Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Lyco-negativer Strang, RNA-Viren. Das Genom von Influenzaviren ist in Form von viralen Rippen-Kernproteinkomplexen oder VR-NPs verpackt, bei denen das einzelsträngige Genom durch das Kernprotein eingekapselt und mit dem Kurkuma-Polymerase-Komplex assoziiert ist, der aus den Untereinheiten PA, PB, eins und PB zwei besteht, um intakte Komplexe von infizierten Säugetierzellen zu reinigen. Hela-Zellen werden mit rekombinanten strept-markierten Influenzaviren inkubiert.

Sobald das Virus in die Zellen eindringt, wird die virale RNA nach der Infektion in den Zellkernen synthetisiert, die Zellen werden einem Detergens unterzogen und unter Verwendung von Zentrifugation und angriffsbasiertem Chromatinfraktionsprotokoll in zytoplasmatische Kern- und Chromatinfraktionen fraktioniert. Schließlich werden die mit Streptogrammen markierten VRPs aus jeder Fraktion affinitätsgereinigt. Die Analyse der Protein- und RNA-Zusammensetzung von gereinigten VR-NPS durch Silberfärbung zeigt, dass chromatingebundene VRPs auch unter strikter Verwendung dieses Protokolls isoliert werden können. Intakt. Einer der Hauptvorteile unseres Protokolls im Vergleich zu Standardmethoden zur Affinitätsreinigung von Influenzavirus-Rippen-Kernproteinkomplexen besteht darin, dass es mit unserer Methode möglich ist, VR-NPS aus dem Chromatin infizierter Zellen zu reinigen, von dem bekannt ist, dass es der Ort der mRNA-Synthese von Influenzaviren ist.

Unsere Methode könnte also zur Beantwortung von Fragen rund um die Regulation der viralen Replikation und Transkription verwendet werden, wie z.B. welche viralen oder zellulären Faktoren, aber auch welche posttranslationalen Modifikationen beispielsweise für die virale mRNA-Synthese oder auch die virale genomische RNA-Synthese erforderlich sind. Forscher, die neu in dieser Methode sind, könnten also auf Schwierigkeiten stoßen, da die subnukleäre Fraktionierung sehr empfindlich auf biochemische Bedingungen reagiert und auch zwischen verschiedenen Zelllinien stark variieren kann. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Heilung unserer Zellen, die mit dem Influenzavirus infiziert wurden, RWSN PB zwei Streptokokken, das ein Streptokokken-Tag hat, das genetisch mit dem C-Terminus der PB zwei Untereinheit bei einer Vielzahl von Infektionen von drei verschmolzen ist.

Waschen Sie die Zellen einmal mit kaltem PBS, fügen Sie dann 12 Milliliter kaltes PBS hinzu und nehmen Sie sie aus der Schüssel. Mit einem Gummischaber. Füllen Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist das Zellfraktionierungsprotokoll. Zellkerne reagieren sehr empfindlich auf Homogenisierungs- und Mischverfahren, und wenn sie falsch durchgeführt werden, kann ein Chromatinextrakt leicht ruiniert werden. Daher ist es sehr wichtig, nicht nur die Homogenisierungstechniken zu befolgen, sondern auch die allgemeine Handhabung von Lysaten, wie wir hier zeigen.

Nach dem Spin-Aspirat, dem PBS und dem Resus wird das Zellpellet in 10 Millilitern kaltem Saccharosepuffer suspendiert. Befestigen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze an einer 10-Milliliter-Serumpipette aus Kunststoff und führen Sie die Zellen hindurch, um Zellklumpen aufzubrechen. Inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang auf Eis.

Periodisches Umdrehen der Zellen sanft, um sie wieder zu suspendieren. Als nächstes fügen Sie Nicht-IET P 40 zu einer Endkonzentration von 0,5 % hinzu und wirbeln Sie 15 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit vortexen und zentrifugieren Sie sofort 10 Minuten lang bei 3.500 mal G bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge. Nach dem Schleudern das Supinat entfernen und in ein 15 Milliliter bis konisches Röhrchen geben.

Lagern Sie das Supinat bei vier Grad Celsius. Dabei handelt es sich um eine zytoplasmatische Fraktion. Das Pellet sollte kleiner und weißer sein als das ursprüngliche Zellenpellet, wie hier gezeigt.

Wenn das Protokoll zu einem späteren Zeitpunkt abgeschlossen wird, lagern Sie das Zellpellet bei vier Grad Celsius. Andernfalls fahren Sie fort, indem Sie das Pellet in fünf Millilitern kalter Saccharose waschen, puffern und wie zuvor zentrifugieren. Sobald die Drehung abgeschlossen ist, verwerfen Sie das Supinat und resuspendieren Sie das Pellet, das die Kerne in 1,5 Millilitern kaltem nuklearen plasmatischen Extraktionspuffer enthält.

Übertragen Sie das resuspendierte Pellet mit einem dicht schließenden Stößel in einen gekühlten Ganzglas-Tanzhomogenisator mit vier Millilitern und homogenisieren Sie die Kerne mit 20 Hüben. Um Schaumbildung zu vermeiden, sollte der Widerstand nach ca. 10 Hüben zunehmen. Um eine effiziente Homogenisierung zu bestätigen, untersuchen Sie die Probe unter einem Phasenkontrastmikroskop.

Die Kerne sollten nicht mehr rund sein, sondern unregelmäßige Formen haben und aussehen, als wären sie geplatzt. Sobald die Kerne homogenisiert sind, überführen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie das Homogenat auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.

