Retrograde Loading von Nerven, Tracts, und Spinalwurzeln mit Fluoreszenzfarbstoffen
19. April 2012
Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zum Einführen hohe Konzentration von fluoreszierenden und Calcium-sensitiven Farbstoffen in Neuronen oder neuronaler ein Polyethylen Saugpipette.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer einfachen, kostengünstigen Technik eine hohe Konzentration eines fluoreszierenden oder ionensensitiven Farbstoffs in Neuronen oder beliebigen neuronalen Bahnen einzubringen. Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Arten von Pipetten hergestellt werden, Typ eins und Typ zwei. Anschließend wird ein flexibler elastomerer Schlauch mit der Pipette vom Typ eins verbunden, und positiver Druck wird angewendet, um die Ziel-neuronale Bahn in die Pipette vom Typ eins einzusaugen, wobei überprüft wird, dass eine gute Abdichtung erzielt wurde.
Als Nächstes wird die Pipette Typ zwei in die Pipette Typ eins eingeführt und mit der Pipette Typ zwei das restliche A-CSF aus der Pipette Typ eins aufgesaugt. Anschließend wird der Farbstoff, jedoch keine Luftblasen, in die Pipette Typ eins gegeben. Der letzte Schritt besteht darin, die Neuronen zwischen sechs und 20 Stunden im Dunkeln zu inkubieren.
Letztendlich ist die Probe nach dem Entfernen der Pipette vom Typ eins bereit für in-vitro-, elektrophysiologische oder morphologische Untersuchungen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Badapplikation, BOS-Injektion und Elektroporation besteht darin, dass der Wirkstoff D einer definierten neuronalen Population gezielt zugeführt wird. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften beantworten, beispielsweise zur Aktivität, Konnektivität, Morphologie und Verteilung definierter Neuronen.
Im Allgemeinen erfordert die Technik Übung, insbesondere darauf zu achten, dass die Farbe innerhalb der Pipette vom Typ eins nicht verdünnt wird und keine Luftblasen eingeschlossen werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den Polyäthylenschlauch über die Flamme einer Alkohollampe ziehen, um zwei kurze Pipetten mit konisch zulaufenden Spitzen herzustellen. Ziehen Sie zuerst eine kurze Pipette vom Typ eins mit einer kleinen Spitze, die die Zielwurzel oder Bahn festhalten kann.
Ziehen Sie anschließend eine Pipette vom Typ zwei mit einem längeren, dünneren Schaft und einer sehr feinen Spitze, die bis zur Spitze in die Pipette vom Typ eins eingeführt werden kann. Danach verbinden Sie die Pipette vom Typ zwei mit einer EC-klemmten Nadel mit 19 Gauge. Anschließend legen Sie das isolierte Rückenmark in ein Bad.
Überlagern Sie es während des Beladeprozesses mit gekühltem A-CSF. Danach befestigen Sie die Typ-1-Pipette an einem Elektrodenhalter, sodass ihre hintere Öffnung leicht über einen flexiblen Schlauch an eine Spritze angeschlossen werden kann. Ziehen Sie in diesem Verfahren zunächst CSF mit Hilfe einer Spritze in die Typ-1-Pipette ein.
Zeichnen Sie anschließend den zu füllenden Axonstrang oder die Wurzel auf. Entfernen Sie danach das flexible Rohr aus der hinteren Öffnung. Befestigen Sie anschließend die Pipette Typ zwei an einer anderen Spritze.
Führen Sie sie in die Pipette Typ eins ein, die unter dem Mikroskop einen Axonstrang oder eine Neuritenwurzel hält. Verwenden Sie die mit der Pipette Typ zwei verbundene Spritze, um A-CSF anzusaugen, sodass das verbleibende A-CSF den Axonstrang gerade bedeckt. Ziehen Sie anschließend die Pipette Typ zwei aus der Pipette Typ eins zurück.
Überwachen Sie den A-CSF-Spiegel einige Minuten lang, um eine gute Abdichtung am Axonstrang oder an den Nerven zu überprüfen. Danach lösen Sie den Farbstoff in A-CSF oder 0,2 % Triton X-100 in zweifach destilliertem Wasser auf. Ziehen Sie die Lösung mittels schwachem Unterdruck, der auf die angeschlossene Spritze ausgeübt wird, in die Pipette vom Typ zwei, wobei darauf geachtet werden muss, keine Luftblasen aufzunehmen.
