Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als In Vitro Blut-Hirn-Barriere Modell

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine homogenisierte, immortalisierte Hirnendothelzellkultur zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gehirne von neugeborenen Mäusen isoliert und eine Einzelzell-Suspension gewonnen wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit dem Polyoma-Middle-T-Antigen zu immortalisieren.

Anschließend wachsen die Zellen etwa vier Wochen lang, bis sich eine homogene endotheliale Monoschicht gebildet hat. Der letzte Schritt besteht darin, die neue Zelllinie mittels Techniken wie Immunfärbung, Western Blot und Q-Q-P-C-R zu charakterisieren. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Therapie neuroinflammatorischer oder ischämischer Hirnerkrankungen, da präklinische Therapiebewertungen und Erkenntnisse zur Pathophysiologie gewonnen werden können.

Den Versuch wird Dr. Elaine Salvador, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Nachdem das Gehirn einer drei bis fünf Tage alten neugeborenen Maus in eine Petrischale mit Puffer A überführt wurde, werden für jede Präparation die Gehirne von fünf bis zehn Mäusen benötigt, wobei unter einer laminarer Luftstromhaube gearbeitet wird. Entfernen Sie das Kleinhirn, den Hirnstamm, die Hirnhäute und Kapillarfragmente aus jedem Gehirn.

Überführen Sie anschließend die Großhirne in eine zweite Petrischale, die Puffer A enthält. Schneiden Sie die Großhirne mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke und aspirieren und expulsieren Sie das Gewebe und den Puffer mithilfe einer 10-Milliliter-Pipette, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind. Überführen Sie die Suspension danach in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, nachdem das Gehirngewebe bei 250 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert wurde. Entsorgen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 4,5 Milliliter Puffer A mit 1,5 Milliliter 0,75 % Gewicht pro Volumen auf.

Kollagenase dis Platz. Inkubieren Sie das Gewebe und die Kollagenase-Lösung 45 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius mit gelegentlicher Agitation. Bereiten Sie derweil die Zellkulturplatten vor, indem Sie vier Vertiefungen einer 12-Loch-Platte mit einer sterilen Lösung von 0,1 Milligramm pro Milliliter beschichten.

Kollagen vier und 50 Millimolar Essigsäure ermöglichen es dem Kollagen, sich eine Stunde lang bei Raumtemperatur an die Vertiefungen anzulagern. Sobald die 45-minütige Inkubationszeit abgelaufen ist, stoppen Sie die Verdauung des Gehirngewebes, indem Sie 15 Milliliter Puffer A hinzufügen, und resuspendieren Sie das Pellet gründlich in dieser Lösung. Anschließend zentrifugieren Sie bei 250 × g für 10 Minuten und verwerfen den Überstand.

Als Nächstes, um Myelin aus der Präparation zu entfernen, 10 Milliliter steriles, 25 % Gewicht pro Volumen BSA in PBS zum Gewebe geben und bei 1.000 ×g für 20 Minuten bei 4 °C zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Überstand vorsichtig entfernen und das Pellet in 15 Milliliter Puffer A auflösen, in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und erneut bei 250 ×g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. In der Zwischenzeit die mit Kollagen IV beschichtete Platte zweimal mit PBS waschen.

Nach der zweiten Wäsche lassen Sie zwei der Vertiefungen leer und geben Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium in die anderen beiden Vertiefungen. Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspendieren Sie das Zellpellet, das hauptsächlich aus endothelialen Zellen besteht, in vier Milliliter Wachstumsmedium, das vier Mikrogramm pro Milliliter Puramycin enthält, und geben Sie zwei Milliliter der Zellsuspension in jede der beiden leeren, mit Kollagen beschichteten Vertiefungen. Inkubieren Sie für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius, um schnell adhärierende nicht-endotheliale Zellen abzutöten. Danach saugen Sie das Wachstumsmedium von den beiden Vertiefungen, die keine Zellen enthalten, ab und verwerfen es.

Überführen Sie dann das Medium, das die nicht angehefteten Zellen enthält, einschließlich der endothelialen Zellfraktion, in diese beiden Vertiefungen. Befüllen Sie die vorherigen Vertiefungen erneut mit zwei Milliliter frischem Medium. Diese Vertiefungen enthalten andere Zelltypen wie Fibroblasten und Astrozyten und können parallel kultiviert sowie für morphologische Vergleiche verwendet werden.

Inkubieren Sie die Zellen am nächsten Tag über Nacht im Zellkulturschrank. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium und kultivieren Sie die GPE-neo-Fibroblasten, die ein replikationsdefektes Virus mit dem Polyoma-Middle-T-Onkogen in gelatinebeschichteten Flaschen enthalten. Die Transfektion des GPE-neo-Mediums mit dem Polyoma-Middle-T-Onkogen verleiht endothelialen Zellen einen Wachstumsvorteil gegenüber nicht-endothelialen Zellen, was zu einer homogenen Zellschicht mit endothelialer Morphologie führt. Nach vier bis sechs Wochen Kultivierung sind GPE-neo-Zellen nicht kommerziell erhältlich und können als gemeinsam genutztes öffentliches Material bezogen werden.

