Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, SEC TED 70 s ribosomengebundene, naszierende Kettenkomplexe oder RNCs, die während der Translation in einem in vitro zellfreien System produziert werden, zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine 17 Aminosäuren lange SEC M-Stalling-Sequenz an das C-terminale Ende des interessierenden Gens eingeführt und stromabwärts des transkriptionellen Promotors T sieben kloniert wird. Anschließend wird die mRNA mit Hilfe einer In-vitro-Transkriptionsreaktion transkribiert und anschließend aufgereinigt.

Dann wird die gereinigte mRNA in ein S 30 E Coli-Extraktsystem mit radioaktiven Aminosäuren übersetzt, um das synthetisierte Protein oder das entstehende Polypeptid zu markieren. Schließlich werden die zweiten Mr.Ed-Ribosomen-gebundenen naszierenden Kettenkomplexe durch Saccharose, Gradient, Zentrifugation und Fraktionierung isoliert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass naszierende Ketten durch Gelelektrophorese-Analyse der markierten Polypeptide, die aus den Gradientenfraktionen isoliert wurden, stabil an das 70 s-Ribosom gebunden sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Verwendung von mRNA ohne Stammcodon, besteht darin, dass sie mit hoher Effizienz die Bindung der naszierenden Polypeptidkette an das 70 s-Ribosom während der Translation und des anschließenden Zentrifugationsschritts gewährleistet. Darüber hinaus kann diese Methode im Gegensatz zur No-Stop-Cordon-Technologie sowohl in vitro als auch in vivo Systemen mit nahezu gleicher Effizienz eingesetzt werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der translationalen Proteinfaltung zu beantworten, z. B. wie früh während der Translation verschiedene translationale Faltungszwischenprodukte gebildet werden können, und darüber hinaus helfen, ihre Struktur anhand der direkten oder indirekten Struktur zu analysieren.

Sondierungs- und Bestimmungsansätze Diese Technik kann uns helfen, den Weg der Proteinfaltung auf dem Ribosom zu entschlüsseln. In diesem Protokoll haben wir die Isolierung von 70 s ribosomengebundenen Bine gamma B kristallinen naszierenden Ketten beschrieben. Diese Technik kann jedoch für die Isolierung der Vari-Krankheit von praktisch jedem Protein von Interesse verwendet werden.

Diese Strategie kann auch angewendet werden, um verkürzte Natin-Polypeptidketten der derm E zu isolieren. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, während des Schritts der Saccharosegradientenzentrifugation Schwierigkeiten haben. Für Erfahrung eins sollte dies jedoch kein Problem sein. Wir entschieden uns, eine zweite Stalling-Sequenz zu verwenden, um gamma-B-kristalline nazierende Polypeptide zu isolieren, die an 70 als Ribosom gebunden sind, nach ersten, weniger erfolgreichen Versuchen, bei denen mRNA ohne Stoppcordon verwendet wurde.

Die spätere Technik konnte die Stabilität der RNCs während der nachfolgenden Zentrifugationsschritte nicht mit der gleichen Effizienz gewährleisten wie die Technik, die die Verwendung der SECM-Arrestsequenz beinhaltet. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Vorbereitung des Gradienten und zur Trennung des RNC möglicherweise schwer zu erlernen sind und ein gewisses Maß an Fachwissen erfordern, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Die Demonstration der Haltung wird von einem Doktoranden aus meinem Labor durchgeführt, um eine In-vitro-Transkription und -Translation durchzuführen. Beginnen Sie mit einem Gen von Interesse, das in ein beliebiges Plasmid auf T-Sieben- und/oder SP-Sechs-Basis kloniert wird, um Ribosomen-Naszenter-Kettenkomplexe oder RNCs zu erzeugen.

Verlängern Sie den C-Terminus des Zielpolypeptids durch Hinzufügen der Arrest-induzierenden Sequenz von M, um sicherzustellen, dass das Polypeptidfragment aus dem ribosomalen Tunnel extrudiert. Fügen Sie einen flexiblen, syrischen Glycin-reichen Linker zwischen dem Protein und der SEC M-Arrestsequenz hinzu, um die In-vitro-Transkription vorzubereiten, ein Benutzerrestriktionsenzym, das stromabwärts des offenen Leserahmens schneidet, um die Matrizen-DNA zu linearisieren, und AROS-Gelelektrophorese, um den vollständigen Verdau der Probe zu überprüfen. Nachdem Sie die optimale DNA-Konzentration überprüft haben, verwenden Sie ein Transkriptionskit mit hoher Ausbeute gemäß den Anweisungen des Herstellers, um Boten-RNA zu synthetisieren.

