In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Dieses Experiment demonstriert die in ovo-Elektroporation des Hühnermittelhirns, um den Einfluss der exogenen Genexpression auf die Entwicklung des Mittelhirns und die Differenzierung dopaminerger Neuronen zu untersuchen. Zunächst wird das Mittelhirn von Hamburger-Hamilton-Stage-11-Hühnerembryonen mit dem gewünschten Plasmid-DNA injiziert, um die exogene DNA gezielt in die sich entwickelnde Mittelhirnbläschenregion einzubringen. Anschließend wird mithilfe selbstgefertigter kleiner Elektroden das Mittelhirnbläschen elektroporiert, um die exogene DNA spezifisch in die neuralen Vorläuferzellen des Mittelhirns zu übertragen.

Anschließend werden Embryonen des Stadiums 23 mit guter M-Cherry-Expression im Mittelhirn gewonnen und optimale transversale Schnitte durch das Mittelhirn hergestellt. Letztendlich kann eine Immunfärbungsanalyse für Marker dopaminergener Neuronen, wie beispielsweise Tyrosinhydroxylase, die Differenzierung neuraler Vorläuferzellen in reife dopaminerge Neuronen zeigen, die durch die Expression von Genen des Interesses induziert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen etablierten Methoden der In-ovo-Elektroporation besteht darin, dass mit diesem Protokoll eine membranspezifische Elektroporation erreicht werden kann, um die Differenzierung mirin-dopaminergener Neuronen zu untersuchen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Entwicklung des Mittelhirns ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Bereiche des Nervensystems anwenden, um Analyse der Zelllinienverfolgung durchzuführen und die Regulation der Genexpression zu untersuchen. Um Hamburger-Hamilton-Embryonen des Stadiums 11 zu erhalten, positionieren Sie jedes befruchtete Ei seitlich und kennzeichnen Sie die Oberseite mit einem Bleistiftstrich. Anschließend stellen Sie die Tabletts auf einen Schüttler in einen vorgewärmten, befeuchteten Inkubator.

Überprüfen Sie alle 24 Stunden ab 41 Stunden nach der Befruchtung die Luftfeuchtigkeit und den Wasserstand. Entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Reinigen Sie die Oberfläche jedes Eis mit 70 % Ethanol und wischen Sie sie ab.

Platzieren Sie nun zwei vier Zentimeter lange Streifen Klebeband nebeneinander auf einem Ei, um über dem Bleistiftstrich ein großes Rechteck zu bilden. Glätten Sie das Klebeband am Ei entlang, um das Fenster mit einer 10-Milliliter-Spritze, die an eine 18-Gauge-Nadel angeschlossen ist, einzurahmen. Durchstechen Sie die Eierschale, wobei Sie die Nadel so neigen, dass sie vom Eigelb wegzeigt, um den Embryo nicht zu stören oder zu beschädigen.

Ziehen Sie fünf Milliliter Albumin aus dem Ei. Reinigen Sie die Nadel mit 70 % Ethanol. Trocknen Sie die Nadel, bevor Sie das nächste Ei durchstechen.

Geben Sie die Einstellungen für den braunen Mikropipettenzieher ein. Ziehen Sie dann dünnwandige Kapillarröhrchen mit einer P-10-Pipette zu Injektionsnadeln. Saugen Sie fünf bis 10 Mikroliter der Plasmidlösung in eine Kapillarpipettenspitze mit langem Ende auf.

Dann laden Sie die Glasnadel langsam in einer durchgehenden Säule ohne Luftblasen. Setzen Sie die beladene Nadel in den Nadelhalter, der am Mikromanipulator und Mikroinjektor befestigt ist. Schneiden Sie nun unter einem Stereomikroskop bei dunklem Hintergrund zur besseren Sichtbarmachung der Nadel die Nadel an der Stelle mit einer Federzange ab, an der die grüne Flüssigkeit endet.

Schneiden Sie ein Fenster mit einem Durchmesser von zwei bis zweieinhalb Zentimetern aus dem vorherigen Nadeleinstich aus. Zum Ziehen von Albumin. Drehen Sie das Ei in der Hand, während Sie schneiden.

Denken Sie daran, die Schere zwischen den Eiern mit einem mit 70 % Ethanol gesättigten Kim-Wipe abzuwischen. Fahren Sie fort, das Hühnerembryo unter einem Stereomikroskop zu betrachten. Falls erforderlich, visualisieren Sie das Embryo, indem Sie 0,22 Mikrometer filtriertes 20 % Indienink in PBS unter das Hühnerembryo injizieren. Positionieren Sie das Embryo parallel zum Weg der Nadel, wobei der Kopf von der Nadel wegzeigt.

