Die α-Test: Rapid Zellfreie CD4-Zählung mit ganzen Speichel

Es besteht ein dringender Bedarf an kostengünstigen CD4-Zählungen zur Überwachung der HIV-Erkrankung in ressourcenarmen Regionen. Dieses Video demonstriert einen kostengünstigen Point-of-Care-Screening-Test, bei dem die CD4-Zahlen auf der Grundlage des Vorhandenseins des Proteinaseinhibitors Alpha-1-PI im Speichel bestimmt werden. Dazu erhält die Versuchsperson oder der Patient zunächst eine Zitronenbonbon, um die Ausscheidung seröser Flüssigkeit in den Speichel anzuregen.

Der Speichel wird in einem Probenbehälter gesammelt und in eine 96-Well-Assayplatte überführt. Anschließend wird eine sättigende Menge des Proteinasen Schweinepankreaselastase zum Speichel gegeben, wodurch Alpha-1-Pi gebunden und inhibiert wird. Danach wird ein farbmetrisches Elastase-Substrat hinzugefügt.

Jegliches verbleibende ungebundene Elastase spaltet das Substrat, was zu einer Farbänderung von klar nach gelb führt. Kumasi-Blau wird den Vertiefungen zugesetzt, um das Gesamtprotein anzufärben, und farbmetrische Messungen werden mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts durchgeführt. Letztendlich wird das Verhältnis von Alpha-1-Proteaseinhibitor zum Gesamtprotein bestimmt und zur genauen Beurteilung der CD4-Zellen basierend auf einem Indexwert verwendet.

Die vorliegende Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber der etablierten Technik der Durchflusszytometrie. Der Test kann direkt im Feld durchgeführt werden, ohne dass Blut entnommen werden muss, was traumatisierend und kostspielig ist, ohne den Einsatz monoklonaler Antikörper, die teuer sind, ohne technische Ausbildung und ohne Notwendigkeit der Kühlung oder des Transports von Proben. Diese Methode überwindet eine entscheidende Hürde bei der Bekämpfung von AIDS und sollte einen erheblichen Einfluss auf die Behandlungskosten und die gesundheitlichen Ergebnisse von Patienten sowie auf die Häufigkeit der HIV-Übertragung haben, was alles einen großen Einfluss auf die globale Wirtschaft hat.

Diese Methode kann Einblicke geben, wie Alpha und PI die Anzahl der CD4-T-Zellen über Adhärenz und Migration regulieren, kann aber auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise darauf, wie andere Proteinhemmer die Adhärenz und Zellmigration anderer Zelltypen regulieren. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir entdeckten, dass Alpha-1-PI bei HIV-infizierten Patienten derart niedrig ist, dass dies tatsächlich begrenzt, wie viele CD4-T-Zellen in das Blut gelangen. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die benötigten Arbeitslösungen für jede Mikroplatte vorbereiten, die verwendet wird.

Stellen Sie 60 Milliliter 0,05 molarer Tris-gepufferter Salzlösung oder TBS mit einem pH-Wert von 7,8 her. Bereiten Sie außerdem für jede Mikroplatte sechs Milliliter Schweine-Pankreas-Elastase Typ I oder PPE vor. Schütteln Sie die PPE-Suspension gut durch und verdünnen Sie sie anschließend in TBS auf eine Konzentration von etwa 0,01 Einheiten pro Milliliter.

Bereiten Sie als Nächstes eine 0,1-molare Stammlösung des kolorimetrischen Substrats SA three NA in DMSO vor. Diese Stammlösung sollte entweder sofort verwendet oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, falls sie später verwendet wird. Bereiten Sie für jede Mikroplatte sechs Milliliter einer Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung 1:100 in TBS verdünnen. Schließlich bereiten Sie eine Stammlösung mit 10 % Kumasi Brilliant Blue R two 50 in TBS vor und verwenden Sie diese entweder sofort oder lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius, falls sie später verwendet wird.

