Name: Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide In-vitro- Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Lernen Sie die Isolierung ribosomgebundener nascent Polypeptide zur Identifizierung von Translationspausen an mRNA in zellfreien Systemen. Diese Methode nutzt SDS-PAGE und Autoradiographie für präzise Analysen.

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Diese Arbeit wurde vom Human Frontier Science Program RGP0024 Zuschuss finanziert.

1. DNA-Schablone Herstellung und in vitro Transkription <ol><li> Das Gen von Interesse unter T7 und / oder zB SP6-Transkriptions-Promotor kloniert. </li><li> Für in-vitro-Transkription der Matrizen-DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym-Schnittstellen stromabwärts des Stop-Codon ORF und / oder mRNA 3&#39;-Ende linearisiert. Man braucht, um eine vollständige Linearisierung der Plasmid-DNA durch Ausführen des Restriktionsverdau Produkt auf Agarose-Gelelektrophorese überprüft. </li><li> Das linearisierte Plasmid wird für die in vitro-Transkriptions-Reaktion verwendet. Verschiedene Konzentrationen der Ziel-DNA getestet, um eine optimale DNA-Konzentration für die in vitro Transkription erforderlich zu identifizieren. Im Allgemeinen mit MEGAscript Hohe Ambions Ertrag Transcription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), ergibt 1 pg DNA linearisiert 40-60 pg mRNA. In-vitro-Transkription wird nach Herstellerangaben (Ambion / Life Technologies, Grand Islan getand, NY). </li><li> Nach in vitro Transkription wird die mRNA durch Lithiumchlorid Niederschläge nach Herstellerangaben (Ambion die MEGAscript High Yield Transcription Kit) gereinigt. </li><li> mRNA-Integrität wird weiterhin durch Elektrophorese auf Acrylamid oder Agarosegelen überprüft. </li></ol> 2. In vitro Zell Freie Übersetzung Für in vitro Translation mit R abbit R eticulocyte Lysat, RRL (Promega, Madison, WI) die folgenden Schritte aus: <ol><li> Es werden 100 ul in vitro Translation Reaktion nach Herstellerangaben. Kurz gesagt, in Nuclease freies Wasser hinzufügen, 2 ul Aminosäurenmischung minus Methionin (1 mM), 10 Einheiten RNase-Inhibitor (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi von radioaktivem [35 S]-Methionin (MP Biomedicals, Solon, OH), 70 ul Kaninchen-Retikulozytenlysat (Promega, Madison, WI). </li><li> Inkubieren the Reaktion bei 30 ° C für 5 min auf die warme Reaktion Übersetzung voreingestellt. In 2 ug der mRNA an das Translations-Reaktion und Inkubieren bei 30 ° C für 5 min. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Übersetzung Reaktion auf Eis. </li></ol> 3. Isolierung der entstehenden Polypeptide in vitro Translationsreaktion <ol><li> Um entstehenden Polypeptid gebunden an Ribosomen (Polysomen) zu isolieren, wird die Übersetzung Reaktion auf von 4,5 ml 30% Glycerin in 10 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,6 geschichtet, enthaltend 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und zentrifugiert bei 100.000 × g in einem TLA-110-Rotor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) für 1 Stunde bei 4 ° C </li><li> Der Überstand wird weiter vorsichtig entfernt. </li><li> Die Polysomen Pellet, das entstehende Polypeptide ist in einem kleinen Volumen (10-15 ul) von 1 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,6, resuspendiert, das 0,5 mg / ml Ribonuklease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), und inkubiert 30 min bei 37 ° C Umdie Hydrolyse der Peptidyl-tRNA-Ester-Bindung zu erhöhen, wird NaOH auf eine Endkonzentration von 10 mM zugegeben und die Inkubation für weitere 30 min fortgesetzt. </li></ol> In-vitro-Translation Reaktion zusammengebaut ohne mRNA und durchgeführt unter den gleichen Bedingungen (gefolgt von der Isolierung der entstehenden Peptide wie es beschrieben wurde) würde als große Kontrolle dienen. Die Behandlung der Übersetzung Reaktion (en) mit Puromycin vor den Extrakt einer Dichtegradientenzentrifugation kann als zusätzliche Kontrolle zu dienen. 