Dann zentrifugieren Sie bei 16.000 G in einer Mikrozentrifuge für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Spin übertragen Sie das Supinat, d. h. die nukleare plasmische Fraktion, in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern es bei vier Grad Celsius. Dann suspendierte Reese das Pellet in 1,5 Millilitern Aufschluss und heizte es auf 37 Grad Celsius vor.

Dann inkubieren Sie die Fraktion 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 42 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid hinzu, um die Endkonzentration von Natriumchlorid auf 150 Millimolar zu bringen, und inkubieren Sie dann 20 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie bei 16.000 mal, G in einer Mikrozentrifuge von vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Entfernen Sie nach dem Schleudern das Supinat und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Dies ist die Fraktion CH one 50. Reeses biegen das Pellet in 1,5 Milliliter kaltem Puffer mit hohem Salzgehalt und inkubieren 20 Minuten lang auf Eis.

Zentrifugieren Sie bei 16.000 mal, G in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nach dem Schleudern das Futter herausnehmen und bei vier Grad Celsius lagern. Dies ist die Fraktion CH 500.

Nehmen Sie die während des Fraktionierungsprotokolls eingesparten Fraktionen heraus und legen Sie sie auf Eis. Fügen Sie dann der zytoplasmatischen Fraktion 300 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid hinzu. Übertragen Sie dann 100 Mikroliter gepacktes Streptokokken T in Sphero-Kügelchen pro Fraktion in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie 10 Volumen Streptokokken-Waschpuffer zu den Perlen. Drehen Sie das Röhrchen zum Mischen um und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 1000 Mal. G in eine Tischzentrifuge legen, die Sna wegwerfen.

Wiederholen Sie die Pufferwäsche zweimal, biegen Sie dann das Pellet in einem gleichen Volumen Streptokokken-Waschpuffer und fügen Sie jeder Fraktion 200 Mikroliter gewaschene Streptokokken hinzu. Drehen Sie die Röhren eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen eine Minute lang bei 1000 mal G von vier Grad Celsius, verwerfen Sie das Supinat.

Geben Sie dann einen Milliliter Waschpuffer zu den Kügelchen für Kügelchen, die mit der zytoplasmatischen Fraktion in einem 15-Milliliter-Röhrchen inkubiert wurden. Fügen Sie den Waschpuffer hinzu und geben Sie die Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Kügelchen eine Minute lang und zentrifugieren Sie die Röhrchen dann eine Minute lang bei 1000 mal G bei vier Grad Celsius.

Wiederholen Sie den Vorgang nach dem letzten Waschschritt zweimal. Entfernen Sie alle Spuren des Waschpuffers mit einer flachen Pipettenspitze. Fügen Sie dann 100 Mikroliter elucianischen Puffer hinzu und mischen Sie vorsichtig und legen Sie die Röhrchen 15 Minuten lang auf Eis.

Mischen Sie die Kügelchen während der Inkubation gelegentlich, indem Sie vorsichtig auf den Boden der Röhrchen klopfen. Nach 15 Minuten ist die Zentrifuge eine Minute lang bei 1000 mal G bei vier Grad Celsius zu wählen. Sammeln Sie die Senna mit den eluierten VRPs, die mit Streptokokken markiert sind.

Er, unsere Zellen wurden neun Stunden lang mit dem Influenzavirusstamm WSN infiziert, und die fraktionierten Lysate wurden durch westliche Blüte analysiert, wie hier gezeigt. Durch die schonende Kernisolierung werden zytoplasmatische Proteine wie Tubulin effizient extrahiert und gleichzeitig die Freisetzung von reichlich vorhandenen Kernproteinen vermieden. Beachten Sie, dass die mit wenig Salz extrahierte Chromatinfraktion mit Proteinen angereichert ist, die für die Transkription wichtig sind.

Während die hohe Salzfraktion hauptsächlich Nukleosomen enthält, um die Proteinzusammensetzung der eluierten zytoplasmatischen Fraktion zu bestimmen, wurden V NPS aus den R-Zellen, die neun Stunden lang mit unmarkierten Viren infiziert waren, durch Silberfärbung analysiert, wie für ein zytoplasmatisches Eluat gezeigt. Hier gibt es ein hohes Verhältnis von NP zu PA PB eins, PB zwei, was durch die Hauptbande über 55 Kilodalton im Vergleich zu den Banden zwischen 95 und 100 Kilodalton belegt wird, was darauf hindeutet, dass der größte Teil von Streptokokken PB zwei als Teil eines voll ausgebildeten VRNP gereinigt wird, oder mit anderen Worten, es wird wenig lösliche Polymerase eingefangen, um die relativen Ausbeuten zu vergleichen. VR NPS, gereinigt nach neun Stunden Infektion mit RWSN, PB, zwei Streptokokken oder RWSN oder Silber gefärbt, wie in diesem Silberfärbegel gezeigt, Gel V RMPs können nach neun Stunden Infektion aus allen vier zellulären Fraktionen gereinigt werden.

Die höchste Konzentration von v RMPs findet sich im Kernplasma, obwohl beträchtliche Teile auch aus dem Zytoplasma und dem Chromatin gereinigt werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie hohe Ausbeuten an intakten Ribonukleoproteinkomplexen des Influenzavirus aus dem Zellkern infizierter Zellen reinigen können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, saubere Puffer zu verwenden und die Proben nicht unnötig Raumtemperatur auszusetzen, da auf diese Weise sowohl der RNA- als auch der Proteinabbau sowie die Demontage des Proteinkomplexes vermieden werden können.

Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem infektiösen Influenzavirus gefährlich sein kann. Alle Schritte sollten unter einer Werkbank der Biosicherheitsstufe zwei durchgeführt werden, bis NP 40 zu den Lysaten hinzugefügt wurde.