Danach die Pipette Typ zwei, die den Farbstoff enthält, in die verbleibende A-CSF-Lösung in der Pipette Typ eins einführen und den Farbstoff langsam unter vorsichtiger positiver Druckanwendung an der Spritze in das A-CSF abgeben. Dabei darauf achten, keine Luftblasen einzuführen oder das Zielgewebe von der Innenseite der Pipettenspitze zu verdrängen. Falls während der Injektion des Farbstoffs eine Luftblase in die Pipette Typ eins gelangt, die Blase entfernen, indem die Spitze der Pipette Typ zwei nahe an die Blase herangeführt und anschließend vorsichtig ein schwacher Unterdruck über die angeschlossene Spritze aufgebracht wird.
Nachdem eine ausreichende Menge Farbstoff freigesetzt wurde, entnehmen Sie die Pipette vom Typ zwei. Inkubieren Sie das Gewebe anschließend je nach Art des Experiments sechs bis 20 Stunden im Dunkeln. Sobald ausreichend Zeit zum Füllen verstrichen ist, ziehen Sie die Elektrode vorsichtig vom Gewebe ab.
Dann ist das Gewebe bereit für die Bildgebung oder Histologie. Hier ist ein schematisches Diagramm, das die gleichzeitige Beladung mit drei verschiedenen, konjugierten, fluoreszierenden Farbstoffen in Motoneuronen, sensorische Afferenzen und spinale Interneuronen zeigt. Motoneuronen und sakrale sensorische Afferenzen wurden über die vorderen bzw. hinteren Wurzeln rückwärts mit Cascade Blue-Dextran und Texas Red-Dextran gefüllt. Grün fluoreszierendes Dextran wurde in spinale Interneuronen geladen, deren Axone durch das vordere Bündel aufsteigen.
Hier ist ein konfokales Bild eines Abschnitts des sakralen Rückenmarks dargestellt, bei dem die Neuronen rückwärts markiert wurden. Beachten Sie, dass die markierten sensiblen Afferenzen hauptsächlich ipsilateral verlaufen. Mit wenigen kontralateralen Projektionen sind die markierten Motoneuronen ipsilateral zur gefüllten Ventralkommissur, während die markierten Interneuronen kontralateral dazu liegen, wie durch den Pfeil angezeigt wird.
Nach Durchführung dieses Verfahrens können zusätzliche Methoden angewendet werden, um zentrale Fragen hinsichtlich der funktionalen Konnektivität, der erregbaren Inhibitoren, des Sinustyps, der Verteilung sowie der Neurotransmitterproduktion in den Neuronen des DI-Feldes zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurophysiologie von Rückenmark und Hirnstamm, um spezifische neuronale Populationen mittels ionensensitiver Farbstoffe sichtbar zu machen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie fluoreszierende und/oder ionensensitive Farbstoffe in Neuronen und sensorische Fasern im isolierten Rückenmark appliziert werden können.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine einfache und kostengünstige Technik zur Einführung hoher Konzentrationen fluoreszierender und kalziumsensitiver Farbstoffe in Neuronen oder neuronale Bahnen beschrieben. Die Methode nutzt eine Saugpipette aus Polyethylen, um eine effektive Einführung der Farbstoffe zu erreichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Fluoreszenz-Bildgebung
Hintergrund
- Fluoreszierende und kalziumempfindliche Farbstoffe sind unerlässlich, um neuronale Aktivität zu untersuchen.
- Herkömmliche Methoden können kostspielig oder komplex sein.
- Dieses Verfahren zielt darauf ab, den Prozess zu vereinfachen.
- Die Verwendung einer Saugpipette aus Polyethylen verbessert den Zugang für Forschende.
Zweck der Studie
- Um hohe Farbstoffkonzentrationen effektiv in Neuronen einzubringen.
- Um eine kostengünstige Alternative zu bestehenden Methoden bereitzustellen.
- Um eine bessere Visualisierung der neuronalen Aktivität zu ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von zwei Arten von Pipetten für das Verfahren.
- Aufbringen von positivem Druck, um den Ziel-Nervenstrang in die Pipette einzusaugen.
- Verwendung einer zweiten Pipette zum Absaugen des restlichen Liquor cerebrospinalis (CSF).
- Einführung des Farbstoffs ohne Luftblasen, gefolgt von einer Inkubation im Dunkeln.