4. Die Lösung der entstehenden Polypeptid auf Tris-Tricin SDS-PAGE <ol><li> Die isolierten naszierenden Polypeptiden werden aufgelöst und analysiert auf Tris-Tricin SDS-PAGE. Bitte beachten Sie, dass die Menge des Materials auf dem Gel wird abhängig von der Effizienz der Markierung von Proteinen, Protein-Effizienz auf Übersetzung des viele andere Parameter geladen. Die Menge des geladenen Materials sollte empirisch eingestellt werden, um die BES erlaubent-Visualisierung und Trennung einzelner naszierenden Polypeptidketten. </li><li> Nach der Elektrophorese Gele fixiert sind, trocknet mit Vakuum-Gel Färber und einer Autoradiographie unterzogen. Die Verteilung der entstehenden Polypeptide werden beobachtet, wenn Phosphoimaging. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Rinder-gamma-B Crystallin wurde in Kaninchen-Retikulozytenlysat übersetzt und in E. coli S30-Extrakt Systems (Promega, Madison, WI), gefolgt von der Isolierung des naszierenden Polypeptidketten. Abbildung 1 zeigt die Schritte bei der Isolierung von Ribosomen gebundenen naszierenden Ketten beteiligt. In der vorliegenden Studie war das Ziel zu überprüfen, ob die Änderung der Umgebung der Übersetzung bedeutet Repertoire von tRNAs (bekanntlich wesentlich verschiedenen in Säugetierzellen (RRL) und prokaryotischen (E. coli)-Systeme aufgrund von Unterschieden in Codon Vorspannung zwischen der Organismen) kann verändern Ribosom Bewegung entlang mRNA bewirken und die Verteilung der Übersetzung Pause Sites.Altered Ribosom Bewegung sollte auf Veränderungen in der Verteilung der Größen der entstehenden Polypeptide akkumulieren während der Übersetzung sowie deren relative Intensitäten führen. Relative Intensitäten der Banden spiegeln die Dauer der Pause. Die entstehenden Polypeptide wurden isoliert und gelöst auf 16,5% T, 6% C Tris-Tricin SDS-PAGE (Abbildung 2). Gamma-B Crystallin ist ein 20 kDa Protein. Die Beobachtung des entstehenden Polypeptide von nicht identischen Längen und Intensitäten in RRL und E. coli-Systemen zeigt, dass die Bewegung entlang der Ribosomen-mRNA in diesen zwei Systeme unterschiedliche Übersetzung Kinetik folgt. Zum Beispiel beobachten wir eine prominente Bande von 17,7 kDa in E. coli-Lysat und nicht in RRL-System, was darauf hindeutet, dass es eine zusätzliche translatorische Pause-Stelle im 3&#39;-Ende der mRNA Bereich (Codierung C-terminale Region von Gamma B Crystallin), wenn es in E. übersetzt coli-System. Wir weisen darauf hin, dass Gamma-B Crystallin Häfen Tandem-Arg-Codons (AGG 153 und AGA 154), die häufigsten sind in Säugetier-Systeme, sondern sind dafür bekannt, extrem selten und langsam übersetzt in E. coli. Ein Roman entstehenden Peptid, der sich in E. coli-System (~ 17,7 kDa Abbildung 2.2) wird wahrscheinlich durch Ribosomen-Pause bei diesen seltenen Codons Tandem verursacht. Bitte beachten Sie, dass keine Bänder in der Abwesenheit von mRNA (Abbildung 2.3) beobachtet werden kann und dass Puromycin Behandlung löscht die meisten der naszierenden Ketten von Polysomen (Abb. 2.3). Eine längere Behandlung mit Puromycin (&gt; 15 min) entfernt alle naszierenden Ketten (Daten nicht gezeigt). Dies bestätigt, dass