Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Reifung und Migration pulmonaler dendritischer Zellen oder DCs während einer durch Val Boomin induzierten allergischen Atemwegsentzündung bei Mäusen zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem die Mäuse zunächst mit Val Boomin sensibilisiert und anschließend über die Atemwege mit fluoreszenzmarkiertem Val Boomin herausgefordert werden. Danach werden die Lunge und die mediastinalen Lymphknoten entnommen.

Schließlich wird eine Einzelzell-Suspension aus dem Lungengewebe und den Lymphknoten hergestellt. Letztendlich kann der Reifungsstatus und die absolute Zellzahl der Pullman-Lesedendritischen Zellen, die im mediastinalen Lymphknoten nach FITC Val Boomin-Behandlung gefunden werden, mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Diese Methode kann uns dabei helfen, zentrale Fragen zu pulmonalen Immunantworten zu beantworten, beispielsweise, ob dendritische Zellen eine Reifung durchlaufen, nach Antigenexposition, und ob sie in die drainierenden Lymphknoten migrieren.

Und falls sie wandern, dann, wie hoch die Migrationsrate ist. Beginnen Sie damit, frisch zubereitete Val-Boomin-Lösung tropfenweise im Verhältnis 1:1 in ein Röhrchen mit Alum unter Wirbeln zuzugeben. Rühren Sie die Mischung 30 Minuten lang um und füllen Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze mit 0,2 Millilitern der Mischung.

Halten Sie die zu injizierende Maus mit dem Daumen und Zeigefinger einer Hand am Nackenfell nahe der Schädelbasis fest. Injizieren Sie dann mit der anderen Hand die Val-Boomin-Alum-Lösung in die Bauchhöhle der Maus. Sieben Tage nach der zweiten Injektion von Val in Alum halten Sie ein anästhesiertes, mit Val in Alum sensibilisiertes Tier in aufrechter Position und geben anschließend mit einer sterilen Pipettenspitze 100 Mikroliter frisch zubereitete Val-in-fxi-Lösung tropfenweise auf die NAS der Maus.

Befestigen Sie zunächst eine 20-Gauge-Kanüle an einer Ein-Milliliter-Spritze. Bestätigen Sie danach die Tötung der Maus und öffnen Sie die Brusthöhle des Tieres bis zum Halsansatz, um die Trachea der Maus freizulegen und zu kanülieren. Es ist äußerst wichtig, die Lungen zu lavieren und das Herz zu perfundieren, um sicherzustellen, dass alle kontaminierenden alveolären Makrophagen und mononukleären Zellen, die im peripheren Blut vorhanden sind, entfernt wurden.

Und stellen Sie sicher, dass Sie die nächsten beiden Schritte sorgfältig und natürlich mit ruhiger Hand durchführen. Spülen Sie nun dreimal mit eiskaltem PBS mit EDTA über den Katheter den unteren Respirationstrakt aus, um Zellen aus den alveolären Räumen zu entfernen. Danach befüllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel und perfundieren die Lungen über das rechte Ventrikel des Herzens mit 10 Milliliter PBS, das Heparin enthält.

Die Entfernung verbleibender Blutzellen aus dem Lungenblutgefäßsystem gilt als abgeschlossen, wenn die Lungen weiß werden. Entfernen Sie danach die mediastinalen Lymphknoten und legen Sie sie in eine separate Schale. Vermeiden Sie eine FITC-Verlöschung, indem Sie die Lichtexposition des Gewebes minimieren.

Danach die perfundierten Lungen sezieren und mit einer Schere in eine Petrischale geben, um die Lungen zu zerkleinern. Als Nächstes das Lungengewebe bei 37 Grad Celsius in 250 Einheiten pro Milliliter Kollagenase D verdauen. Nach 25-minütiger Inkubation fügen Sie fünf Minuten lang EDTA zur Mischung hinzu, um die Kollagenase-Aktivität zu stoppen. Abschließend werden die Fragmente der verdauten Lungen durch einen 100-Mikron-Zellsieb filtriert und die Erythrozyten mit einem hypotonen Puffer lysiert.

Lösen Sie die mediastinalen Lymphknoten mit feinen Nadeln vorsichtig auf und verdauen Sie sie anschließend mit Kollagenase, wie zuvor für die Lunge gezeigt, gefolgt von der Filtration des Gewebes durch einen Zellfilter nach intraperitonealer Sensibilisierung und Atemwegsreizung mit Val. Das Vorhandensein von Entzündungszellen kann durch Hämatoxylin- und Eosinfärbung in repräsentativen Lungenabschnitten aus der Kontrollgruppe bewertet werden.

Bei salinbehandelten Tieren sind die Gewebe frei von Entzündungen, wie die obere Grafik zeigt. Im Gegensatz dazu sind entzündliche Zellen in den Lungenschnitten von Val bei sensibilisierten und provozierten Tieren durchgehend vorhanden, wie in der unteren Grafik zu sehen ist. Die Periodsäure-Schiff-Färbung kann zur Beurteilung der Schleimproduktion verwendet werden, wie in dieser unteren Grafik dargestellt.

Die Induktion einer allergischen Entzündung der Atemwege nach einer Val-in-Herausforderung bei Val-sensibilisierten Mäusen wird durch das Vorhandensein von Schleim bestätigt. Umgekehrt zeigt die Kontrollgruppe eine vollständige Abwesenheit der Schleimproduktion. Mit Salin behandelte Mäuse, wie in der oberen Grafik dargestellt, durchlaufen nach der Val-in-Herausforderung eine Reifung der pulmonalen DCs und anschließend eine Migration zu den drainierenden Lymphknoten.

Hier zeigt eine repräsentative Analyse der mediastinalen Lymphknoten von Mäusen, dass bei Tieren, die mit Val Boomin sensibilisiert und herausgefordert wurden, im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen ein moderater, aber konsistenter Anstieg des Anteils an CD11c-positiven Zellen nachgewiesen wird. Darüber hinaus zeigt die Analyse der absoluten Zellzahl an CD11c-positiven, CD11b-positiven, Val-Boomin-fitsC-positiven Zellen aus den mediastinalen Lymphknoten von mit Val sensibilisierten und herausgeforderten Mäusen, dass eine mehrfach höhere Zunahme der DC-Zahlen bei herausgeforderten Mäusen im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Tieren auftritt. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten wir ein sehr gutes Verständnis unserer Technik zur Analyse der Reifung sowie der Migration pulmonaler dendritischer Zellen besitzen.

Und sobald Sie diese Technik wirklich verstanden haben, können Sie sie weiterentwickeln, um die Reaktionen pulmonaler dendritischer Zellen auf andere Pathogene sowie auf andere experimentelle Faktoren zu untersuchen.