgradient von den portalen zu den zentralen Ästen auf eine ausreichende Freisetzung von Sauerstoff aus den Erythrozyten hin, während diese die Sinusoide durchlaufen. Wir stellten Mäuse mit paracetamolinduzierter Hepatitis her, um die hepatischen Mikrogefäße zu messen.

Als Beispiel für ein Pathologiemodell fanden wir, dass die Sauerstoffpartialdrücke in portalen Venen, sinusoidalen Gefäßen und zentralen Venen in der Acetaminophen-Gruppe höher waren als bei normalen Mäusen. Die Differenz des Sauerstoffpartialdrucks zwischen portalen und zentralen Venen betrug 20,9 Millimeter Quecksilber bei normalen Mäusen und 16,9 Millimeter Quecksilber bei Mäusen mit Hepatitis-Modell. Die Differenz des Sauerstoffpartialdrucks zwischen portalen und zentralen Venen betrug 20,9 Millimeter Quecksilber bei normalen Mäusen und 16,9 Millimeter Quecksilber bei Mäusen mit Hepatitis-Modell.

Der Sauerstoffgradient in der hepatischen Mikrozirkulation entsteht hauptsächlich durch die Sauerstoffzufuhr über die Pfortader, die von Hepatozyten verbraucht wird. Eine durch Acetaminophen verursachte Nekrose der Hepatozyten im zentralvenösen Bereich führt zu einer verminderten Sauerstoffaufnahme, einer veränderten downstream Mikrozirkulation und somit zu hämodynamischen Störungen. Sauerstoffzufuhr und Sauerstoffverbrauch sind an vielen Formen der Lebererkrankung beteiligt. Wir erstellten ein Modell einer akuten Hepatitis und fanden eine Erhöhung des Sauerstoffpartialdrucks in den Mikrogefäßen.

Unser optisches System kann verwendet werden, um physiologische und pathologische Mechanismen zu untersuchen, indem die mikrovaskuläre Struktur, eher die Flussverteilung und den Sauerstoffverbrauch analysiert werden.