Charakterisierung der molekularen Mechanismen der

Dieses Video zeigt eine Methode zur Induktion von Katarakten mittels ultravioletter Strahlung beim Ratten. Die an der Kataraktentwicklung beteiligten molekularen Mechanismen werden anschließend mittels quantitativer Echtzeit-PCR und immunzytochemischer Verfahren untersucht. Zunächst wird das Auge einer Ratte ultravioletter Strahlung ausgesetzt, um die Bildung eines Katarakts zu induzieren.

Das andere Auge dient als Kontrolle. Anschließend werden die Linsen präpariert und aufgearbeitet, um RNA zu gewinnen, mit der die Expressionsniveaus von CAS B'S drei mittels quantitativer Echtzeit-PCR bestimmt werden, oder sie werden mit einem Antikörper gegen kaspierte Caspase gefärbt, um die Expression und Lokalisation des aktiven Proteins zu untersuchen.

Letztlich bestätigen die Ergebnisse dieser Assays einen Anstieg der Caspase-3-mRNA sowie der Expression des aktiven Proteins im Zellkern der Linsenzellen nach Exposition gegenüber UVR. Der Hauptvorteil dieses Protokolls gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass es eine einzigartige, schmalbandige UVR-Quelle und eine universelle Ratte-Haltevorrichtung verwendet, wodurch wir sicher und präzise Tiere mit einem gut definierten UV-Spektrum und einer definierten Dosis bestrahlen können. Darüber hinaus haben wir moderne biologische Techniken, die quantitative RT-PCR und die immunhistochemische Färbung, angewandt, um die Apoptose in der Linse zu untersuchen. Die Dodi-Methode kann somit Aufschluss über die molekularen Mechanismen der durch ultraviolette Strahlung induzierten Kataraktbildung geben.

Sie kann auch auf andere experimentelle Modelle angewendet werden, wie beispielsweise ultraviolette, strahleninduzierte Hautkrebsmodelle, die Verhaltensneurowissenschaften an Ratten sowie die experimentelle Augenforschung mit Fokus auf Apoptose. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie eine anästhesierte weibliche Sprague-Dawley-Ratte in eine Rattenhalterung legen und, ohne den Rumpf zu zusammendrücken, die Gurte so festziehen, bis die Ratte fixiert ist. Um eine Mydriasis oder Pupillenerweiterung hervorzurufen, geben Sie ein bis zwei Tropfen einer 10 Milligramm pro Milliliter Lösung von Tpic-Aid in jedes Auge.

Tragen Sie dann Salbe auf das nicht-exponierte Auge auf und schützen Sie es mit schwarzem Klebeband, um UV-Strahlung zu blockieren. Danach positionieren Sie das Tier in der Haltevorrichtung, sodass das freiliegende Auge einem engen Strahl ultravioletter Strahlung mit 300 Nanometern und einer Halbwertsbreite von 10 Nanometern ausgesetzt ist, erzeugt durch eine Hochdruck-Quecksilberlampe. Bestrahlen Sie die Ratte einseitig 15 Minuten nach der Exposition mit einer unterhalb der Schwelle liegenden Dosis von einem Kilojoule pro Quadratmeter UVRB.

Entfernen Sie das Pflaster vom nicht bestrahlten Auge und tragen Sie Salbe auf beide Augen auf. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und decken Sie es mit weichem Papier ab, um es warm zu halten. Überwachen Sie das Tier, bis es ausreichend bei Bewusstsein ist, um die Brustlage aufrechtzuerhalten.

Danach die wiederhergestellte Ratte zurück in den Käfig mit den anderen Tieren bringen. 1, 5, 24 und 120 Stunden nach der Exposition.

Legen Sie das enukleierte Auge der euthanasierten Ratte mit der Hornhaut nach unten und der hinteren Seite nach oben auf ein weiches Papiertuch. Arbeiten Sie dann unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie eine 27-Gauge-Kanüle, um ein minimales Loch zu stanzen, indem Sie tangential zur Sklera drücken, um die Linse, die sich sehr nahe an der Sklera befindet, nicht zu beschädigen.

Danach mit einem Paar Augenchirurgie-Scheren zirkulär direkt hinter der Limbus schneiden, bis der hintere Teil der Sklera abgehoben werden kann. Anschließend mit stumpfen gebogenen Pinzetten die Linse anheben, in eine isotonische Salzlösung legen und Reste des Ziliarkörpers von der Linse entfernen. Die Linse sollte nicht länger als 10 Minuten in der isotonischen Salzlösung aufbewahrt werden.