Bereiten Sie sechs Milliliter für jede Mikroplatte vor, indem Sie den Stammlösung im Verhältnis 1 zu 1000 in TBS verdünnen. Beim Umgang mit Speichel ist es wichtig, geeignete Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel, wobei sich der Forschungsteilnehmer oder Patient in stehender Position befinden sollte. Legen Sie eine SGO in den Mund, um die Serumexsudation zu stimulieren.

Die Rolle des HIV-Patienten in dieser Demonstration wird von einer wissenschaftlichen Hilfskraft übernommen. Ein zuckerfreier Zitronenbonbon ist für HIV-Patienten der Kategorie 1 praktisch, die häufig zahnlos sind und daher oft nicht in der Lage, Kaugummi zu kauen. Schlucken Sie nach Bedarf während der ersten drei Minuten und sammeln Sie für die nächsten drei Minuten Speichel aus dem gesamten Mundraum in einem Probenbehälter. Dies liefert etwa zwei Milliliter Speichel.

Falls der Speichel nicht sofort verwendet wird, sollte er am Verarbeitungstag bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Das Probenmaterial wird anschließend bei 37 Grad Celsius aufgetaut. Nach dem Auftauen kann der Speichel bis zu drei Tage bei zwei bis vier Grad Celsius aufbewahrt werden. Jede Probe und jede Kontrolle wird in einem 96-Loch-Flachboden-Plättchen im Dreifachansatz angesetzt, wobei 130 Mikroliter TBS zu jedem Proben- und Kontrollloch gegeben werden, um den Assay vorzubereiten.

Danach Schleimhautschleim vermeiden, der zähflüssig ist und kein Serumexsudat enthält. 20 Mikroliter Speichel in jeweils drei Test- und drei Negativkontrollmulden überführen. Anschließend 20 Mikroliter TBS in die Positivkontrollmulden pipettieren und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen.

In diesem Schritt ist es wichtig, beim Pipettieren des Speichels Verwirbelungen zu vermeiden, die Blasen bilden könnten, und das Pipettieren von festen Partikeln sowie von Speichelresten zu vermeiden. Anschließend schütteln Sie die PO-markierte Pankreaselastase- oder PPE-Arbeitslösung gründlich, um sie zu mischen, und geben dann 50 Mikroliter in die Proben- und Positivkontrollmulden sowie in die Negativkontrollmulden.

Fügen Sie 50 Mikroliter TBS hinzu. Es ist nicht notwendig, das Gemisch zu mischen, da das zugegebene Volumen ausreichend groß ist, um eine gleichmäßige Verteilung in der Speichelmischung zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation 50 Mikroliter der Arbeitslösung des Elastase-Substrats SA drei NA zu jedem hinzufügen. Anschließend weitere 45 Minuten bei 23 Grad Celsius inkubieren. Nach Ablauf von 45 Minuten 50 Mikroliter der Arbeitslösung von Kumasi-Blau zu jedem hinzufügen.

Danach die Extinktion in einem Mikroplatten-Reader bei 405 Nanometern messen, um den SA-3-NA-Spaltungsgrad nachzuweisen, und bei 595 Nanometern, um Kumasi-Blau zu detektieren, das den Gesamtgehalt an Protein darstellt. Zur Berechnung des Alpha-1-PI-Index verwenden Sie zunächst die folgende Formel, um die normalisierte Extinktion für jede Wellenlänge zu ermitteln, indem die Differenz zwischen dem Durchschnittswert der Probe und dem Durchschnittswert der negativen Kontrolle durch die Differenz zwischen dem Durchschnittswert der positiven Kontrolle und dem Durchschnittswert der negativen Kontrolle dividiert wird. Anschließend wird der Alpha-1-PI-Index berechnet, indem die normalisierte Extinktion bei 405 Nanometern durch die normalisierte Extinktion bei 595 Nanometern geteilt wird, wie hier dargestellt, um zu ermitteln, ob der Alpha-Test als Point-of-Care-Screening-Test zur Überwachung der CD4-Zahlen in endemischen, ressourcenarmen Regionen geeignet sein könnte.

