Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide In-vitro- Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die wichtigsten translativen Pausenstellen einer mRNA zu identifizieren und zu lokalisieren, die in einem zellfreien Translationssystem übersetzt wird. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gen der Untersuchung unter Kontrolle eines T-sieben-Transkriptionspromotors kloniert wird. Anschließend wird die mRNA transkribiert und gereinigt.

Anschließend wird die In-vitro-Translation in Gegenwart von mRNA und radioaktiven Aminosäuren durchgeführt, um das synthetisierte Protein und die naszenten Polypeptide zu markieren. Schließlich werden die Polysomen mittels Sedimentationsgeschwindigkeitszentrifugation isoliert, und die isolierten naszenten Ketten werden durch Gelelektrophorese getrennt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die naszente Polypeptide unterschiedlicher Länge mittels Tristin-SDS-Page und Autoradiographie zeigen und somit die Anwesenheit von Pausenstellen entlang der mRNA von Interesse anzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu unseren bestehenden Methoden wie dem Mikrokernschutz-Assay liegt darin, dass sie äußerst einfach, schnell und effizient ist und die Bestimmung sowie Identifizierung der wichtigsten Translationsstartstellen entlang einer beliebigen MNA in einem gegebenen zellulären System ermöglicht. Diese Methode kann helfen, einige der zentralen Fragen im Bereich der Translation und der translationellen Proteinfaltung zu beantworten, beispielsweise wie gesundheitsrelevante Faktoren wie Codon-Nutzung, TNA-Angabe oder die sekundäre mRNA-Struktur die Kinetik der Translation beeinflussen können. Die Methode könnte zudem unser Verständnis der Beziehungen zwischen der Kinetik der Translation und den entscheidenden Schritten im Weg der cotranslationalen Proteinfaltung vertiefen.

Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf das Verständnis des Prozesses der Proteinfaltung in vivo, der weitgehend als ko-translationale Ereignis während der Translation am Ribosom angesehen wird, obwohl die vorliegende Studie eine zellfreie Translation von gamma-bi-kristallin unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Zellextrakts umfasst. Diese Technik kann ebenfalls eingesetzt werden, um translationsbedingte IDE in potenziell jedem Protein mithilfe eines translationskompetenten Extrakts, der aus einer beliebigen zellulären Quelle hergestellt wurde, zu identifizieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, bei zwei zentralen Schritten des Protokolls Schwierigkeiten haben.

Der erste Punkt ist die Ermittlung der gesamten Zeit, die für die Durchführung der Translationsreaktion erforderlich ist, um sicherzustellen, dass der Großteil der neu synthetisierten Polypeptide an das Ribosom gebunden bleibt. Der zweite Punkt besteht darin, ein geeignetes Gelelektrophorese-System zur Auftrennung der Mehrheit der naszierenden Polypeptide zu finden, wobei die Wahl des Gelelektrophorese-Systems von der Größe des untersuchten Proteins abhängt. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir in den mittleren achtziger Jahren beschlossen, die Translationskinetik der Globinmoleküle im Zusammenhang mit dem vorgeschlagenen Modell der COT-Translationsfaltung von Globin zu untersuchen.

Die Unregelmäßigkeit der Globin-Translation wurde erstmals 1974 von PRO und Maurice bemerkt, als sie die Größenausschlusschromatographie der Globin-NAS und -Ketten verwendeten. Ihre Analyse wies jedoch nicht die gewünschte Präzision auf. Pro und mehr zeigen vier Haupt-Translationsleistungsstellen während der Globin-Translation. In der Folge ermöglichte unsere Analyse die Entdeckung von etwa 10 zusätzlichen Leistungsstellen und den Aufbau eines detaillierten Modells der translationalen Globinfaltung. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die hier beschriebene Technik die Isolierung von Polysomen und die Analyse naszierender Polypeptide mittels Tri-S-Ds-Seiten-Gel beinhaltet.

Beide Schritte sind entscheidend, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die Durchführung des Progels erfolgt durch eine Doktorandin aus dem Myelo-Labor Sujata zur In-vitro-Transkription von Boten-RNA. Beginnen Sie mit einem Gen der Wahl, das unter einen T7- und/oder einen SP6-Promotor kloniert wurde; linearisieren Sie die DNA-Vorlage mithilfe eines geeigneten Restriktionsenzyms stromabwärts des Stoppcodons und/oder des 3'-Endes der mRNA.

Ein Beispiel der Restriktionsverdauung zur Agarose-Gelelektrophorese, um zu überprüfen, ob die DNA vollständig linearisiert ist. Nach Bestimmung der optimalen DNA-Vorlagenkonzentration verwenden Sie ein Transkriptionskit, um laut Herstelleranleitung in vitro Boten-RNA zu transkribieren. Verwenden Sie anschließend eine Lithiumchlorid-Fällung zur Reinigung der mRNA.

