Retrograde Loading von Nerven, Tracts, und Spinalwurzeln mit Fluoreszenzfarbstoffen
19. April 2012
Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zum Einführen hohe Konzentration von fluoreszierenden und Calcium-sensitiven Farbstoffen in Neuronen oder neuronaler ein Polyethylen Saugpipette.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine hohe Konzentration an fluoreszierendem oder ionenempfindlichem Farbstoff mit einer einfachen, kostengünstigen Technik in Neuronen oder jeden neuronalen Trakt einzubringen. Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Arten von Pipetten hergestellt werden, Typ eins und Typ zwei. Schließen Sie dann einen flexiblen Elastomerschlauch an die Pipette vom Typ 1 an und üben Sie positiven Druck aus, um den Ziel-Neuronaltrakt in die Pipette vom Typ 1 zu ziehen, um sicherzustellen, dass eine gute Abdichtung hergestellt ist.
Führen Sie als Nächstes die Pipette vom Typ zwei in die Pipette vom Typ 1 ein und verwenden Sie die Pipette vom Typ zwei, um den verbleibenden A-Liquor aus der Pipette vom Typ 1 abzusaugen. Geben Sie dann den Farbstoff, aber keine Luftblasen in die Typ-1-Pipette. Der letzte Schritt besteht darin, die Neuronen im Dunkeln zwischen sechs und 20 Stunden zu inkubieren.
Letztendlich ist das Präparat nach der Entnahme der Typ-1-Pipette bereit für in vitro, elektrophysiologische oder morphologische Studien. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Badanwendung, BOS-Injektion und Elektroporation besteht darin, dass das D an eine definierte neuronale Population abgegeben wird. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. Aktivität, Konnektivität, Morphologie und Verteilung definierter Neuronen.
Im Allgemeinen erfordert die Technik Übung, insbesondere die Sicherstellung, dass der Farbstoff in der Typ-1-Pipette nicht verdünnt wird und keine Luftblasen in die Pipette eingebracht werden. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie den Polyethylenschlauch über die Flamme einer Alkohollampe ziehen, um zwei kurze Pipetten mit spitzen Spitzen herzustellen. Ziehen Sie zuerst eine kurze Pipette vom Typ 1 mit einer kleinen Spitze, die die Zielwurzel oder den Zieltrakt fest halten kann.
Ziehen Sie als Nächstes eine Pipette vom Typ zwei mit einem längeren, dünneren Schaft und einer sehr feinen Spitze, die bis zur Spitze in die Pipette vom Typ 1 eingeführt werden kann. Verbinden Sie anschließend die Pipette vom Typ zwei mit der EC-geclippten 19-Gauge-Nadel. Legen Sie dann das isolierte Rückenmark in eine Badewanne.
Super Schmelzen Sie es während des gesamten Ladevorgangs mit gekühltem A CSF. Platzieren Sie danach die Pipette vom Typ 1 auf einem Elektrodenhalter, so dass ihre hintere Öffnung über einen flexiblen Schlauch einfach mit einer Spritze verbunden werden kann. Bei diesem Verfahren wird zunächst mit einer Spritze ein Liquor in die Typ-1-Pipette gezogen.
Zeichnen Sie als Nächstes den Axontrakt oder die Wurzel, die gefüllt werden soll. Entfernen Sie dann den flexiblen Schlauch aus der hinteren Öffnung. Befestigen Sie danach die Pipette vom Typ zwei an einer anderen Spritze.
Führen Sie es in die Typ-1-Pipette ein, die einen Axontrakt oder eine neuronale Wurzel unter dem Mikroskop hält. Verwenden Sie die Spritze, die an der Typ-2-Pipette befestigt ist, um einen Liquor so zu aspirieren, dass der verbleibende A-Liquor gerade den Axontrakt bedeckt. Ziehen Sie dann die Pipette vom Typ zwei aus der Pipette vom Typ eins.
Überwachen Sie den A-Liquorspiegel für einige Minuten, um eine gute Abdichtung des Axontrakts oder der Nerven zu überprüfen. Lösen Sie anschließend den Farbstoff in A CSF oder 0,2 % Triton X 100 in doppelt destilliertem Wasser auf. Ziehen Sie es in die Typ-2-Pipette, indem Sie einen schwachen Unterdruck auf die beigefügte Spritze ausüben und dabei darauf achten, dass keine Luftblasen eingezogen werden.
