Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, SEC TED 70 S Ribosomen-gebundene Komplexe mit naszierenden Ketten oder RNCs zu isolieren, die während der Translation in einem in-vitro-Zellfreien System entstehen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine 17 Aminosäuren lange SEC M-Stallsequenz an das C-terminale Ende des Gens der Interesse angefügt und dieses downstream des T-sieben-Transkriptionspromotors kloniert wird. Anschließend wird die mRNA mittels einer in-vitro-Transkriptionsreaktion transkribiert und danach gereinigt.

Anschließend wird die gereinigte mRNA in einem S 30 E coli-Extraktsystem mit radioaktiven Aminosäuren übersetzt, um das synthetisierte Protein oder die naszierende Polypeptidkette zu markieren. Schließlich werden die zweiten, an Ribosomen gebundenen Komplexe der naszierenden Ketten durch Zentrifugation in einer Saccharosegradienten-Fraktionierung isoliert. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die zeigen, dass naszierende Ketten stabil an das 70 S Ribosom gebunden sind, basierend auf der Gelelektrophorese-Analyse der markierten Polypeptide, die aus den Gradientenfraktionen isoliert wurden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Verwendung von mRNA ohne Stopp-Codon, liegt darin, dass sie mit hoher Effizienz die Bindung der neu entstehenden Polypeptidkette an die 70-S-Ribosomen während der Translation und den anschließenden Zentrifugationsschritt sicherstellt. Zusätzlich kann diese Methode im Gegensatz zur No-Stop-Codon-Technologie mit nahezu gleicher Effizienz sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der translationalen Proteinfaltung zu beantworten, beispielsweise, wie früh während der Translation verschiedene translatio­nale Faltungsintermediate entstehen können, und ermöglicht es zudem, deren Struktur mithilfe direkter oder indirekter Strukturanalysen zu untersuchen.

Untersuchungs- und Bestimmungsmethoden: Diese Technik kann uns helfen, den Weg der Proteinfaltung am Ribosom zu entschlüsseln. In diesem Protokoll haben wir die Isolierung von 70 S-Ribosomen-gebundenen, vollständigen naszenten Ketten von Bine-Gamma-B-Crystallin beschrieben. Doch diese Technik kann auch zur Isolierung variabler Krankheiten praktisch jedes Proteins der Interesse verwendet werden.

Diese Strategie kann auch angewendet werden, um abgeschnittene Natin-Polypeptidketten des Derm Es. zu isolieren. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode nicht vertraut sind, Schwierigkeiten während des Schritts der Zentrifugation im Saccharosegradienten haben. Für Erfahrene sollte dies jedoch kein Problem darstellen. Wir entschieden uns, eine zweite Stoppsequenz zu verwenden, um die an das 70S-Ribosom gebundenen naszenten Polypeptide von Gamma-B-Crystallin zu isolieren, nach anfänglichen, weniger erfolgreichen Versuchen, bei denen eine mRNA ohne Stoppcodon verwendet wurde.

Die spätere Technik konnte die Stabilität der RNCs während nachfolgender Zentrifugationsschritte nicht mit der gleichen Effizienz sicherstellen wie die Methode unter Verwendung der SECM-Arrestsequenz. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da die Schritte zur Herstellung des Gradienten und zur Trennung der RNCs schwierig zu erlernen sein können und ein gewisses Maß an Fachkenntnis erforderlich ist, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Zur Durchführung der in-vitro-Transkription und -Translation wird ein Doktorand aus meinem Labor die Haltung demonstrieren. Beginnen Sie mit einem Gen der Wahl, das in ein beliebiges T7- oder SP6-basiertes Plasmid kloniert wurde, um Ribosomen-Nascent-Chain-Komplexe oder RNCs zu erzeugen.

Verlängern Sie das C-Terminus des Ziel-Polypeptids durch Hinzufügen der Arrest-induzierenden Sequenz von M, um sicherzustellen, dass das Polypeptidfragment aus dem ribosomalen Tunnel austritt. Fügen Sie einen flexiblen, reich an Glycin und Serin enthaltenden Linker zwischen dem Protein und der SEC-M-Arrestsequenz hinzu, um die Vorbereitung für die Transkription in vitro zu ermöglichen. Verwenden Sie ein Restriktionsenzym, das stromabwärts des offenen Leserahmens schneidet, um die Vorlage-DNA zu linearisieren, und führen Sie eine AROS-Gelelektrophorese durch, um die vollständige Verdauung der Probe zu überprüfen. Nach Überprüfung der optimalen DNA-Konzentration verwenden Sie gemäß den Herstelleranweisungen ein Transkriptionskit mit hoher Ausbeute, um die Boten-RNA zu synthetisieren.

