Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reifung und Migration von pulmonalen dendritischen Zellen oder DC im Verlauf einer durch Val Boomin induzierten allergischen Atemwegsentzündung bei Mäusen zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem die Mäuse zuerst mit Val Boomin sensibilisiert werden, gefolgt von einer Atemwegsprovokation mit fitsy gekennzeichnetem Val Boomin. Als nächstes werden die Lunge und die mediastinalen Lymphknoten entnommen.

Schließlich wird eine einzellige Suspension aus dem Lungen- und Lymphknotengewebe hergestellt. Letztendlich können der Reifungsstatus und die absolute Zellzahl der dendritischen Pullman-Zellen, die nach der FITC Val Boomin-Challenge im mediastinalen Lymphknoten gefunden wurden, durch eine durchflusszytometrische Analyse beurteilt werden. Diese Methode kann uns helfen, wichtige Fragen über pulmonale Immunantworten zu beantworten, z. B. ob dendretische Zellen reifen, wie die Antigenexposition sinkt und ob sie zu den Lymphknoten wandern.

Und wenn sie auswandern, wie hoch ist dann die Migrationsrate? Beginnen Sie damit, frisch zubereitete Val Boomin-Lösung tropfenweise im Verhältnis eins zu eins in einer Tube Alaun hinzuzufügen, während Sie vortexen. Rühren Sie die Mischung 30 Minuten lang um und füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit 0,2 Millilitern der Mischung.

Fassen Sie mit dem Daumen des Zeigefingers einer Hand die zu injizierende Maus mit dem Halsfetzen in der Nähe der Schädelbasis. Injizieren Sie dann mit der anderen Hand die Val Boomin Alaunlösung in die Bauchhöhle der Maus. Sieben Tage nach der zweiten Injektion von Val in Alaun halten Sie ein betäubtes Val in Alaun sensibilisiertes Tier in der aufrechten Position und pipettieren Sie dann mit sterilen Pipettenspitzen 100 Mikroliter und frisch zubereitetes Val in fxi-Lösung tropfenweise auf das NAS der Maus.

Beginnen Sie damit, einen 20-Gauge-Katheter an einer Ein-Milliliter-Spritze zu befestigen. Nachdem Sie die Euthanasie der Maus bestätigt haben, öffnen Sie die Brusthöhle des Tieres bis zum Hals, um die Luftröhre der Maus freizulegen und zu kanülieren. Es ist absolut wichtig, die Lunge zu spülen und das Herz zu überfluten, um sicherzustellen, dass alle kontaminierenden Alveolarmakrophagen und mononukleären Zellen, die im peripheren Blut vorhanden sind, entfernt wurden.

Und stellen Sie sicher, dass Sie diese nächsten beiden Schritte sorgfältig und natürlich mit ruhiger Hand ausführen. Verabreichen Sie nun dreimal eiskaltes PBS mit EDTA durch den Katheter, um die unteren Atemwege zu spülen und Zellen aus den Alveolarräumen zu entfernen. Nachdem Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel versehen haben, perfundieren Sie die Lunge mit 10 Millilitern PBS, das Heparin enthält, über den rechten Ventrikel des Herzens.

Die Entfernung aller verbleibenden Blutzellen aus dem Lungengefäßsystem gilt als abgeschlossen, wenn die Lunge weiß wird. Entfernen Sie anschließend die mediastinalen Lymphknoten und legen Sie sie in eine separate Schale. Verhindern Sie Fit-Se-Quenching, indem Sie die Lichteinwirkung des Gewebes minimieren.

Präparieren Sie dann die durchblutete Lunge und legen Sie sie mit einer Schere in eine Petrischale, um die Lunge zu zerkleinern. Als nächstes verdauen Sie das Lungengewebe bei 37 Grad Celsius in 250 Einheiten pro Milliliter Kollagenase D.Nach 25 Minuten Inkubation fügen Sie der Mischung fünf Minuten lang EDTA hinzu, um die Kollagenaseaktivität zu stoppen. Zum Schluss werden die Fragmente der verdauten Lunge durch ein 100-Mikron-Zellsieb geleitet und die Erythrozyten mit hypotonem Puffer liegen gelassen.

Ziehen Sie die mediastinalen Lymphknoten mit feinen Nadeln auseinander und verdauen Sie sie mit Kollagenase, wie gerade für die Lunge gezeigt, gefolgt von einer Belastung des Gewebes durch ein Zellsieb nach intraperitonealer, Sensibilisierung und Atemwegen. Val in der Herausforderung. Das Vorhandensein von Entzündungszellen kann durch Hämat-, Toin- und Eosin-Färbung in repräsentativen Lungenschnitten aus der Kontrolle beurteilt werden.

Bei mit Kochsalzlösung behandelten Tieren ist das Gewebe frei von Entzündungen, wie die obere Grafik zeigt. Im Gegensatz dazu sind Entzündungszellen in den Lungenabschnitten von Val bei sensibilisierten und herausgeforderten Tieren allgegenwärtig, wie im Boden zu sehen ist. Eine grafische, periodische Säureverschiebungsfärbung kann verwendet werden, um die Schleimproduktion zu beurteilen, wie in dieser unteren Grafik gezeigt.

Die Induktion einer allergischen Entzündung der Atemwege nach Val-in-Provokation bei Val bei sensibilisierten Mäusen wird durch das Vorhandensein von Schleim bestätigt. Umgekehrt zeigt sich eine völlige Abwesenheit von Schleimproduktion durch die Kontrolle. Mit Kochsalzlösung behandelte Mäuse, wie in der oberen Grafik nach val in challenge pulmonalen dcs gezeigt, durchlaufen eine Reifung und anschließende Migration zu den drainierenden Lymphknoten.

Hier zeigt eine repräsentative Analyse von mediastinalen Lymphknoten der Maus, dass ein moderater, aber konsistenter Anstieg des Anteils von CD 11 C-positiven Zellen bei Tieren, die mit Val Boomin sensibilisiert und provoziert wurden, im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen festgestellt wird. Darüber hinaus zeigt die Analyse der absoluten Zellzahl von CD 11 C-positiven CD 11 B-positiven Val Boomin-Fits C-positiven Zellen aus den mediastinalen Lymphknoten von Val bei sensibilisierten und provozierten Mäusen, dass ein um ein Vielfaches höherer Anstieg der DC-Zahlen bei provozierten Mäusen im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Tieren auftritt. Nachdem wir uns dieses Video angesehen haben, sollten wir ein wirklich gutes Verständnis für unsere Technik zur Analyse der Reifung und Migration pulmonaler dendritischer Zellen haben.

Und wenn Sie diese Technik wirklich verstanden haben, können Sie sie weiter modifizieren, um die Reaktionen der pulmonalen dendritischen Zellen auf andere Krankheitserreger sowie andere experimentelle Faktoren zu bewerten.