Verwenden Sie anschließend entweder Acrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese, um die Reinheit zu überprüfen. Bereiten Sie eine 100-Mikroliter-In-vitro-Translationsreaktion in nukleasefreiem Wasser vor, indem Sie eine Aminosäuremischung ohne Methionin (1 mM), 10 Einheiten RNA-Inhibitor, 20 Mikrocurie radioaktives 35S-Methionin und Kaninchen-Reticulozyten-Lysat hinzufügen. Prewarmen Sie die Reaktion anschließend, indem Sie sie fünf Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Fügen Sie dann zwei Mikrogramm mRNA hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei 30 Grad Celsius, um die Reaktion zu stoppen. Stellen Sie es anschließend auf Eis, um an Ribosomen gebundene neu synthetisierte Polypeptide zu isolieren. Schichten Sie die Übersetzungsreaktion auf 4,5 Milliliter 30 % Glycerol in HCl-Puffer mit pH 7,6, der Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid enthält, und zentrifugieren Sie mit einem TLA-110-Rotor bei 100.000 × g eine Stunde bei Grad Celsius. Entfernen Sie danach vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Polysomen-Pellet, das die neu synthetisierten Polypeptide enthält, in einem kleinen Volumen von einem Millimolar Tris-HCl-Puffer mit pH 7,6, der 0,5 Milligramm pro Milliliter Ribonuclease A enthält. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Um die Hydrolyse der Peptid-tRNA-Esterbindung zu verbessern, geben Sie Natriumhydroxid in einer Endkonzentration von 10 Millimolar zur Reaktion hinzu und inkubieren Sie diese für zusätzliche 30 Minuten. Trennen Sie die neu synthetisierten Polypeptide mittels Tris-Tris-SDS-PAGE, danach fixieren und trocknen Sie die Gele. Unterziehen Sie die Gele der Autoradiographie, gefolgt von einer Phosphoimaging-Detektion der neu synthetisierten Polypeptide.

Veränderte Ribosomenbewegungen, die durch Änderungen im tRNA-Pool hervorgerufen werden, sollten zu Veränderungen in der Größenverteilung der während der Translation akkumulierenden naszierenden Polypeptide sowie zu Änderungen ihrer relativen Intensitäten führen, die die Dauer der Pause an dieser Stelle widerspiegeln. Naszierende Polypeptide des Gamma-B-Crystallin-Proteins wurden isoliert und mittels Tristin-SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die nicht identischen Längen und Intensitäten der Polypeptide in den RRL- und E.-coli-Systemen deuten darauf hin, dass die Bewegung der Ribosomen entlang der mRNA in diesen beiden Systemen unterschiedlichen Translationskinetiken folgt.

Beispielsweise ist die ausgeprägte Bande von 17,7 Kilodalton in der E. coli-Lyse, die im Kaninchen-Reticulozyten-Lyse-System nicht vorhanden ist, hervorzuheben. Gamma-B-Crystallin enthält tandemartig angeordnete Arginin-Codons, die in Säugetiersystemen häufig vorkommen, aber in E. coli als äußerst selten und langsam zu übersetzen bekannt sind, was darauf hindeutet, dass diese Bande durch das Anhalten des Ribosoms an diesen tandemartig seltenen Codons verursacht wird, wie hier gezeigt.

Ohne mRNA können keine Banden beobachtet werden, und die Behandlung mit Puromycin entfernt die meisten naszierenden Ketten aus dem Polysom. Zusätzlich entfernt eine verlängerte Behandlung mit Puromycin sämtliche naszierende Ketten, was bestätigt, dass die beobachteten Polypeptidprodukte ribosomassoziierte naszierende Ketten sind und keine MRPs, die mit dem Polysom mitpräzipitieren. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von ein bis zwei Tagen durchgeführt werden. Die Dauer des Verfahrens hängt hauptsächlich von der Dauer des Zentrifugationsschritts und des Schritts der Gelelektrophorese naszierender Peptide ab.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Translationsreaktion unmittelbar nach der Inkubationszeit zu stoppen. Um eine Freisetzung des neu synthetisierten Polypeptids aus dem Ribosom zu vermeiden, ist es offensichtlich entscheidend, RNA-Verunreinigungen in jedem Arbeitsschritt zu vermeiden. RNA-Verunreinigungen können die Translationsleistung des Extrakts beeinträchtigen und zur Freisetzung des neu synthetisierten Polypeptids aus dem Ribosom führen, wenn diesem Verfahren gefolgt wird.

Weitere Ziele, wie zum Beispiel die Auswirkungen von mRNA-bindenden Proteinen auf die Effizienz der Ribosomenbewegung entlang einer bestimmten mRNA, können nach ihrer Entwicklung ebenfalls untersucht werden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Proteinfaltung den Weg, um die Rolle der Translation zu erforschen, die sich aufgrund der Anwesenheit seltener Codons bei der translationalen Proteinfaltung ergibt. Diese Technik wurde zuvor bereits verwendet, um die Rolle von Kationenaustauschen hinsichtlich der Ribosomenbewegung entlang einer mRNA und der translationalen Proteinfaltung zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man translativ aktive Stellen anhand von mRNA identifiziert, indem man neu synthetisierte Polypeptide isoliert, die an das Ribosom gebunden sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Isotopen und markierten Aminosäuren, wie beispielsweise A 35 Methionin, besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordert und stets berücksichtigt werden sollte, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.