Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz In-situ- Hybridisierung (FISH)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Position der viralen RNA in C zwei innerhalb der Zellen sichtbar zu machen. Um dies zu erreichen, züchten Sie zunächst die Zellen, die transfiziert oder infiziert werden sollen, auf Glasabdeckfolien. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen nach erfolgreicher Transfektion oder Infektion mit 4%Paraformaldehyd zu fixieren.

Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit einer Hybridisierungsmischung, die die RNA markiert. Dies geschieht, indem die Deckschicht mit der Zellseite nach unten auf das Hybridisierungsgemisch auf einem Objektträger gelegt wird. Der letzte Schritt in diesem Verfahren besteht darin, die Zellen mit Antikörpern für die RNA-Markierung zu färben.

Letztendlich wird die Lokalisierung der markierten RNA innerhalb der Zelle durch Fluoreszenz in der C-2-Hybridisierung oder im Fisch sichtbar gemacht. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie RNA-Bildgebung und lebenden Zellen mit Tags besteht darin, dass native RNA im Gegensatz zu modifizierter RNA nachgewiesen werden kann. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie Patienten bei der Pflege und Handhabung von Deckblättern, eine Standardisierung der Methode sowie ein präzises Timing erfordert.

Während der Inkubationen, Das spezifische Verfahren zur Kultivierung von Zellen für die Fixierung hängt von der Art der Zellen ab. Für adhärente Zellen ist es zunächst wichtig, sie auf unbehandelte sterile Glasdeckgläser zu säen. Die endgültige Kofluenz bei der Ernte beträgt also etwa 70 bis 80 %. Nicht adhärente Zellen sollten auf die übliche Weise kultiviert werden, bis sie zur Entnahme bereit sind.

Inkubieren Sie sie dann mit Deckgläsern, die mit Poly-L-Lysin behandelt wurden, für eine typische 12-Well-Polystyrol-Gewebekulturplatte, die 24 Stunden vor der Infektion oder Transfektion 150.000 Zellen pro Well enthält. Inkubieren Sie die Zellen auf den Decklippen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um mit der Zellfixierung zu beginnen. Entsorgen Sie das Medium durch vorsichtiges Absaugen und fügen Sie vorsichtig ein mit XPBS vorbereitetes und doppelt destilliertes Wasser hinzu.

Oder DPBS wäscht die Zellen eine Minute lang. Es kann auch Dathylpyro CARBATE oder DEPC-behandeltes XPBS verwendet werden. Verwenden Sie kein unbehandeltes PBS, da es R-Nase-Enzyme enthalten kann.

Entsorgen Sie das DPBS und fügen Sie vorsichtig genug hinzu. 4%Para-Formaldehyd, um die Zellen vollständig zu bedecken, inkubieren Sie danach 15 bis 20 Minuten, entsorgen Sie das Paraldehyd und waschen Sie die Zellen eine Minute lang mit DPBS. Verwerfen Sie das DPBS und fügen Sie 0,1 molares Glycin hinzu, das 10 Minuten lang inkubiert.

Entsorgen Sie anschließend das Glycin und waschen Sie die Zellen eine Minute lang mit DPBS. Nach dem Verwerfen des DPBS 0,2 % Triton X 100 hinzufügen, fünf bis 10 Minuten inkubieren. Bei der Färbung auf nukleoläre oder nukleäre Hüllproteine perme sie nicht länger als fünf Minuten mit Triton X 100, sonst wird die Proteinlokalisation diffus.

Triton X 100 entsorgen und zweimal eine Minute lang in DPBS waschen, bevor mit dem Verfahren für Fisch begonnen wird. Bereiten Sie die Seiten vor, auf denen die Einbandscheine inkubiert werden sollen, und achten Sie darauf, sie gut zu reinigen und zu beschriften. Für einen 18-Millimeter-Deckglas fügen Sie dem Objektträger 50 Mikroliter DNA-Lösung hinzu.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist der richtige Umgang mit Deckgläsern. Es ist wichtig, dass Sie die rechte Seite des Deckglases inkubieren und vorsichtig damit umgehen. Um einen Bruch zu vermeiden, legen Sie den Deckglas auf den Objektträger, achten Sie darauf, dass Sie ihn mit der Zellseite nach unten legen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie nach 15 Minuten die Deckgläser mit der Verkaufsseite nach oben in eine Kulturschale mit einem X-D-P-B-S.

Waschen Sie die Deckgläser eine Minute lang. Diese Mischung enthält Folgendes. 50 % deionisierte Formamid, ein Milligramm pro Milliliter, TRNA, zwei X-S-S-P-E, fünf X-dnar-RNAs, Sonde und DEPC-Wasser auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern.

Bei der Sonde handelt es sich um eine mit Dig-Genin markierte RNA-Sonde, die so konzipiert ist, dass sie komplementär zur viralen genomischen RNA ist. Ort. Jede Abdeckung rutscht mit der Zellseite nach unten auf das Hybridisierungsgemisch auf dem Objektträger. Die Inkubation sollte in einer Schale durchgeführt werden, die zwei X-S-S-P-E mit 50%FIDE enthält.

Mischen, 16 bis 18 Stunden bei 42 Grad Celsius inkubieren. Inkubieren Sie anschließend die Abdeckung mit der Rutschzelle nach unten in 50 Mikrolitern 50%fide für 50 Minuten bei 42 Grad Celsius. Waschen Sie die Einbezugsbänder zweimal in zwei X-S-S-P-E, indem Sie sich mit der Seite nach unten in 50 Mikrolitern von zwei X-S-S-P-E für jeweils fünf Minuten bei 42 Grad Celsius inkubieren.