Nachdem die GPE Neo Fiberblast 24 Stunden lang kultiviert wurden, entfernen Sie 10 Milliliter des Kulturmediums und geben sterile Poly-Brain-Lösung bis zu einer Endkonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Lassen Sie das Überstandsgemisch durch einen 0,45-Mikrometer-Filter laufen, um zelluläre Fragmente zu entfernen. Saugen Sie nun das Medium aus den Endothelzellenkulturen ab und geben Sie zwei Milliliter des überstandsgemischten Poly-Brain-Gemischs in die Vertiefungen, nachdem es über Nacht inkubiert wurde.

Wiederholen Sie diesen Vorgang am nächsten Tag mit einer frischen Aliquot der überstehenden Poly-Brain-Mischung. Entfernen Sie die überstehende Poly-Brain-Mischung. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und geben Sie anschließend frisches Wachstumsmedium hinzu.

Wechseln Sie weiterhin alle drei Tage das Wachstumsmedium, wenn die Zellen konfluent sind, und passagieren Sie die Zellen im Verhältnis von eins zu zwei auf kollagenbeschichteten Platten. Stabile zerebrale Endothelzelllinien werden typischerweise nach vier bis fünf Wochen anschließender Kultivierung erhalten.

Wenn eine homogene endotheliale Einschicht die gesamte Vertiefung ausgefüllt hat. Sobald die stabilen Zelllinien vorliegen, überführen Sie die Zellen in kollagen Vier-beschichtete Zellkulturgefäße und passagieren Sie die Zellen nicht häufiger als einmal pro Woche mit drei Millilitern Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 Grad Celsius für fünf bis 15 Minuten, bis die Zellschicht aufgelöst ist. Nach Zugabe von fünf Millilitern Medium säen Sie die neuen Flaschen aus und vermeiden Sie eine Teilung im Verhältnis höher als 1 zu 4.

Wenn genügend Zellen für eine konfluente T-75-Flasche vorhanden sind, können Kryovials mit Zellen für die spätere Verwendung vorbereitet werden. Dazu werden die Zellen wie zuvor mit Trypsin abgelöst, die Zellsuspension anschließend fünf Minuten lang mit 250 ×g zentrifugiert. Der Zellenpellet wird bei Raumtemperatur in sechs Milliliter Gefriermittel resuspendiert und dann mithilfe einer Pipette je 1,5 Milliliter der Zellsuspension auf vier Kryovials verteilt.

Stellen Sie die Kryoröhrchen in einen Nalgene-Gefriermittelbehälter, der mit Isopropanol gefüllt ist, und lagern Sie sie einen Tag lang bei minus 80 Grad Celsius. Bewahren Sie die Kryoröhrchen abschließend unter flüssigem Stickstoff auf. Tauchen Sie das Kryoröhrchen mit den Zellen in ein Wasserbad, um es aufzutauen, und überführen Sie die Zellen dann in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das 10 Milliliter Wachstumsmedium enthält.

Medium auf 37 Grad Celsius vorwärmen und die Probe 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 250 ×g zentrifugieren. Nach dem Absaugen des Mediums das Pellet in einem geeigneten Volumen Wachstumsmedium resuspendieren. Die Zellsuspension in einen mit Kollagen IV beschichteten T25-Zellkulturflasche mit vorgewärmtem Wachstumsmedium überführen.

Die Zelldichte für das Ansäen sollte mindestens 1 × 10⁴ Zellen pro Milliliter betragen. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium und führen Sie die Passagierung der Zellen wie zuvor fort, bis die Zellen in etwa fünf Tagen konfluent sind. Anschließend säen Sie die Zellen bei der gewünschten Dichte für die nachfolgenden Experimente aus. Die C-End-Zellen wurden durch Immunfärbung von Endothel- und Blut-Hirn-Schranke-Markern charakterisiert.

Dieses Bild zeigt die Morphologie von C- und Zellen, die mittels Immunfärbung für Clain fünf nachgewiesen wurden. Die C- und Zellen weisen eine Morphologie auf, die primären Kulturen von Gehirn-ECS ähnelt, mit Monolagen dicht gepackter, langgestreckter Zellen, die ein Wachstumshemmung zeigten. Bei Nettokonfluenz exprimierten die Zellen nachweisbare Mengen von Clain.

Hier wurden die C CN-Zellen mit einem Antikörper gegen Occludin immungefärbt. Hier sehen wir die Expression von VE-Cadherin-Proteinen, die an den Zell-Zell-Kontakten lokalisiert sind, erneut durch Immunfluoreszenzfärbung gezeigt. Der transendotheliale elektrische Widerstand wurde mithilfe einer Vorrichtung gemessen, die Elektroden zum Durchleiten des Stroms und zur Spannungsmessung enthält.

Es ist dieser Abbildung zu entnehmen, dass der transendotheliale elektrische Widerstand von C end-Zellen im Kulturverlauf nach ihrer Entwicklung mit der Zeit ansteigt. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, zerebrovaskuläre Erkrankungen in einem Mausmodell zu untersuchen.