Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine Population gesunder Stammzellen neben stammzellabliertem Gewebe innerhalb eines Parian zu positionieren, um das Verhalten von Stammzellen und Nachkommen in vivo während der Regeneration zu analysieren. Dies wird erreicht, indem entweder ein unbestrahlter oder ein mit Blättern bestrahlter Parian für weitere Manipulationen betäubt und immobilisiert wird. Als nächstes wird der immobilisierte, unbestrahlte Parian teilweise mit Blei abgeschirmt und dann mit Röntgenstrahlen bestrahlt, wodurch ein unverletzter Parian mit stammzellabgetragenem Gewebe entsteht, das dem abgeschirmten Gewebe gegenübergestellt wird, das stammzellbeladen bleibt.

Alternativ kann ein Gewebetransplantat, das von einem nicht bestrahlten Spender entnommen wurde, in einen zuvor bestrahlten Wirt transplantiert werden, um ein Parian mit einer isolierten Population von Stammzellen zu erzeugen. Fally in einer ansonsten Stammzelle. Es werden Ergebnisse für ablierte Wirte erhalten, die isolierte Stammzellpopulationen neben den Stammzellen zeigen, die durch Whole Mount RNA in situ abliert wurden, zwei Hybridisierungen für Stammzellmarkergene.

Die hier beschriebenen Methoden zielen darauf ab, Regenerationsplanarien besser zu verstehen, indem das Verhalten von Stammzellen sowohl im Transplantationsparadigma als auch in einem partiellen Bestrahlungsparadigma untersucht wird, was es uns ermöglicht zu testen, ob das umgebende Gewebe und die lokale Umgebung, in der sich diese Stammzellen befinden, das Verhalten dieser Neoblasten oder Stammzellen beeinflussen oder beeinflussen oder nicht. Während des Regenerationsprozesses, ein bis zwei Monate vor dem Experiment, füttern Sie den Plin gemäß dem beigefügten Manuskript. Um in dieser Demonstration die gewünschte Größe zu erhalten, werden Platten zwischen ein und zwei Zentimetern Länge und einer Breite von mehr als zwei Millimetern gewählt.

Dann werden sie drei bis sieben Tage vor der Verwendung ausgehungert. Bereiten Sie als nächstes die Chlortonlösung vor, ein mildes Lokalanästhetikum, indem Sie 0,1 bis 0,2 % Gewicht pro Volumen im parischen Wasser auflösen. Dann kühlen Sie die Lösung für die Gewebetransplantation mit einem Bunsenbrenner auf Eis ab, biegen Sie ein Kapillarrohr mit einem Innendurchmesser von 0,75 Millimetern in einem bis zwei Zentimeter vom Ende bis zu einem 90-Grad-Winkel, um das Transplantatgewebe zu schneiden.

Biegen Sie dann ein weiteres Kapillarrohr mit einem Außendurchmesser von 0,7 Millimetern ein bis zwei Zentimeter vom Ende entfernt in einen 90-Grad-Winkel, um ein Loch in den Wirt zu schaffen, um das Transplantat aufzunehmen. Schneiden Sie als Nächstes das schwarze Filterpapier watman aus. Nummer drei, Filterpapier, Kim-Tuch und Zigarettendrehpapier gemäß den Größen, die im begleitenden Manuskript angegeben sind.

Bereiten Sie danach die modifizierte Holt Fers-Lösung und die mit Cain gesättigte Holt Fretter-Lösung vor. Kühlen Sie beide auf vier Grad Celsius. Befestigen Sie dann ein gefaltetes Kim-Tuch an einem Quadrat aus Paraform.

Legen Sie es auf die Peltier-Kühlplatte oder ein anderes Kühlgerät unter ein Präpariermikroskop. Tränken Sie anschließend das Kim-Tuch mit gekühlter Holt Fretter-Lösung. Legen Sie dann zwei schwarze Filterpapierrechtecke auf das Kim-Tuch.

Lege nun ein Stück Watman Nummer zwei Filterpapier in eine Petrischale. Befeuchten Sie das Filterpapier mit Holt Fretter-Lösung. Dann das Gericht zur teilweisen Bestrahlung auf Eis abkühlen lassen.

Legen Sie eine größere Papiereinlage in eine größere Schale, ähnlich wie bei einer Gewebetransplantation. Befeuchten Sie das Filterpapier mit Holt Fretter-Lösung. Anschließend das Gericht auf Eis kalt stellen.

Füllen Sie bei diesem Verfahren eine Petrischale mit gekühlter Klonlösung. Pipettieren Sie die Planarien zur Transplantation in die Schale. Betäuben Sie jeweils nur einen Wirt und einen Spender.

Bei der Teilbestrahlung können viele Tiere auf einmal betäubt werden. Lassen Sie dann die Paria fünf bis 10 Minuten lang in der Cleone-Lösung einweichen, bis sie bewegungslos werden. Spülen Sie die Paria ab, indem Sie sie in eine Schale pipettieren, die mit gekühlter Holt-Fretter-Lösung gefüllt ist.

