Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, den Einfluss von Restriktionsfaktoren auf den Abschluss des Hepatitis-C-Virus-Replikationszyklus in einer gegebenen Zelllinie zu untersuchen, wobei zwei Methoden verwendet werden, die auf der Heca-Bildung beruhen. Für die erste Methode beginnen Sie mit der Kultivierung menschlicher Leberzellen sowie heilen Sie A- und Hep 56 1D-Verpackungszellen, um anschließend das Hepatitis-C-Virus oder H-C-V-R-N-A durch Elektroporation in die Leberzellen zu transfizieren. Anschließend wurde die HCV-replizierende Zelllinie mit der jeweiligen Verpackungszelllinie durch Polyethylenglykol im zweiten Fusionsverfahren fsiert. Der erste Schritt ist die Herstellung eines HCV-Bestands mit hohem Titer.

Verschiedene Zelllinien werden dann in Co-Kultur kultiviert und die Zellfusion wird durch Transfektion des Prototyps eines schaumigen Virusglykoproteins induziert. Als nächstes werden die Hetero-Carons mit HCV infiziert. Nach beiden Methoden der Heterocarionenbildung wird eine Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, um die Fusion zu bestätigen und die Produktion infektiöser Partikel zu quantifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie für das Screening einer großen Anzahl von Zelllinien und Primärzellen auf die Expression von HV-spezifischen dominanten Restriktionsfaktoren nützlich ist. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Speziesspezifität und den Noms von HCV zu beantworten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um das Verständnis der zugrunde liegenden Konzepte der beiden Fusionssysteme vor der Induktion der Zellfusion durch Polyethylenglykol zu erleichtern.

HUH 7,5-Zellen werden gemäß den Standardprotokollen mit H-C-V-R-N-A transfiziert und am folgenden Tag 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultiviert. Harvest transfizierte HUH 7.5-Zellen, die das subgenomische Replikon beherbergen, sowie heilende R- und he 56 1D-Verpackungszellen. Diese Verpackungszellen wurden so konstruiert, dass sie die HCV-Proteine Core E eins, E zwei, P sieben und NS zwei ektopisch exprimieren, Zellen in DMEM resuspendieren, vollständiges Medium resuspendieren, die Zellsuspensionen auf die folgenden Konzentrationen verdünnen, HUH 7,5 bis fünfmal 10 auf die fünf Zellen pro Milliliter und heilen und hep 56 1D-Zellen auf zweimal 10 auf die fünf Zellen pro Milliliter.

Bereiten Sie als Nächstes eine Kulturplatte mit sechs Vertiefungen und zwei bis drei sterilen Glasabdeckgläsern pro Vertiefung vor. Für eine weitere Analyse der Fusionseffizienz kombinieren Sie einen Milliliter transfizierter HUH 7,5-Zellen mit einem Milliliter Verpackungszellen und säen Sie in eine Vertiefung der sechs Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid nach 24 Stunden. Überprüfen Sie die Zelldichte.

Die Zelldichte sollte vor der Induktion der Zellfusion zwischen 60 und 80 % Co-Flüssigkeit liegen, damit sich die Zellen in unmittelbarer Nähe der Zellmembranen befinden, um das Aspiratmedium aus den co-kultivierten Zellen zu fusionieren und einmal mit einem Milliliter PBS zu waschen. Dann vorsichtig 500 Mikroliter vorgewärmtes 40%iges Polyethylenglykol oder PEG 1, 500 hinzufügen. Geben Sie 500 Mikroliter PBS in eine andere Vertiefung mit Co-Kulturzellen als Kontrolle, inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Heterocarionenbildung zu induzieren, aspirieren Sie PEG und fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter PBS hinzu, aspirieren Sie das PBS und fügen Sie zwei Milliliter frische PBS-Wäsche mit PB S3 zu fünfmal für eine Minute pro Waschgang hinzu, um überschüssiges PEG zu entfernen.

Zum Schluss werden zwei Milliliter DMEM und vollständiges Medium in jede Vertiefung gegeben und 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. 48 Stunden nach der Fusion. Sammeln Sie jedes SNAT und filtrieren Sie es durch einen 0,45-Mikron-Filter, nachdem Sie die Snat-Fusion der Zellkultur entnommen haben. Die Fusionseffizienz der Zellkultur kann durch Immunfluoreszenz bestimmt werden. Waschen Sie die Vertiefungen mit den Glasdeckgläsern einmal mit einem Milliliter PBS für eine Minute.

Fixieren Sie die Zellen mit 600 Mikrolitern 3%Paraldehyd in PBS für 15 Minuten. Nach der letzten Wäsche dreimal eine Minute lang pro Waschgang mit PBS waschen. Verwenden Sie eine Pinzette, um Deckgläser vorsichtig für fünf Minuten in eine 24-Well-Platte mit permeablen Zellen mit 500 Mikrolitern 0,5 % Triton X 100 in PBS zu übertragen.

Anschließend dreimal mit PBS waschen und jeweils 250 Mikroliter der primären Antikörperlösung darauf auftragen. Verwenden Sie nun einen Anti-NS-Fünf-A-Antikörper in einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter und einen humanen monoklonalen Anti-E-Zwei-Antikörper in einer Konzentration von 6,4 Nanogramm pro Milliliter. Nach 45 Minuten 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dreimal mit PBS waschen.

Als nächstes fügen Sie 250 Mikroliter Sekundärantikörper zu jeder Vertiefung hinzu Sekundäre Ziegen-Anti-Maus- oder Anti-Human-IgG-spezifische Antikörper, die an Alexa Boden 5 46 oder Alexa Boden 4 88 konjugiert sind, werden in einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter verwendet. Nach 30 Minuten 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Einmal mit PBS waschen.