die beobachteten Polypeptidprodukte Ribosom assoziierten naszierenden Ketten, anstatt mRNPs cosedimenting mit Polysomen sind. Wie oben erwähnt, ist Codon Bias Organismus als auch gewebespezifisch. Der Vertreter hier beschriebenen Beispiel zeigt deutlich, dass die Änderung der Umgebung der Übersetzung heißt Repertoire von tRNAs / CodonBias kann zu veränderten Bewegung des Ribosoms an der mRNA entlang führen. Offensichtlich kann diese einfache Technik ermöglichen nicht nur die Identifizierung der translationalen Pause Standorten entlang mRNA, sondern erlaubt auch eine schnelle Vergleich der Übersetzung Pause Standorten zwischen verschiedenen Systemen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Erläuterung der Schritte zu isolieren Ribosom gebundenen naszierenden Polypeptide beteiligt sind. Rinder-gamma-B Crystallin ORF-Sequenz (528 Basenpaare) wurde stromabwärts des T7-Promotors kloniert in pBSKS +. Für in-vitro-Transkription der Matrizen-DNA wurde durch Behandlung mit EcoRI linearisiert. Linearisierte Template wurde für in vitro-Transkription verwendet. T7-Promotor in der DNA-Vorlage wird durch T7-RNA-Polymerase, die die stromabwärtigen Gamma-B Crystallin Gen transkribiert erkannt. mRNA wird unter Verwendung Lithiumchlorid Fällungsverfahren. Die gereinigte mRNA ist für in vitro-Translation verwendet. FolgendeInkubation Übersetzung Reaktion auf von 30% Glycerin-Lösung geschichtet und zentrifugiert für 1 Stunde bei 4 ° C bei 100.000 × g für Ribosom gebundenen naszierenden Polypeptide zu isolieren. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" /> Abbildung 2. Isolierung von Rinder-gamma-B Crystallin naszierenden Polypeptiden in Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (RRL) und E. übersetzt coli-Lysat. 2 pg mRNA wurde in 100 ul Reaktion mit RRL oder E. gemischt coli S30 Extract System (Promega, Madison, WI) nach Anleitung des Herstellers mit 20 Ci [35 S]-Methionin und bei 30 ° C für 5 min. Nach der Inkubation die Translationsreaktion wurde oben auf 4,5 ml 30% Glycerin in 10 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,6 geschichtet, enthaltend 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und zentrifugiert, für 1 Stunde bei 4 ° C und 100.000 × g in ein TLA-110 Rotor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Die isolierte polyribosome Pellet war resuspended in 20 ul von 1 mM Tris-HCl pH 7,6, enthaltend 0,5 mg / ml Ribonuklease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) durch Behandlung mit NaOH (wie im Protokoll beschrieben) gefolgt. Nascent Polypeptide wurden auf 16,5% T, 6% C Tris-Tricin SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und mit für die Autoradiographie. Nach der Belichtung wurde das Gel gescannt mit GE Healthcare Typhoon Imaging Scanner. Abbildung 2.1 zeigt das Gel mit naszierenden Polypeptiden isoliert und gelöst nach der Übersetzung Reaktionen in zwei verschiedenen Systemen (RRL und E. coli) durchgeführt. Abbildung 2.2 Das Gel wurde von Image Quant TL analysiert ., v2005 Software und hier als Beispiel zu zeigen, dass das Molekulargewicht und die Intensität der entstehenden Polypeptide, der sich in beiden Systemen problemlos analysiert werden können und im Vergleich benutzt Abbildung 2.3 zeigt zwei Gruppen von Steuerelementen: naszierenden Polypeptide isoliert und auf SDS-PAGE aufgelöst nach der Übersetzung Reaktionen wurden montiertohne Zugabe von mRNA und / oder nach der Übersetzung Reaktionen wurden mit Puromycin (5 min, Endkonzentration. 1 mM) behandelt, bevor die Umsetzung einer Zentrifugation unterworfen wurde.