Nach der Dissektion eine Linse in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 350 µL RA, einem Lysepuffer aus dem Nucleo Spin RNA II-Gesamt-RNA-Isolationskit, und 3,5 µL β-Mercaptoethanol geben. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die Linse mit einer Nadel mechanisch homogenisieren, bis nur noch der harte Zellkern übrig ist. Kortex und Kapsel der Linse werden durch den Lysepuffer aufgelöst.

Entfernen Sie den Zellkern aus der Mischung und entsorgen Sie ihn. Lagern Sie die Proben sofort bei minus 70 Grad Celsius. Die Proben können bis zu einem Jahr gelagert werden, bis sie weiterverarbeitet werden sollen.

Isolieren Sie die RNA gemäß dem Protokoll des Kits zur Gesamt-RNA-Reinigung aus kultivierten Zellen und Gewebe. Lagern Sie die RNA-Proben bei minus 70 Grad Celsius. Um eine ausreichende Entfernung der DNA aus jeder Probe zu überprüfen, amplifizieren Sie die DNA unter den folgenden Bedingungen unter Verwendung von p53-DNA-spezifischen Primern.

Schritt 1: 95 Grad Celsius für zwei Minuten. Schritt zwei: 40 Zyklen bei 95 Grad Celsius für 20 Sekunden. 55 Grad Celsius für 20 Sekunden.

72 Grad Celsius für 20 Sekunden. Schritt 3: 72 Grad Celsius für sieben Minuten. Nach Abschluss des Laufs die Produkte auf einem 1,5 %igen Agarosegel laufen lassen.

Um das spezifische DNA-PCR-Produkt von 243 Basenpaaren nachzuweisen, sollten unbedingt eine positive und eine negative Kontrollprobe mitgeführt werden. Falls die DNA erfolgreich entfernt wurde, werden keine PCR-Produkte sichtbar sein. Eine Bande sollte nur in der positiven Kontrollspur sichtbar sein, wobei ein NanoDrop-Spektrophotometer verwendet wird, um die Konzentration der RNA-Proben zu messen und das Verhältnis von RNA zu Protein zu bestimmen.

Wenn das Verhältnis von RNA zu Protein aus der Absorption der RNA-Probe oder das Verhältnis 260/280 2,0 oder höher ist, ist die RNA-Probe rein. Verwenden Sie anschließend ein Mikrogramm RNA, um cDNA mittels eines First-Strand-cDNA-Synthese-Kits für die RT-PCR zu synthetisieren, und lagern Sie die cDNA-Proben bei minus 20 Grad Celsius. Führen Sie als Nächstes eine quantitative Echtzeit-PCR durch, indem Sie die Proben dreifach in eine 96-Loch-Platte auftragen.

Jede Vertiefung sollte ein Mikroliter der CD-NNA-Probe in Kombination mit dem TAC-Man-Genexpressions-Assay für Caspase-3 auf einer separaten Platte enthalten. Verwenden Sie dieselben Proben, jedoch mit dem TAC-Man-Genexpressions-Assay für 18S. Erstellen Sie anschließend eine Standardkurve für die Analyse, indem Sie ein Mikroliter cDNA aus drei zufällig ausgewählten nicht bestrahlten Linsen seriell verdünnen.

Führen Sie serielle Verdünnungen gemeinsam mit dem cDNA aus den Proben durch. In einer 96-Loch-Platte auf jeder Platte. Zentrifugieren Sie die Platte, anschließend führen Sie sie auf einem I cycler my iq, Single-Color-Echtzeit-PCR-Nachweissystem durch.

Nach dem Durchlauf unter Verwendung der my-IQ-Software. Erstellen Sie eine Standardkurve, die die Anzahl der Zyklen am Schwellenwert als Funktion der relativen Konzentration des Kalibrators für die seriellen Verdünnungen in jeder Platte ausdrückt. Verwenden Sie die Standardkurve, um die relative Konzentration der gemessenen Probe-cDNA anhand der Schwellenzyklenzahl für jede Probe zu bestimmen.

Bestimmen Sie abschließend die Expressionsstärke der Zielgene, indem Sie die relative Konzentration der Ziel-cDNA zur internen Kontrolle 18S-cDNA in Beziehung setzen. Führen Sie zur Durchführung der immunhistochemischen Färbung die Enukleation des Auges durch und legen Sie es nach der Präparation in PBS. Überführen Sie das Auge in ein Reagenzglas, das mit 4 % Paraformaldehyd gefüllt ist, und inkubieren Sie es 20 Minuten lang auf Eis.