Gestimulierter Speichel wurde von 20 weiblichen und 11 männlichen HIV-1-Personen, die eine Klinik in Kamerun zur routinemäßigen Versorgung aufsuchten, gesammelt. In Übereinstimmung mit vorläufigen Beobachtungen während der Entwicklung des Alpha-Tests unter Verwendung von in New York City gesammeltem Speichel zeigten der Alpha-1-PI-Index und in Kamerun gesammelter Speichel eine Korrelation mit den CD4-Zahlen mit einem Bestimmtheitsmaß (R²) von 0,91 und einem P-Wert von weniger als 0,0001. Der Zusammenhang wurde durch eine dreiparametrige sigmoide Kurve beschrieben, was mit der Dosis-Wirkungs-Beziehung übereinstimmt. Die 95-%-Konfidenz- und Vorhersageintervalle sind mit blauen bzw. roten Linien dargestellt.

In einer früheren Studie stellten wir fest, dass CD4-positive T-Zellen ein sinusförmiges Zyklieren mit einer Periodizität von 23 ± 3,5 Tagen bei HIV-1-Personen sowie bei Personen mit der erblichen Form des Alpha-1-PI-Mangels, PIZZ, aufweisen. Hier ist ein repräsentatives Beispiel einer computergenerierten Sinuskurvenanalyse des CD4-Zyklus in einem HIV-negativen gesunden Kontrollsubjekt mit einer Periodizität von 27 Tagen: computergenerierte Sinuskurvenanalyse der CD4-positiven T-Zellen. Die Analyse der Veränderungen bei sechs Probanden ergab Werte für die Spitze-zu-Spitze-Amplitude und die Schwingungsachse, wie erwartet. Die Schwingungsachse korrelierte mit der Amplitude mit einem Bestimmtheitsmaß (R-Quadrat) von 0,96 und einem p-Wert von 0,009.

Bei Patienten mit niedrigen CD4-positiven T-Zellzahlen waren die zyklischen Schwankungen der CD4-T-Zellzahl gering, bei Patienten mit hohen CD4-positiven T-Zellzahlen hingegen groß, da die hier dargestellte Regressionslinie die Schwingungsachse schätzt und die Schwingungsachse mit der Amplitude korreliert ist. Die Amplitude kann für die Regressionslinie berechnet werden, um abzuschätzen, wie stark die CD4-positiven T-Zellen aufgrund zyklischer Schwankungen oberhalb und unterhalb der Regressionslinie variieren würden. Nach Überlagerung der berechneten Amplitude und des Konfidenzintervalls zeigte sich, dass die durch die grüne Linie angegebene Amplitude innerhalb des durch die blaue Linie markierten 95-%-Konfidenzintervalls liegt.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in 90 Minuten vom Zeitpunkt der Speichelentnahme bis zur Übermittlung der CD4-Zellzahl an den Patienten durchgeführt werden. Dieses Verfahren dient als Screening-Test zur Überwachung der CD4-Zellzahlen. Wenn bei einem Patienten erhebliche Veränderungen der CD4-Zellzahlen festgestellt werden, sollte dieser mithilfe der Durchflusszytometrie weiter untersucht werden, um die Gültigkeit der CD4-Zellzahlen-Messungen zu bestätigen und bei der Therapieentscheidung zu unterstützen.

In der nächsten Entwicklungsstufe wird der Mikroplatten-Assay zu einer Dipstick-Technologie weiterentwickelt, die es ermöglicht, Tests ohne Instrumente oder Strom durchzuführen. Eine Übertragung von HIV über Speichel ist unwahrscheinlich, aber HIV-Patienten leiden häufig an anderen Infektionskrankheiten wie Tuberkulose und Hepatitis C. Daher darf nicht vergessen werden, dass das Arbeiten mit Speichel ebenso wie mit Blut aufgrund unbekannter infektiöser Partikel äußerst gefährlich sein kann. Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, beispielsweise das Tragen von Handschuhen und anderer persönlicher Schutzausrüstung während der Durchführung dieses Verfahrens.