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<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Für reproduzierbare Ergebnisse, Qualität und Konzentration der Komponenten für die in vitro Transkription und Translation-Reaktionen verwendet kritisch sind. In der aktuellen Studie haben wir kommerziell verfügbaren Kits und Extrakte, die in hohem Maße reproduzierbar Daten zu liefern, bei sorgfältiger Behandlung eingesetzt. Jedoch kann die Übersetzung-zuständigen Extrakte aus der Zelle des eigenen Wahl hergestellt werden, wenn nötig. Qualität der mRNA kann die Translation beeinflussen, so ist es von größter Bed...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Kit </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonuclease Inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease-A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> Kaninchen-Retikulozytenlysat-System behandelt, Nuclease </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30-Extrakt-System für lineare Matrizen </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Zentrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima TLX Ultrazentrifuge </td></tr><tr><td> Speicherleuchtstoffplatte Autoradiogrammy </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 Variable Mode Imager </td></tr><tr><td> Software zur Analyse entstehenden Polypeptid </td><td> GE Healthcare </td><td> Bild Quant TL, V2005 </td></tr></tbody></table>

isolierung von ribosom gebunden nascent polypeptide<em&gt; in-vitro-</em&gt; identifizieren translational pause standorten entlang mrna

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Die Geschwindigkeit der Translationselongation ungleichmäßig ist. Sekundärstruktur der mRNA, mRNA-Codon-Nutzung und assoziierten Proteinen kann Ribosom Bewegung auf die Meldung zur Prüfung zu verändern siehe 1. Allerdings ist es nun weitgehend akzeptiert, dass ein Synonym Codonverwendung die primäre Ursache für ungleichmäßige Translationselongation Sätze 1 ist. Synonyme Codons sind nicht mit gleicher Frequenz verwendet. Eine Vorspannung besteht in der Verwendung von synonymen Codons mit Codons einigen häufiger als andere 2 verwendet. Codon-Bias ist Organismus als auch gewebespezifische 2,3. Darüber hinaus ist die Frequenz der Codonverwendung direkt proportional zu den Konzentrationen von verwandten tRNAs 4. Somit wird ein häufigsten verwendeten Codons höhere Vielzahl von entsprechenden tRNAs, die impliziert, dass ein häufiges Codon schneller als einem seltenen wird man übersetzt werden. So werden die Regionen auf mRNA in seltenen Codons (potentiellen Pause Sites) angereichert in der Regel langsamer Bewegung auf dem Ribosom MessaGE und Ursache entstehende Anhäufung von Peptiden der jeweiligen Größen 5-8. Diese Pause Standorte können funktionelle Auswirkungen auf die Protein-Expression haben, finden die mRNA-Stabilität und Faltung von Proteinen für die Überprüfung 9. Tatsächlich wurde gezeigt, dass eine Senkung der solche Pause-Seiten können Ribosom Bewegung auf mRNA verändern und anschließend kann die Effizienz der Co-translationale (in vivo) Proteinfaltung 1,7,10,11 beeinflussen. Um den Prozess der Proteinfaltung in vivo zu verstehen, in der Zelle, die letztlich auf den Prozess der Protein-Synthese ist es wichtig, umfassende Einblicke in die Auswirkungen der Codon-Nutzung / tRNA-Inhalte auf die Bewegung entlang der Ribosomen-mRNA gewinnen während Translationselongation gekoppelt . Hier beschreiben wir eine einfache Technik, die zur großen Pause Übersetzung Standorte für eine bestimmte mRNA in verschiedenen zellfreien Systemen 6-8 übersetzt zu lokalisieren. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide accumulati Basisng an Ribosomen während der in vitro Translation eines Target-mRNA. Der Grund ist, dass bei niedrigen Frequenzen Codons, die Erhöhung der Verweilzeit der Ribosomen führt zu einer erhöhten Mengen von naszierendem Peptide der entsprechenden Größe. In-vitro-transkribierte mRNA wurde in vitro Translations-Reaktionen in Gegenwart von radioaktiv markierten Aminosäuren die Detektion der naszierenden Ketten zu ermöglichen. Um Ribosom gebundenen Komplexe entstehenden Polypeptid zu isolieren die Übersetzung Reaktion auf von 30% Glycerin-Lösung geschichtet, gefolgt von Zentrifugation. Nascent Polypeptide in polysomaler Pellets werden weiter mit Ribonuklease A behandelt und durch SDS-PAGE. Diese Technik kann für jedes Protein potentiell verwendet werden und ermöglicht die Analyse der Bewegung entlang Ribosom-mRNA und der Nachweis der größten Pause Seiten. Zusätzlich kann dieses Protokoll angepasst, um Faktoren und Bedingungen, die Ribosomen-Bewegung zu verändern und damit potentiell auch verändern th studieren werdene-Funktion / Konformation des Proteins.