Immobilisieren Sie danach den Plin-Bereich, indem Sie sie auf die schwarzen Filterpapiere pipettieren, die mit gekühlter Holt-Fretter-Lösung getränkt sind. Richten Sie sie dann mit einer Pinzette mit der Bauchseite nach unten aus. Legen Sie nun eine zuvor vorbereitete gekühlte Petrischale in einen Eiskübel, der in einen Röntgenstrahler mit Top-Quelle passt.

Ordnen Sie den betäubten Plin-Bereich in einer Petrischale an, indem Sie die schwarzen Filterpapiere bewegen. Übertragen Sie sie dann in den Röntgenstrahler der oberen Quelle und platzieren Sie den Eiskübel so, dass der Abstand von der Kathodenröhre zum Paria minimiert wird. Dadurch wird die effektive Dosisleistung maximiert.

Positionieren Sie dann die Bleiabschirmungen zwischen dem Paria und der Kathodenröhre für die Dosis der Röntgenstrahlen. Wenn eine vollständige Stammzellablation aus nicht abgeschirmten Regionen gewünscht wird, liefern Sie 30 Grautöne oder mehr. Unmittelbar nach der Röntgenemission wird das Parian in gekühltes Parianwasser überführt.

Lassen Sie danach das parische Wasser auf Zimmertemperatur erwärmen und die Tiere können sich vom schwarzen Filterpapier lösen. Das Verfahren der Teilbestrahlung ist nun abgeschlossen. Um diesen Vorgang unter dem Präpariermikroskop zu beginnen, ordnen Sie den anästhesierten Wirts- und Donorplinbereich auf separaten rechteckigen schwarzen Filtern auf dem Kim-Tuch an, das bereits auf dem Peltier- oder Kühlteller abgekühlt wurde.

Verwende ein Kapillarrohr mit einem Innendurchmesser von 0,75 Millimetern, um den Transplantatstopfen aus dem Spender herauszuschneiden. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um sie auf einen abgelegenen Teil des Wirts zu legen. Verwenden Sie dann ein Kapillarrohr mit einem Außendurchmesser von 0,7 Millimetern, um einen Stopfen vom Host zu entfernen.

Positionieren Sie anschließend das Transplantat in der Bohrung. Übertragen Sie den transplantierten Wirt auf dem rechteckigen schwarzen Filterpapier in die zuvor vorbereitete Petrischale. Befeuchten Sie ein Blatt Rollpapier mit Caine gesättigter Holt Fretter-Lösung.

Legen Sie es dann auf den transplantierten Wirt. Als nächstes tränken Sie vier Stücke Filterpapier mit gesättigter Holter-Lösung, und falls das transplantierte Wirtssub anschließend vier Bündel geschnittener Schnitte einweicht, wischen Sie Kim mit gesättigter Holt-Fretter-Lösung ab. Lege sie auf die Filterpapiere.

Schließen Sie danach den Deckel. Stelle die Petrischale auf Eis. Übertragen Sie dann das Spender-Parian zur Genesung und Regeneration in das Parian-Wasser.

Wenn alle Transplantationen abgeschlossen sind, legen Sie den transplantierten Parian über Nacht in einen 10 Grad Celsius heißen Inkubator. Am nächsten Morgen geben Sie es in eine Petrischale, die mit parischem Wasser gefüllt ist. Lassen Sie den Parian sich entweder vom Filterpapier lösen oder entfernen Sie ihn vorsichtig mit einer Pinzette und wechseln Sie das Parianwasser danach alle zwei bis drei Tage.

Die Hole-Mount-in-situ-Hybridisierung in der bestrahlten, aber vollständig abgeschirmten Kontroll-Parian, die drei Tage nach der Bestrahlung fixiert war, zeigt eine Stammzellverteilung, die nicht von der des Wildtyp-Parian zu unterscheiden ist. Auf der anderen Seite scheinen bei der Parian, die nur teilweise abgeschirmt war, die vorderen und hinteren Teile freizulegen, die Stammzellen von den nicht abgeschirmten Regionen abgetragen zu haben. Hier sehen Sie die dorsale und ventrale Ansicht eines erfolgreich transplantierten Pariers.

Drei Tage nach der Transplantation ist das Transplantat sowohl auf der dorsalen als auch auf der ventralen Oberfläche deutlich sichtbar und an der Grenzfläche des Transplantatwirts von charakteristischem unpigmentiertem Gewebe umgeben. Die erfolglose Transplantation zeigt jedoch kein sichtbares Transplantatgewebe an der Transplantationsstelle. Die In-situ-Hybridisierung des gesamten Mount zeigte das Vorhandensein von Stammzellen nur in oder um die Transplantatstelle, was auf den Erfolg der Transplantation hinweist, sobald sie gemeistert wurde.

Transplantationen können in nur fünf Minuten durchgeführt werden. Mit Erfolgsraten von nahezu 90 bis 100 % kann die Teilbestrahlung stark ausgeweitet werden. Angenommen, die Feldgröße Ihres Bestrahlungsgeräts ist ausreichend groß.