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht eine effektive Einführung von Farbstoffen in Neuronen.
- Hohe Konzentrationen von Farbstoffen können bei geringen Kosten erreicht werden.
- Die Inkubationszeit variiert zwischen sechs und zwanzig Stunden für optimale Ergebnisse.
- Die Methode ist reproduzierbar und für Forschende zugänglich.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet eine zuverlässige Möglichkeit, Farbstoffe in neuronale Systeme einzubringen.
- Sie verbessert die Fähigkeit, neuronale Dynamik und Funktionen zu untersuchen.
- Der Ansatz ist sowohl für Forschungs- als auch für Lehrzwecke von Vorteil.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Mit dieser Technik lässt sich eine präzise Applikation von fluoreszenten und ionensensitiven Farbstoffen auf definierte neuronale Populationen realisieren, was die mechanistische Ent-Risikung bei der Target-Validierung und Pfadanalyse unterstützt. Durch die Aufrechterhaltung einer hohen Farbstoffkonzentration während des Beladens wird die Signalzuverlässigkeit für nachgeschaltete funktionelle und morphologische Assays verbessert. Der kostengünstige, reproduzierbare Ansatz trägt zur Standardisierung und Skalierbarkeit von Assays in frühen Entdeckungsworkflows bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung spezifischer neuronaler Bahnen, um Konnektivität und funktionelle Hypothesen zu klären.
- Operativer Wert: Stellt eine definierte neuronale Population für konsistente Target-Engagement-Studien bereit.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Fluoreszenzsignale zur Beurteilung der Farbstoffaufnahme und der Effizienz der neuronalen Markierung.
- Operativer Wert: Unterstützt die Bereitschaft des Assays durch standardisierte, blasenfreie Farbstoffzufuhr und reproduzierbare Inkubationsprotokolle.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem die Visualisierung von motorischen, sensiblen und Interneuron-Populationen in Rückenmarkpräparationen ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Stellt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher, indem eine zuverlässige neuronale Markierung für Elektrophysiologie und Bildgebung gewährleistet wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in die Entdeckungsbiologie, indem sie gezielte neuronale Markierungen ermöglicht und somit die Überprüfung von Hypothesen sowie die Aufklärung von Signalwegen unterstützt. Sie eignet sich für die Durchführung von Screenings, da sie assaysbereite Präparationen mit quantitativen, farbstoffabhängigen Ausgangssignalen bereitstellt. Der Technik kommt im analytischen Bereich Bedeutung zu, da sie messbare Fluoreszenzintensitäten und Verteilungsmetriken liefert. Sie unterstützt translationsorientierte Forschung, indem sie die neuronale Integrität für präklinische Kontinuitätsstudien erhält. Die wirtschaftliche Wiederverwendbarkeit wird durch das kostengünstige, anpassungsfähige pipettenbasierte System gewährleistet, das auf mehrere neuronale Bahnen anwendbar ist.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die gezielte Markierung neuronaler Bahnen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte, hochkonzentrierte Farbstoffgabe ohne Verdünnung.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen der Fluoreszenzintensität und der neuronalen Verteilung zur Analyse vergleichender Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem die neuronale Morphologie und Funktion nach der Markierung erhalten bleibt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare, kostengünstige Plattform für konsistente neuronale Markierung in unterschiedlichen experimentellen Modellen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten bei der Untersuchung der neuronalen Vernetzung und Aktivität reduziert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Pipettenherstellung und Farbstoffapplikation.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten, indem zuverlässige Daten zur neuronalen Zielinteraktion und Pfadmodulation bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung durch konsistente, hochpräzise neuronale Markierung in allen Entdeckungsphasen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrochirurgie und mikroskopischer Visualisierung für die korrekte Handhabung von Pipetten und Gewebe.
- Setzt den Zugang zu Polyäthylen-Schläuchen, Spritzensystemen und Fluoreszenzmikroskopie für das Beladen und Nachweisen von Farbstoff voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Arbeitsgruppen bei der Pipettenzugtechnik und den Inkubationsbedingungen, um eine konsistente Markierung sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf unterschiedliche neuronale Bahnen oder Modellsysteme mit variierenden Axondurchmessern angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit, das Eindringen von Luftblasen zu vermeiden und die Dichtheit des Verschlusses während des Farbstoffbeladens aufrechtzuerhalten.