Verwenden Sie Lithiumchlorid-Fällung, um die mRNA zu reinigen. Führen Sie dann eine Probe auf einem Acrylamid- oder Arous-Gel durch, um deren Reinheit zu überprüfen. Für die In-vitro-Translation.

Unter Verwendung eines E-Coli-Systems in nukleasefreiem Wasser wird ein Aminosäuregemisch von einem Millimolar abzüglich Methionin, 10 Einheiten des Ribonuklease-Inhibitors 20, Mikrocurie von 35 s Methionin, 20 Mikroliter Reaktionsmix, 24 Mikroliter Rekonstitutionspuffer und 24 Mikroliter E-Coli hinzugefügt. Lysat. Die Reaktion wird vorgewärmt, indem man sie fünf Minuten lang bei 30 Grad Celsius inkubiert. Fügen Sie dann ein bis zwei Mikrogramm mRNA hinzu und inkubieren Sie weitere 10 bis 15 Minuten bei 30 Grad Celsius.

Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie es auf Eis legen, um 70 s Ribosomen-gebundene naszierende Kettenkomplexe oder ncs zu isolieren. Schichten Sie die Translationsreaktion auf 4,5 Milliliter eines Saccharosegradienten von fünf bis 30 % in 20 Millimolaren Häufchen. Kaliumhydroxid pH 7,5 15 Millimolar Magnesium, 100 Millimolar Kaliumacetat und ein Millimolar DTT Zentrifugen bei 41.000 U/min für zwei Stunden bei vier Grad Celsius nach der Zentrifugation, fraktionieren den Saccharosegradienten unter Verwendung eines programmierbaren Dichtegradientensystems und eines Absorptionsdetektors, der auf 254 Nanometer eingestellt ist.

Sammeln Sie die Fraktionen, die 70 s-Ribosomen enthalten, für eine weitere Analyse, um zu bestimmen, ob das SEC M extended Protein an das 70 s Ribosom gebunden bleibt. Das Protein in jeder Gradientenfraktion wird durch Zugabe von Trichloressigsäure ausgefällt. Inkubieren Sie die Proben am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius, zentrifugieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 14.000 mal G, um das Protein zu pelletieren, waschen Sie die Pellets in einem Verhältnis von vier zu eins von Aceton zu einem Millimolar Tris, HCL pH 7,6.

Trocknen Sie die Pellets an der Luft und suspendieren Sie sie dann wieder im SDS-Seitenladepuffer. Lösen Sie die Proben auf der tris Trice SDS-Seite auf, fixieren und trocknen Sie die Gele und unterziehen Sie sie einer automatischen Radiographie und Phospho-Bildgebung, wie hier gezeigt. Nach der In-vitro-Translation wurden die 70 S-Ribosomen durch Saccharose, Gradient, Zentrifugation und Fraktionierung isoliert, um sicherzustellen, dass das kristalline Gamma-B-Protein stabil an das Ribosom gebunden bleibt.

Die 70 s enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, entsalzter Puffer ausgetauscht und einer zusätzlichen Runde Saccharosegradientenzentrifugation unterzogen. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass SEC M effizient einen translationalen Arrest der kristallinen Gamma-B-RNCs induzieren kann. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie an einem Arbeitstag durchgeführt werden, mit Ausnahme der Gelelektrophorese-Analyse der entstehenden Kette, die in der Regel einen TCA-Ausfällungsschritt über Nacht beinhaltet.

Bei diesem Verfahren ist es natürlich entscheidend, eine Kontamination der RNAs bei allen Schritten zu vermeiden. Eine RNS-Kontamination kann die Translationseffizienz des Extrakts beeinträchtigen und zur Freisetzung von naszierendem Polypeptid aus dem 70. Ribosom führen. Nach diesem Verfahren kann man NAST und Polypeptide von vorgegebenem Lanxess erhalten, die je nach Endziel stabil an das 70. Ribosom gebunden sind.

Diese Komplexe können für verschiedene Zwecke verwendet werden, z.B. zur Bestimmung der Bestätigung der ribosomengebundenen naszierenden Ketten mit direkten und indirekten Ansätzen wie NMR oder Fre oder zum Testen der Faktor- und Ligandenbindung nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Strukturbiologie und Proteinfaltung den Weg, um die Bestätigung von Proteinen in voller Länge, die an Ribosomen gebunden sind, sowie von translationalen Faltungszwischenstufen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein naszierendes Polypeptid vorbereitet und isoliert, das stabil an das 70-s-Ribosom gebunden ist, das weiter verwendet werden kann, um verschiedene Fragen im Bereich der translationalen Proteinfaltung zu beantworten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Isotopen und markierten Aminsäuren, wie z. B. A 35-Methionin, besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordert und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer berücksichtigt werden sollte.