Führen Sie dann die Pipette vom Typ 2, die den Farbstoff enthält, in die restliche A-Liquorlösung ein. Geben Sie in der Typ-1-Pipette den Farbstoff langsam mit leichtem Überdruck auf die Spritze in den A-Liquor ab. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen oder eine Verschiebung des Zielgewebes von der Innenseite der Spitze zu verursachen. Wenn während der Injektion des Farbstoffs eine Luftblase in die Pipette vom Typ 1 eingeführt wird, ziehen Sie die Blase heraus, indem Sie die Pipettenspitze vom Typ zwei nahe an die Blase heranschieben und dann mit der beigefügten Spritze vorsichtig einen schwachen Unterdruck ausüben.
Nachdem eine ausreichende Menge Farbstoff freigesetzt wurde, ziehen Sie die Pipette vom Typ zwei heraus. Inkubieren Sie das Gewebe anschließend je nach Art des Experiments sechs bis 20 Stunden lang im Dunkeln. Sobald genügend Zeit zum Befüllen gelassen wurde, ziehen Sie die Elektrode vorsichtig aus dem Gewebe ab.
Dann ist das Gewebe bereit für die Bildgebung oder Histologie. Hier ist ein schematisches Diagramm, das die gleichzeitige Beladung von drei verschiedenen dextro, konjugierten Fluoreszenzfarbstoffen mit Motoneuronen, sensorischen afferenten und spinalen Interneuronen, Motoneuronen und sakralen sensorischen Afferenzen zeigt, die mit Cascade blue Dextran bzw. Texas red dextran durch die ventralen bzw. dorsalen Wurzeln verfüllt wurden. Grün fluoreszierendes Dextran wurde in spinale Interneuronen geladen, deren Axone durch den ventralen Funiculus aufsteigen.
Hier ist ein konfokales Bild eines Schnitts aus dem sakralen Rückenmark, in dem die Neuronen wieder markiert wurden. Beachten Sie, dass die markierten sensorischen Afferenten hauptsächlich ipsilateral sind. Mit einigen kontralateralen Projektionen sind die markierten Motoneuronen ipsilateral zur gefüllten ventralen Wurzel, während die markierten Interneurone kontralateral zu ihr sind, wie durch die Pfeilspitze angezeigt.
Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden durchgeführt werden, um Schlüsselfragen wie funktionelle Konnektivität, exzitatorischer Inhibitor, Sinustyp, Verteilung und Neurotransmitterproduktion in den DI-Feldneuronen zu beantworten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurophysiologie des Rückenmarks und des Hirnstamms den Weg, spezifische neuronale Populationen mit ionenempfindlichen Farbstoffen zu emittieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszierende und/oder ionenempfindliche Farbstoffe in Neuronen und sensorische Fasern im isolierten Rückenmark aufträgt.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine einfache und kostengünstige Technik zur Einführung hoher Konzentrationen fluoreszierender und kalziumsensitiver Farbstoffe in Neuronen oder neuronale Bahnen beschrieben. Die Methode nutzt eine Saugpipette aus Polyethylen, um eine effektive Einführung der Farbstoffe zu erreichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Fluoreszenz-Bildgebung
Hintergrund
- Fluoreszierende und kalziumempfindliche Farbstoffe sind unerlässlich, um neuronale Aktivität zu untersuchen.
- Herkömmliche Methoden können kostspielig oder komplex sein.
- Dieses Verfahren zielt darauf ab, den Prozess zu vereinfachen.
- Die Verwendung einer Saugpipette aus Polyethylen verbessert den Zugang für Forschende.
Zweck der Studie
- Um hohe Farbstoffkonzentrationen effektiv in Neuronen einzubringen.
- Um eine kostengünstige Alternative zu bestehenden Methoden bereitzustellen.
- Um eine bessere Visualisierung der neuronalen Aktivität zu ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von zwei Arten von Pipetten für das Verfahren.
- Aufbringen von positivem Druck, um den Ziel-Nervenstrang in die Pipette einzusaugen.
- Verwendung einer zweiten Pipette zum Absaugen des restlichen Liquor cerebrospinalis (CSF).
- Einführung des Farbstoffs ohne Luftblasen, gefolgt von einer Inkubation im Dunkeln.