Eine Technik zur translationalen Pause Sites auf mRNA zu identifizieren beschrieben wird. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide ansammeln auf Ribosomen während der in vitro Translation einer Ziel-mRNA, durch die Größe Analyse der naszierenden Ketten mit Hilfe eines denaturierenden Gelelektrophorese gefolgt basiert.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

Die Rate der translationalen Elongation ist nicht gleichmäßig. Die mRNA-Sekundärstruktur, die Codon-Nutzung und mit der mRNA assoziierte Proteine können die Bewegung des Ribosoms auf der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bedeutende translatio­nale Pausenstellen für ein mRNA-Molekül zu identifizieren und zu lokalisieren, das in einem zellfreien Translationssystem translatiert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gen der Wahl unter Kontrolle eines T-sieben-Transkriptionspromotors kloniert wird. Anschließend wird die mRNA transkribiert und gereinigt.Anschließend wird die In-vitro-Translation in Gegenwart von mRNA und radioaktiven Aminosäuren durchgeführt, um das synthetisierte Protein und die naszenten Polypeptide zu markieren. Schließlich werden die Polysomen mittels Sedimentationsgeschwindigkeits-Zentrifugation isoliert, und die isolierten naszenten Ketten werden durch Gelelektrophorese getrennt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die naszente Polypeptide unterschiedlicher Länge mittels Tristin-SDS-Page und Autoradiographie zeigen und somit die Anwesenheit von Pausenstellen entlang der mRNA von Interesse anzeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu unseren bestehenden Methoden wie dem Mikrokernschutz-Assay liegt darin, dass sie äußerst einfach, schnell und effizient ist und die Bestimmung sowie Identifizierung der wichtigsten Translationsstartstellen entlang jeder MNA in einem gegebenen Zelltypsystem ermöglicht. Diese Methode kann helfen, einige zentrale Fragen auf dem Gebiet der Translation und der translationsgekoppelten Proteinfaltung zu beantworten, beispielsweise welche gesundheitsrelevanten Faktoren wie Codon-Nutzung, TNA-Angabe oder die sekundäre mRNA-Struktur die Translationskinetik beeinflussen könnten. Die Methode könnte darüber hinaus unser Verständnis der Beziehungen zwischen der Translationskinetik und den Schlüsselschritten im Weg der translationsgekoppelten Proteinfaltung vertiefen.Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf das Verständnis des Prozesses der Proteinfaltung in vivo, der weitgehend als ko-translationale Ereignis während der Translation am Ribosom angesehen wird, obwohl die vorliegende Studie eine zellfreie Translation von Gamma-Bi-Kristallin unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Zellextrakts umfasst. Diese Technik kann ebenfalls eingesetzt werden, um translationsbedingte IDE in potenziell jedem Protein mithilfe eines translationskompetenten Extrakts, der aus einer beliebigen zellulären Quelle hergestellt wurde, zu identifizieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, bei zwei zentralen Schritten des Protokolls Schwierigkeiten haben.Der erste Punkt ist die Ermittlung der gesamten Zeit, die für die Durchführung der Translationsreaktion erforderlich ist, um sicherzustellen, dass der Großteil der neu synthetisierten Polypeptide an das Ribosom gebunden bleibt. Der zweite Punkt besteht darin, ein geeignetes Gelsystem zur Auftrennung des Großteils der neu synthetisierten Polypeptide zu finden, wobei die Wahl des Gelsystems von der Größe des untersuchten Proteins abhängt. Wir