Stechen Sie langsam in einem Winkel von 45 Grad in das Neuralrohr an der Verbindungsstelle zwischen Mittel- und Hinterhirn. Beginnen Sie die Injektion mit den Mikroinjektoren (Pico Spritzer) bei einer Dauer von 25 Millisekunden. Passen Sie die Zeit je nach Nadelschnitt an und füllen Sie nur das Neuralvesikel, das das Mittelhirn darstellt, mit Plasmid-DNA, die Fast-Green-Farbstoff enthält.

Nachdem die Injektionsnadel entnommen wurde, drei Tropfen Pen-Strep-Lösung auf das Embryo geben. Die Einstellungen des B-T-X-E-M-C eight 30 Electro Por zur effizienten Elektroporation überprüfen. Bei der ventralen Mittelhirnposition befinden sich die kleinen, speziell angefertigten L-förmigen Platinelektroden auf gleicher horizontaler Ebene wie der Boden des Neuralrohrs, sodass das embryonale Mittelhirn mittig zwischen den beiden Elektroden liegt.

Drücken Sie einmal den BTX-Fußschalter und beobachten Sie die Luftblasen, die sich um die Elektroden bilden. Nach jeder erfolgreichen Elektroporation entfernen Sie die Elektroden vorsichtig aus dem Ei und wischen Sie die Elektroden ab. Mit einem mit 70 % Ethanol getränkten Chemiewisch, geben Sie drei weitere Tropfen Pen-Strep-Lösung auf den Embryo.

Bedecken Sie das Fenster nun mit einem fünf Zentimeter mal fünf Zentimeter großen Stück durchsichtigem Verpackungsband. Ohne den Inhalt des Eis zu berühren, verschließen Sie das Ei sorgfältig und stellen Sie die Eier zurück in den Inkubator, wobei die Drehteller ausgeschaltet sind. Wenn der gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist, gewinnen Sie lebende Embryonen und sammeln sie je nach Versuchsbedingung in einer gemeinsamen mit PBS gefüllten Petrischale.

Danach ein fluoreszierendes Auflichtmikroskop. Untersuchen Sie die geernteten Embryonen auf mCherry-Expression und überführen Sie die positiven Embryonen in einzelne Vertiefungen einer 24-Loch-Platte. Füllen Sie jede Vertiefung mit einem Milliliter frisch hergestellter 2 %igen Paraformaldehydlösung und inkubieren Sie drei Stunden bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die fixierten Embryonen dreimal in PBS und geben Sie die Embryonen in 15 % Saccharose, bis sie nach der Equilibrierung aufschwimmen. Wiederholen Sie die Equilibrierung in 30 % Saccharose und betten Sie anschließend jeden Embryo in OCT ein, wobei die Embryonen korrekt ausgerichtet werden müssen, um optimale Querschnitte des Mittelhirns für nachfolgende Analysen zu erhalten.

Stellen Sie 18 µm dicke Kryostatschnitte des dicken Mittelhirns für die nachgeschaltete Analyse im in ovo-Elektroporationsassay hh des embryonalen Hühnermittelhirns her. Stadium-11-Hühnerembryonen werden mit einem Plasmid-Cocktail aus dem mCherry-Fluoreszenzmarker und Genen von Interesse sowie einem mit Fast-Green gefärbten Tracer für den Injektionsprozess injiziert. Nach der Mittelhirn-Elektroporation werden die Embryonen weiter inkubiert, und die mCherry-positiven Embryonen werden geerntet, fixiert und eingebettet.

Anschließend werden Schnitte aus dem Mittelhirn in Kryoschnitten hergestellt. Die Proben werden mittels Immunfärbung mit Markern für das Mittelhirn, wie beispielsweise Tyrosinhydroxylase, in erfolgreich injizierten und elektroporierten Hühnerembryonen analysiert. Der mCherry-Ausdruck ist typischerweise im Mittelhirnbereich nach weiterer Entwicklung unter Verwendung der mCherry-Expression als Injektionsmarker sichtbar.

Embryonen mit korrekter mCherry-Expression werden anschließend fixiert, eingebettet und orientiert, um Schnitte des Mittelhirns für die Kryosektion vorzubereiten. Hier wird die Spezifizierung des dopaminergen Zellschicksals in elektroporierten neuronalen Vorläuferzellen durch die Kolokalisation von mCherry und dem mit einer Flag-Tag markierten Gen mit dem Marker für dopaminerge Neurone, der Tyrosinhydroxylase, untersucht. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Genexpression räumlich auf Vorläuferzellen embryonaler dopaminergen Neurone des Mittelhirns beschränkt werden kann, einschließlich der gezielten Injektion von DNA-Konstrukten in den Bereich des Mittelhirns und der präzisen Lokalisierung der Elektroporation mithilfe kleiner, speziell angefertigter Elektroden im Anschluss an dieses Verfahren.

Andere Methoden wie die durch RNI vermittelte Genabschaltung oder die Expression von Enhancern, die mit Reportergenen verknüpft sind, können verwendet werden, um die Genfunktion und Genregulation in spezifischen Bereichen und Zelltypen des Nervensystems zu untersuchen.