Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide In-vitro- Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, wichtige translationale Pausenstellen für eine mRNA zu identifizieren und zu lokalisieren, die in einem zellfreien Translationssystem translatiert wurde. Dies wird erreicht, indem zunächst das interessierende Gen unter der Kontrolle eines transkriptionellen Promotors von T sieben kloniert wird. Als nächstes wird die mRNA transkribiert und aufgereinigt.

Dann wird die In-vitro-Translation in Gegenwart von mRNA und radioaktiven Aminosäuren durchgeführt, um das synthetisierte Protein und die naszierenden Polypeptide zu markieren. Schließlich werden die Polysomen mittels Sedimentationsgeschwindigkeitszentrifugation isoliert und die isolierten naszierenden Ketten durch Gelelektrophorese aufgelöst. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die naszierende Polypeptide unterschiedlicher Länge durch Tristin SDS-Seite und Autoradiographie zeigen, was auf das Vorhandensein der Pausenstellen entlang der interessierenden mRNA hinweist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden, wie z.B. dem Mikrokokalkernschutz-Assay, besteht darin, dass sie extrem einfach, schnell und effizient ist und die Bestimmung und Identifizierung der wichtigsten Translationspost-Stellen entlang einer beliebigen MNA in einem gegebenen Zellrisikosystem ermöglicht. Diese Methode kann dazu beitragen, einige der Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Translation und der translationalen Proteinfaltung zu beantworten, wie z.B. Gesundheitsfaktoren wie die Verwendung von Zapfen, die TNA-Häufigkeit und/oder die mRNA-Sekundärstruktur können die Kinetik der Translation beeinflussen. Diese Methode kann unser Verständnis der Beziehungen zwischen der Kinetik der Translation und den Schlüsselschritten im Faltungsweg des Code-Translationsproteins weiter verbessern.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf das Verständnis des Prozesses der Proteinfaltung in vivo, von dem weitgehend angenommen wird, dass er ko-translational während der Translation auf Ribosomen abläuft, obwohl die vorliegende Studie die zellfreie Translation von gamma bikristallinem Zellextrakt unter Verwendung von kommerziell erhältlichem Zellextrakt beinhaltet. Diese Technik kann auch angewendet werden, um translationale IDE in potenziell jedem Protein unter Verwendung von translational kompetentem Extrakt aus einer beliebigen zellulären Quelle zu identifizieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten bei zwei wichtigen Schritten des Protokolls haben.

Die erste ist die Bestimmung der Gesamtzeit, die für die Durchführung der Translationsreaktion erforderlich ist, wodurch sichergestellt wird, dass die Mehrheit der naszierenden Polypeptide an das Ribosom gebunden bleibt. Und die zweite besteht darin, ein geeignetes gerechtes System zu finden, um die Mehrheit der entstehenden Polypeptide aufzulösen, die Wahl des gerechten Systems hängt von der Größe des zu untersuchenden Proteins ab. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir uns Mitte der achtziger Jahre dazu entschlossen haben, die Translationskinetik der Globinmoleküle in Bezug auf das vorgeschlagene Modell der COT-Translationsfaltung von Globin zu untersuchen.

Die Ungleichmäßigkeit der Globin-Translation wurde erstmals 1974 von PRO und Maurice bemerkt, als sie die Größenokklusions-CLO-Chromatographie des Globin-NAS und der Ketten verwendeten. Ihre Analyse besaß jedoch nicht die wünschenswerte Präzision Pro und es werden vier Hauptstellen der Translationskraft während der Translation des Globins beobachtet. Anschließend ermöglichte unsere Analyse, etwa 10 zusätzliche Kraftstellen aufzudecken und ein detailliertes Modell der translationalen Globinfaltung zu erstellen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die hier beschriebene Technik die Isolierung des Polysoms und die Analyse des naszierenden Polypeptids unter Verwendung von Tri S Ds Seitengel umfasst.

Beide Schritte sind entscheidend, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Das Progel wird von einem Doktoranden des Myelo-Labors Sujata für die In-vitro-Transkription von Boten-RNA demonstriert. Beginnen Sie mit einem interessierenden Gen, das unter einem T 7 und/oder einem SP 6 Promotor unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms linear kloniert wurde, die DNA-Matrize stromabwärts des Stoppcodons und/oder MR NA drei Prime Endsubjekt.

Eine Probe des Restriktionsverdaus zur Aros-Gelelektrophorese, um zu überprüfen, ob die DNA vollständig linearisiert ist. Nachdem Sie die optimale DNA-Matrizenkonzentration bestimmt haben, verwenden Sie ein Transkriptionskit, um Boten-RNA in vitro gemäß den Anweisungen des Herstellers zu transkribieren. Verwenden Sie anschließend Lithiumchloridfällung, um die mRNA zu reinigen.