hatten erstmals die Idee zu dieser Methode, als wir in den mittleren achtziger Jahren beschlossen, die Translationskinetik der Globin-Moleküle im Zusammenhang mit dem vorgeschlagenen Modell der COT-Translation-Faltung von Globin zu untersuchen.Die Unregelmäßigkeit der Globin-Translation wurde erstmals 1974 von PRO und Maurice bemerkt, als sie die Größenausschlusschromatographie der Globin-NAS und -Ketten verwendeten. Ihre Analyse wies jedoch nicht die gewünschte Präzision auf, und Pro und mehr beobachteten vier Haupttranslationseffizienzstellen während der Globin-Translation. In der Folge ermöglichte unsere Analyse die Identifizierung von etwa 10 zusätzlichen Effizienzstellen und den Aufbau eines detaillierten Modells der translationalen Globinfaltung. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die hier beschriebene Technik die Isolierung von Polysomen und die Analyse naszierender Polypeptide mittels Tri-S-Ds-Seiten-Gel beinhaltet.Beide Schritte sind entscheidend, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die Durchführung des Progel wird von einer Doktorandin aus dem Myelo-Labor Sujata For übernommen, die in vitro Transkription von Boten-RNA. Beginnen Sie mit einem Gen von Interesse, das unter einem T7- und/oder SP6-Promotor kloniert wurde; linearisieren Sie die DNA-Vorlage mithilfe eines geeigneten Restriktionsenzyms stromabwärts des Stopcodons und/oder des 3'-Endes der mRNA.Ein Beispiel der Restriktionsverdauung zur Agarosegelelektrophorese, um zu überprüfen, ob die DNA vollständig linearisiert ist. Nach Bestimmung der optimalen DNA-Vorlagenkonzentration verwenden Sie ein Transkriptionskit, um nach Herstelleranleitung in vitro Messenger-RNA zu transkribieren. Anschließend reinigen Sie die mRNA mittels Lithiumchlorid-Fällung.Verwenden Sie anschließend entweder Acrylamid- oder Aros-Gel-Elektrophorese, um die Reinheit zu überprüfen. Bereiten Sie eine 100 Mikroliter große In-vitro-Translation in nukleasefreiem Wasser vor, indem Sie eine Aminosäurenmischung ohne Methionin (1 mmolar), 10 Einheiten RNA-Inhibitor, 20 Mikrocurie radioaktives 35S-Methionin und Kaninchen-Reticulozyten-Lysat hinzufügen. Prewarmen Sie danach die Reaktion, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 30 Grad Celsius inkubieren.Anschießend zwei Mikrogramm mRNA zugeben und fünf Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren, um die Reaktion zu stoppen; anschließend auf Eis abkühlen, um an Ribosomen gebundene naszente Polypeptide zu isolieren. Die Übersetzungsreaktion vorsichtig auf 4,5 Milliliter 30 %igen Glycerin im Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) mit Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid schichten und mit einem TLA-110-Rotor-Zentrifugenapparat eine Stunde bei 100.000 × g und 4 Grad Celsius zentrifugieren. Danach das Überstandsvolumen vorsichtig abnehmen und das polysomale Pellet, das die naszenten Polypeptide enthält, in einem geringen Volumen (1 mmolarer Tris-HCl-Puffer, pH 7,6) mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Ribonuclease A resuspendieren und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Um die Hydrolyse der Peptid-tRNA-Esterbindung zu verbessern, geben Sie Natriumhydroxid in einer Endkonzentration von 10 Millimolar zur Reaktion hinzu und inkubieren Sie diese weitere 30 Minuten. Trennen Sie die neu synthetisierten Polypeptide mittels Tris-Tris-SDS-Page, danach fixieren und trocknen Sie die Gele. Unterziehen Sie die Gele der Autoradiographie, gefolgt von einer Phospho-Bildgebung zur Detektion der