Mit einer Mikropipette das Paraformaldehyd entfernen. Anschließend das Auge in ein zwei Milliliter fassendes Eppendorf-Röhrchen überführen, das ein Milliliter eiskalte PBS enthält, und 20 Minuten auf Eis inkubieren. Danach das Auge in ein Eppendorf-Röhrchen überführen, das 30 %iges Saccharose enthält.

Übernacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Augen mit einer Pinzette in einen mit optimalem Schneidetemperatur- oder OCT-Medium gefüllten Behälter überführen. Die Augen zur Schnittführung in eine gerade Position bringen.

Danach die Schale auf Trockeneis stellen, um sie bei minus 70 Grad Celsius einzufrieren und aufzubewahren, bis die Augenprobe für die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie geschnitten wird. Beginnen Sie damit, das in OCT eingebettete Auge auf einer Spannvorrichtung im Kryostaten für die Kryoschnitte vorzubereiten. Bemühen Sie sich, die flachste Seite der Augenlinse parallel zur Klingenkante auszurichten.

Schneiden Sie drei midsagittale Schnitte mit je fünf Mikrometer Dicke aus einem zentralen Bereich jeder Linse. Entsorgen Sie mindestens sechs Schnitte zwischen aufeinanderfolgenden Schnitten, um zu vermeiden, dass dieselben Zellkerne in verschiedenen Schnitten angefärbt werden. Sobald ein Schnitt angefertigt wurde, legen Sie vorsichtig einen Objektträger darauf.

Der Schnitt sollte dann auf dem Objektträger haften. Lassen Sie die Objektträger vor der Verwendung an der Luft trocknen. Die Objektträger können bis zur erforderlichen Verwendung für die Färbung bei minus 70 Grad Celsius gelagert werden.

Lassen Sie die Objektträger auf Raumtemperatur zurückkehren. Führen Sie dann die Antikörperanfärbung zur Identifizierung der gespaltenen CAS-Phase drei wie in dem begleitenden Dokument beschrieben innerhalb weniger Stunden durch und untersuchen Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop. Zählen Sie alle Kerne der Linsenepithelzellen.

Zählen Sie die Anzahl aller Linsenepithelkerne durch Erfassung der DAPI-gefärbten Zellen sowie die Anzahl der Caspase-3-positiven Kerne durch Zählung der aktiven Caspase-3-gefärbten Zellen. Zählen Sie die Zellen dreimal pro Schnitt.

Caspase-3 ist eine zentrale Protease im Vollzugsstadium der Apoptose. Transmissionselektronenmikroskopie. Studien belegen, dass UVR-Apoptose in der Linse induziert.

Experimentelle Untersuchungen zur Apoptose bestätigen, dass Caspase-3 ein zuverlässiger Marker der Apoptose ist. Um zu ermitteln, ob eine in-vivo-UV-Bestrahlung die Expression von Caspase-3 induziert, wurde die mRNA-Expression in der Augenlinse mittels qPCR 1, 5, 24 und 120 Stunden nach der in-vivo-Bestrahlung mit einem Kilojoule pro Quadratmeter UVR bei 300 Nanometern gemessen. Danach wurde das mittlere Verhältnis von CASP3 mRNA zu 18S-rRNA zwischen bestrahlter Linse und der kontralateralen, nicht bestrahlten Linse für jeden Zeitpunkt aufgetragen.

Diese Abbildung zeigt die Expression der Caspase-3-mRNA über die Zeit und veranschaulicht die Transkription des programmierten Zelltods (Apoptose). Der Markermolekül Caspase 3 in der Linse in vivo nach Exposition gegenüber fernen UVR im Rahmen einer orthogonalen Testung ergab einen statistisch signifikanten Unterschied im Caspase-3-mRNA-Signal zwischen einem Latenzintervall von 120 Stunden und kürzeren Latenzintervallen. Die Caspase-3-Expression in einer bestrahlten und nicht bestrahlten Linse wurde zudem mittels Immunfluoreszenzmikroskopie verglichen, wie in diesen Bildern 24 Stunden nach der Exposition gezeigt; die Kerne sind markiert und weisen auf das Vorhandensein aktiver Caspase 3 hin.

Diese Immunfärbungsmethode liefert wertvolle Informationen zur räumlichen Verteilung epithelialer Zellen, die im Linsengewebe mit dem Apoptose-Marker Caspase-3 markiert sind. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man experimentell eine durch U-V-V-U-V-R hervorgerufene Linsentrübung induziert und die molekularen Mechanismen des durch fünf UVR-Bestrahlungen induzierten Katarakts mittels quantitativer RT-PCR und Immunhistochemie untersucht.