Zum Schluss die Einbezugsgläser in einem X-D-P-P-S eine Minute lang waschen. Um dieses Verfahren zu beginnen, blockieren Sie die Deckgläser, indem Sie die Zellseite nach unten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 50 Mikroliter einer X Roche Blockierungslösung legen. Wenn die Blockierung abgeschlossen ist, legen Sie jeden Deckglas mit der Zellseite nach unten in 50 Mikroliter einer Primärantikörperlösung, die alle Primärantikörper für das Experiment in den entsprechenden Konzentrationen enthält. Nach einer Stunde eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Legen Sie den Deckglas mit der Zellseite nach oben in eine Kulturschale mit DPPS und waschen Sie die Deckgläser 10 Minuten lang. Pipettieren Sie anschließend 50 Mikroliter Sekundärantikörperlösung auf einen Objektträger für jeden Deckglas. Alexa-Bodenkonjugierte Antikörper können zur Erzeugung einer Reihe von Farben verwendet werden und werden in einer Verdünnung von 1 bis 500 in einer x-Blockierungslösung und einer X-D-P-B-S verwendet. Legen Sie jede Deckschicht mit der Zellseite nach unten in die sekundäre Antikörperlösung und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad.

Waschen Sie die Eindeckeinlagen zweimal für jeweils 10 Minuten. Beim DPBS-Trocknen wird der Einband mit der Zellenseite nach oben auf ein Blatt Löschpapier geschoben. Achten Sie darauf, die Deckgläser abzudecken, um Lichteinwirkung und Ausbleichen zu vermeiden.

Sobald die gesamte Flüssigkeit verdampft ist, montieren Sie die Deckgläser auf frische Objektträger. Mit acht Mikrolitern Immuno Mount klopfen Sie vorsichtig auf das Deckglas, um Luftblasen zu entfernen, und tragen Sie Nagellack auf die Ränder des Deckglases auf, um es an Ort und Stelle zu halten. Die Visualisierung von RNA und Proteinen durch Mikroskopietechniken ist ebenfalls entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens.

Einstellungen am verwendeten Mikroskop können die Visualisierung erleichtern oder erschweren. Daher ist es wichtig, dass die Einstellungen am Mikroskop korrekt eingestellt sind und von einer Probe zur anderen in einem bestimmten Experiment konsistent sind. Ein repräsentatives Ergebnis der Visualisierung der viralen RNA durch Fische und der Proteinlokalisation durch Immunfluoreszenz ist in dieser Abbildung dargestellt.

In diesem ersten Panel, in dem Hela-Zellen mit HIV eins transfiziert werden, ist die virale RNA für HIV eins in grün gezeichnet im gesamten Zytoplasma größtenteils diffus dargestellt, obwohl kleine zytoplasmatische Punte nicht ungewöhnlich sind, kann die Spezifität durch den Vergleich positiver Zellen mit umgebenden Zellen gesehen werden, die keine Fluoreszenz aufweisen, wie durch das Schwarz-Weiß-Einschubbild veranschaulicht, das nur die virale RNA-Färbung darstellt. Die rote Färbung spiegelt die Immunfluoreszenz des Ross GA PSH Drei-Domänen-bindenden Proteins oder G drei bp wider, das hauptsächlich das Zytoplasma markiert, wenn Helozellen mit HIV transfiziert werden, eins, dem das regulatorische rev-Protein fehlt. Die produzierte virale RNA wird im Zellkern zurückgehalten.

Dies kann als hellgrünes Signal im Zellkern und als fehlendes RNA-Fluoreszenzsignal im Zytoplasma visualisiert werden. Die Verteilung der HIV-eins-viralen RNA kann auch durch Überexpression bestimmter zellulärer Proteine verändert werden. Zum Beispiel führt die Überexpression von RAB sieben interagierenden lysosomalen Proteinen oder realen, A-Proteinen, die am endosomalen Vesikeltransport beteiligt sind, zu einer Relokalisation der in Grün verfolgten viralen genomischen RNA zum Zentrum der Mikrotubenorganisation.

Hier werden die Endosomen von Lampe eins markiert und rot gefärbt. Im Gegensatz dazu dispergiert die Überexpression eines aminoterminalen deletierten delta N, das nicht in der Lage ist, an P zu binden, ein 50 geklebtes Endosom des Dine-Motor-Komplexes, späte Endosomen im Zytoplasma über die Expression von P 50 dyin blockiert die große Untereinheit des Dine-Motors und setzt späte Endosomen, aber auch die virale genomische RNA und HIV V 1-Strukturproteine an die Zellperipherie frei. Wenn HIV 1 in Helozellen exprimiert wird und die Zellen dann zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und analysiert werden, erscheint die virale RNA bereits drei Stunden nach der Transfektion und Infektion in der Zelle und wird mit dieser Fischtechnik nach 12 Stunden leicht beobachtbar.

Hier wird die Expression der viralen RNA in Grün verfolgt, während das zelluläre Protein H-N-R-N-P-A rot gefärbt ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik am ersten Tag in 20 Minuten und am zweiten Tag in viereinhalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Deckgläser vorsichtig zu behandeln, um ein Brechen zu vermeiden und um sicherzustellen, dass Sie nach dem Auftragen des Sekundärantikörpers kein Licht erhalten. Vergessen Sie nicht, wenn Sie mit HIV V und anderen höherwertigen Krankheitserregern arbeiten, dass diese vor der Fixierung äußerst gefährlich sind und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie angemessene Schulung und Eindämmung getroffen werden sollten.