neu synthetisierten Polypeptide. Veränderte Ribosomenbewegungen, die durch Änderungen im tRNA-Pool hervorgerufen werden, sollten zu Veränderungen in der Größenverteilung der während der Translation akkumulierenden naszenten Polypeptide sowie zu Änderungen ihrer relativen Intensitäten führen, die die Dauer der Pause hier widerspiegeln. Naszente Polypeptide des Gamma-B-Crystallin-Proteins wurden isoliert und mittels Tristin-SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die nicht identischen Längen und Intensitäten der Polypeptide in den RRL- und E.-coli-Systemen zeigen, dass die Bewegung der Ribosomen entlang der mRNA in diesen beiden Systemen unterschiedlichen Translationskinetiken folgt.Beispielsweise ist im e coli-Lysat eine auffällige Bande von 17,7 Kilodalton zu beobachten, die im Kaninchen-Reticulozyten-Lysatsystem nicht vorhanden ist. Gamma-B-Crystallin enthält tandemartig angeordnete Arginin-Codons, die in Säugetiersystemen häufig vorkommen, aber bekanntermaßen im e coli äußerst selten und langsam übersetzt werden, was darauf hindeutet, dass diese Bande durch das Anhalten des Ribosoms verursacht wird. An diesen tandemartig seltenen Codons, wie hier gezeigt.Ohne mRNA können keine Banden beobachtet werden, und die Behandlung mit Purymycin entfernt die meisten naszierenden Ketten aus dem Polysom. Außerdem entfernt eine verlängerte Behandlung mit Purymycin sämtliche naszierenden Ketten, was bestätigt, dass die beobachteten Polypeptidprodukte ribosomassoziierte naszierende Ketten sind und keine MRPs, die mit dem Polysom mitpräzipitieren. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von ein bis zwei Tagen durchgeführt werden. Die Dauer des Verfahrens hängt hauptsächlich von der Dauer des Zentrifugationsschritts und des Schritts der Gelelektrophorese naszierender Peptide ab.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Übersetzungsreaktion unmittelbar nach der Inkubationszeit zu stoppen. Um eine Freisetzung des neu synthetisierten Polypeptids aus dem Ribosom zu vermeiden, ist es offensichtlich entscheidend, RNA zu jedem Zeitpunkt auszuschließen. Eine RNA-Kontamination könnte die Übersetzungseffizienz des Extrakts beeinträchtigen und zur Freisetzung des neu synthetisierten Polypeptids aus dem Ribosom im Anschluss an dieses Verfahren führen.Weitere Ziele, wie zum Beispiel die Auswirkungen von mRNA-bindenden Proteinen auf die Effizienz der Ribosomenbewegung entlang einer bestimmten Nachricht, können nach ihrer Entwicklung ebenfalls untersucht werden. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Proteinfaltung den Weg, um die Rolle der Translation zu erforschen, die sich durch das Vorhandensein seltener Codons bei der translationalen Proteinfaltung ergibt. Diese Technik wurde zuvor bereits verwendet, um die Rolle von Kaliumsubstitutionen bei der Ribosomenbewegung entlang einer Nachricht und bei der translationalen Proteinfaltung zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man translatio­nale Aktivitätsstellen identifiziert, indem man an das Ribosom gebundene neu synthetisierte Polypeptide isoliert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Isotopen und markierten Aminosäuren, wie zum Beispiel A 35 Methionin, besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordert und stets bei der Durchführung dieses Verfahrens berücksichtigt werden sollte.

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Research

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Biology

Biologie

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