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht eine effektive Einführung von Farbstoffen in Neuronen.
- Hohe Konzentrationen von Farbstoffen können bei geringen Kosten erreicht werden.
- Die Inkubationszeit variiert zwischen sechs und zwanzig Stunden für optimale Ergebnisse.
- Die Methode ist reproduzierbar und für Forschende zugänglich.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet eine zuverlässige Möglichkeit, Farbstoffe in neuronale Systeme einzubringen.
- Sie verbessert die Fähigkeit, neuronale Dynamik und Funktionen zu untersuchen.
- Der Ansatz ist sowohl für Forschungs- als auch für Lehrzwecke von Vorteil.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Mit dieser Technik lässt sich eine präzise Applikation von fluoreszenten und ionensensitiven Farbstoffen auf definierte neuronale Populationen realisieren, was die mechanistische Ent-Risikung bei der Target-Validierung und Pfadanalyse unterstützt. Durch die Aufrechterhaltung einer hohen Farbstoffkonzentration während des Beladens wird die Signalzuverlässigkeit für nachgeschaltete funktionelle und morphologische Assays verbessert. Der kostengünstige, reproduzierbare Ansatz trägt zur Standardisierung und Skalierbarkeit von Assays in frühen Entdeckungsworkflows bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung spezifischer neuronaler Bahnen, um Konnektivität und funktionelle Hypothesen zu klären.
- Operativer Wert: Stellt eine definierte neuronale Population für konsistente Target-Engagement-Studien bereit.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Fluoreszenzsignale zur Beurteilung der Farbstoffaufnahme und der Effizienz der neuronalen Markierung.
- Operativer Wert: Unterstützt die Bereitschaft des Assays durch standardisierte, blasenfreie Farbstoffzufuhr und reproduzierbare Inkubationsprotokolle.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem die Visualisierung von motorischen, sensiblen und Interneuron-Populationen in Rückenmarkpräparationen ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Stellt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher, indem eine zuverlässige neuronale Markierung für Elektrophysiologie und Bildgebung gewährleistet wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in die Entdeckungsbiologie, indem sie gezielte neuronale Markierungen ermöglicht und somit die Überprüfung von Hypothesen sowie die Aufklärung von Signalwegen unterstützt. Sie eignet sich für die Durchführung von Screenings, da sie assaysbereite Präparationen mit quantitativen, farbstoffabhängigen Ausgangssignalen bereitstellt. Der Technik kommt im analytischen Bereich Bedeutung zu, da sie messbare Fluoreszenzintensitäten und Verteilungsmetriken liefert. Sie unterstützt translationsorientierte Forschung, indem sie die neuronale Integrität für präklinische Kontinuitätsstudien erhält. Die wirtschaftliche Wiederverwendbarkeit wird durch das kostengünstige, anpassungsfähige pipettenbasierte System gewährleistet, das auf mehrere neuronale Bahnen anwendbar ist.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die gezielte Markierung neuronaler Bahnen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte, hochkonzentrierte Farbstoffgabe ohne Verdünnung.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen der Fluoreszenzintensität und der neuronalen Verteilung zur Analyse vergleichender Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem die neuronale Morphologie und Funktion nach der Markierung erhalten bleibt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare, kostengünstige Plattform für konsistente neuronale Markierung in unterschiedlichen experimentellen Modellen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten bei der Untersuchung der neuronalen Vernetzung und Aktivität reduziert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Pipettenherstellung und Farbstoffapplikation.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten, indem zuverlässige Daten zur neuronalen Zielinteraktion und Pfadmodulation bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung durch konsistente, hochpräzise neuronale Markierung in allen Entdeckungsphasen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrochirurgie und mikroskopischer Visualisierung für die korrekte Handhabung von Pipetten und Gewebe.
- Setzt den Zugang zu Polyäthylen-Schläuchen, Spritzensystemen und Fluoreszenzmikroskopie für das Beladen und Nachweisen von Farbstoff voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Arbeitsgruppen bei der Pipettenzugtechnik und den Inkubationsbedingungen, um eine konsistente Markierung sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf unterschiedliche neuronale Bahnen oder Modellsysteme mit variierenden Axondurchmessern angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit, das Eindringen von Luftblasen zu vermeiden und die Dichtheit des Verschlusses während des Farbstoffbeladens aufrechtzuerhalten.