Verwenden Sie eine Lithiumchlorid-Fällung zur Reinigung der mRNA. Führen Sie anschließend eine Probe in einem Acrylamid- oder Agarosegel durch, um die Reinheit zu überprüfen. Für die Translation in vitro.

Verwenden Sie ein E. coli-System in nukleasefreiem Wasser und geben Sie eine einmillimolare Aminosäuremischung ohne Methionin, 10 Einheiten Ribonuklease-Inhibitor, 20 Mikrocurie 35S-Methionin, 20 Mikroliter Reaktionspuffer, 24 Mikroliter Rekonstitutionspuffer und 24 Mikroliter E. coli-Lysat hinzu. Prewärmen Sie die Reaktion, indem Sie sie fünf Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie anschließend ein bis zwei Mikrogramm mRNA hinzu und inkubieren Sie weitere 10 bis 15 Minuten bei 30 Grad Celsius.

Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie sie zur Isolierung von 70 S Ribosomen-gebundenen naszenten Kettenkomplexen oder ncs auf Eis stellen. Geben Sie das Übersetzungsreaktionsgemisch auf 4,5 Milliliter eines fünf bis 30 %igen Saccharosegradienten in 20 Millimolar HEPES, 15 Millimolar Magnesium, 100 Millimolar Kaliumacetat und 1 Millimolar DTT, pH 7,5, hergestellt mit Kaliumhydroxid. Zentrifugieren Sie bei 41.000 U/min für zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Fraktionieren Sie nach der Zentrifugation den Saccharosegradienten mithilfe eines programmierbaren Dichtegradientensystems und eines Absorptionsdetektors, der auf 254 Nanometer eingestellt ist.

Sammeln Sie die Fraktionen, die 70-S-Ribosomen enthalten, für weitere Analysen, um zu bestimmen, ob das SEC-M-verlängerte Protein weiterhin am 70-S-Ribosom gebunden bleibt. Fällen Sie das Protein in jeder Gradientenfraktion durch Zugabe von Trichloressigsäure. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius; am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 × g für 15 Minuten, um das Protein zu pelletieren, und waschen die Pellets im Verhältnis von vier Teilen Aceton zu einer Millimolar-Lösung aus Tris, HCl, pH 7,6.

Trocknen Sie die Pellets an der Luft und resuspendieren Sie sie dann in SDS-PAGE-Lade-Puffer. Trennen Sie die Proben mittels Tris-Triz-SDS-PAGE, fixieren und trocknen Sie die Gele und unterziehen Sie sie der Autoradiographie und Phosphoimaging, wie hier gezeigt. Nach der In-vitro-Translation wurden die 70-S-Ribosomen durch Zentrifugation über einen Saccharosegradienten und Fraktionierung isoliert, um sicherzustellen, dass das Gamma-B-Crystallin-Protein stabil an das Ribosom gebunden bleibt.

Die Fraktionen, die 70 S enthielten, wurden gesammelt, gepuffert und entsalzt und einer zusätzlichen Runde der Zentrifugation in einem Saccharose-Gradienten unterzogen. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass SEC M die Translation der gamma-B-Crystallin-RNCs effizient hemmen kann. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie an einem Arbeitstag durchgeführt werden, mit Ausnahme der Gelelektrophorese-Analyse der naszierenden Kette, die üblicherweise einen Übernacht-Schritt der TCA-Fällung beinhaltet.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es offensichtlich entscheidend, RNA-Kontaminationen in jedem Schritt zu vermeiden. RNA-Kontaminationen können die Translations-Effizienz des Extrakts beeinträchtigen und zur Freisetzung des neu synthetisierten Polypeptids aus dem 70S-Ribosom führen. Nach diesem Verfahren können je nach endgültigem Ziel NAST und Polypeptide mit vorbestimmter Länge erhalten werden, die stabil an das 70S-Ribosom gebunden sind.

Diese Komplexe können für verschiedene Zwecke verwendet werden, wie beispielsweise die Bestimmung der Konformation ribosomengebundener naszenten Ketten mithilfe direkter und indirekter Methoden wie NMR oder FRE oder die Untersuchung der Bindung von Faktoren und Liganden nach der Entwicklung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Strukturbiologie und der Proteinfaltung den Weg, um die Konformation vollständiger, an das Ribosom gebundener Proteine sowie cotranslationaler Faltungsintermediate zu untersuchen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man naszente Polypeptide präpariert und isoliert, die stabil an das 70 S-Ribosom gebunden sind und anschließend zur Beantwortung verschiedener Fragen im Bereich der translationalen Proteinfaltung eingesetzt werden können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Isotopen und markierten Aminosäuren, wie zum Beispiel A 35 Methionin, besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordert und bei der Durchführung dieses Verfahrens stets berücksichtigt werden muss.