Verwenden Sie dann entweder Acrylamid oder Aros-Gelelektrophorese, um die Reinheit zu überprüfen. Bereiten Sie eine 100-Mikroliter-In-vitro-Translationsreaktion in nukleasefreiem Wasser vor, indem Sie eine einmillimolare Aminosäuremischung abzüglich Methionin, 10 Einheiten RNA-Inhibitor, 20 Mikrocurie radioaktives 35-s-Methionin und Kaninchen-Retikulozytenlysat hinzufügen. Als nächstes erwärmen Sie die Reaktion, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Fügen Sie dann zwei Mikrogramm mRNA hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 30 Grad Celsius, um die Reaktion zu stoppen, und legen Sie sie auf Eis, um naszierende Polypeptide zu isolieren, die an Ribosomen gebunden sind. Schichten Sie die Translationsreaktion auf 4,5 Milliliter 30 % Glycerin Interest HCL pH 7,6 mit Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid unter Verwendung einer TLA 110 Rotorzentrifuge bei 100.000 mal G für eine Stunde bei Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand, resuspendieren Sie dann das polysomale Pellet mit naszierenden Polypeptiden in einem kleinen Volumen von einem millimolaren Tris, HCL-Puffer pH 7,6, der 0,5 Milligramm pro Milliliter Ribonuklease A enthält, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Um die Hydrolyse des Peptids, der TRNA-Esther-Bindung, zu verbessern, fügen Sie der Reaktion Natriumhydroxid in einer Endkonzentration von 10 Millimolar hinzu und inkubieren Sie es für weitere 30 Minuten. Lösen Sie die entstehenden Polypeptide auf der tris tri SDS-Seite auf, fixieren und trocknen Sie die Gele. Unterziehen Sie die Gele einer Autoradiographie, gefolgt von einer Phospho-Bildgebung zum Nachweis naszierender Polypeptide.

Eine veränderte Ribosomenbewegung, die durch Veränderungen im TRNA-Pool induziert wird, sollte zu Veränderungen in der Größenverteilung der naszierenden Polypeptide, die sich während der Translation akkumulieren, sowie ihrer relativen Intensitäten führen, die hier die Dauer der Pause widerspiegeln. Nazierende Polypeptide für das kristalline Gamma-B-Protein wurden isoliert und mittels Tristin SDS-Seite aufgelöst. Die nicht identischen Längen und Intensitäten der Polypeptide in den RRL- und e-coli-Systemen deuten darauf hin, dass die Bewegung der Ribosomen entlang der mRNA in diesen beiden Systemen unterschiedlichen Translationskinetiken folgt.

Beachten Sie zum Beispiel die prominente 17,7-Kilodalton-Bande im E-Coli-Lysat, die im Retikulozyten-Lysat-System von Kaninchen nicht vorhanden ist. Gamma B kristallin beherbergt Tandem-Arginin-Codons, die in Säugetiersystemen häufig vorkommen, aber als extrem selten bekannt sind und in E-coli langsam übersetzt werden, was darauf hindeutet, dass diese Bande durch Ribosomen verursacht wird. Halten Sie bei diesen seltenen Tandem-Codons inne, wie hier gezeigt.

In Abwesenheit von mRNA können keine Banden beobachtet werden, und die reine Mycin-Behandlung entfernt die meisten naszierenden Ketten aus dem Polysom. Darüber hinaus werden bei längerer Behandlung mit purem Mycin alle naszierenden Ketten entfernt, was bestätigt, dass es sich bei den beobachteten Polypeptidprodukten um Ribosomen-assoziierte naszierende Ketten handelt und nicht um MRPs, die mit Polysomen kosedimentieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Tagen durchgeführt werden. Die Dauer des Eingriffs hängt hauptsächlich von der Dauer des Zentrifugationsschritts und des entstehenden Peptid-Gel-Elektrophorese-Schritts ab.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Translationsreaktion unmittelbar nach der Inkubationszeit zu stoppen. Um die Freisetzung von naszierendem Polypeptid aus dem Ribosom zu vermeiden, ist es offensichtlich wichtig, RNAs in jedem Schritt zu vermeiden. Eine Kontamination der RNAs kann die Translationseffizienz des Extrakts beeinträchtigen und zur Freisetzung des naszierenden Polypeptids aus dem Ribosom führen.

Andere Ziele, wie z.B. die Auswirkungen von mRNA-bindenden Proteinen auf die Effizienz der Ribosomenbewegung auf eine gegebene Botschaft, können ebenfalls nach ihrer Entwicklung getestet werden. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Proteinfaltung, um die Rolle der Translationsposen aufgrund des Vorhandenseins seltener Codes bei der translationalen Proteinfaltung zu untersuchen. Diese Technik wurde zuvor eingesetzt, um die Rolle von Kaon-Substitutionen auf die Ribosomenbewegung auf eine Nachricht und die translationale Proteinfaltung zu testen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie translationale Kraftstellen identifiziert, die mRNA präsentieren, indem Sie naszierendes Polypeptid isolieren, das an das Ribosom gebunden ist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Isotopen und markierten am minor Säuren, wie z. B. A 35 Methionin, besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordert und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer berücksichtigt werden sollte.