Anschließend färben Sie die Zellkerne mit 250 Mikrolitern DPI, verdünnt auf 3000 in PBS. Eine Minute lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, viermal mit PBS und einmal mit Wasser waschen. Zum Schluss schiebt man die Passepartout-Abdeckung kopfüber auf einen Tropfen Flora, montiert sie auf einem Objektträger und lässt sie im Dunkeln trocknen.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, ernten und bereiten Sie Einzelzellsuspensionen der folgenden Zellen vor. Luna NA humane Leberzelllinie, der die endogene Expression von CD 81 fehlt. He r Verpackungszellen und Hep 56 1D-Zellen, die menschliches CD 81 stabil exprimieren, kultivieren Luna n-Zellen gemeinsam mit he r-Zellen im Verhältnis eins zu eins und mit Hep 56 1D HCD 81 Zellen im Verhältnis eins zu zwei, was eine Gesamtzelldichte von 1,5 mal 10 pro 12 Zellen ergibt.

nächsten Tag 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gut inkubieren. Transfizierte Zellen mit einem hochgradig FU-genen PFE-Hüllprotein mittels Lipektomie 2000 nach Herstellerangaben. 30 Stunden nach der Transfektion mit PFE-Glykoprotein werden Hetero-Carons mit 350 Mikrolitern eines zuvor präparierten Virusbestands bei einem MOI von etwa 2,3 inokuliert.

Am nächsten Morgen 12 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Einmal mit PBS waschen und einen Milliliter DMEM-Vollmedium pro Vertiefung hinzufügen, 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid nach 48 Stunden inkubieren, das Supinat der Heterocarion-Kulturen ernten, das Supinat durch einen 0,45-Mikron-Filter filtrieren. Als nächstes wird das Supinat verwendet, um HUH 7,5-Zellen zu inokulieren, die am Vortag in einem Assay mit begrenzter Verdünnung in 96 Vertiefungsplatten gesät wurden, 72 Stunden lang inkubiert, bevor die Produktion von infektiösen Nachkommenpartikeln quantifiziert wird.

Das Verfahren zur Visualisierung von Fusionsereignissen muss sechs Stunden vor der Co-Kultur abgeschlossen werden: Adhärenzzellen einmal mit fünf Millilitern PBS waschen und dann vier Milliliter der entsprechenden DI-Lösung pro 10 Zentimeter Zugabe von vier Millilitern der entsprechenden DI-Lösung pro 10 Zentimeter Schalenschale inkubieren Zellen 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 %ige Kohlendioxid-Waschzellen einmal mit fünf Millilitern PBS für eine Minute und dann DMEM vollständiges Medium hinzufügen, sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und 5% Kohlendioxid vor der Aussaat. Fügen Sie nach der Aussaat ein Deckglas zu jeder Vertiefung der 12-Well-Platte hinzu und transfizieren Sie die Färbezellen wie zuvor gezeigt. 30 Stunden nach der Transfektion die Zellen eine Minute lang vorsichtig mit einem Milliliter PBS waschen und dann die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 250 Mikrolitern 3%Paraldehyd fixieren.

Waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter PBS für eine Minute und färben Sie sie dann eine Minute lang mit Dappy nach dem Waschen der Zellen einmal mit PBS und einmal mit Wasserhalterungen, Sonnenbrillen und Objektträgern im ersten Ansatz, um den Einfluss von Restriktionsfaktoren auf den Abschluss des HCV-Replikationszyklus zu untersuchen. In Hetero-Carons wurden HUH 7.5-Zellen zunächst transient mit einem subgenomischen Replikon, das ein Luciferase-Transgen und HCV-Nichtstrukturproteine exprimierte, transfiziert und dann co-kultiviert und mit Zelllinien fusioniert, die HCV-Strukturproteine, Kern- und akzessorische Proteine exprimieren. Ein repräsentatives Ergebnis ist in dieser Abbildung dargestellt: Zellen oder Immunfärbung mittels monoklonaler Antikörper gegen das Strukturprotein E zwei und NS fünf A Nichtstrukturprotein.

Die Bilder in den oberen Feldern zeigen, dass bei der Behandlung mit PEG-Signalen für MS fünf, A und D, zwei gleichzeitig im selben Zytoplasma nachgewiesen wurden, was auf eine Selbstfusion hinweist. Im Gegensatz dazu zeigen die in den unteren Panels, dass bei der Behandlung von co-kultivierten Zellen mit PBS keine Fusion induziert wurde. Daher wurde keine Kolokalisation von Signalen zur Quantifizierung der viralen Infektiosität beobachtet, die von Heterocarons erzeugt wurden. Snet wurde 48 Stunden nach der Fusionsinduktion aus den Co-Kulturen gesammelt und zur Inokulation naiver HUH 7,5-Zellen für nachfolgende Luciferase-Assays verwendet.

In dieser Grafik werden die Meme-Werte von drei unabhängigen Experimenten angezeigt. Der graue horizontale Balken stellt den Hintergrund für relative Lichteinheiten oder RLU dar, die in nicht infizierten HUH 7,5-Zellen bestimmt wurden. Bemerkenswert ist, dass, wenn HUH 7.5-Replikantenzellen entweder mit naiven Zelllinien fusioniert oder mit PBS als Kontrolle behandelt wurden, keine Infektiosität in den Kulturflüssigkeiten nachgewiesen wurde.

Wenn jedoch die Zellfusion zwischen HUH 7,5-Replikon- und Verpackungszelllinien durch PEG induziert wurde, wurden infektiöse Viruspartikel in die Kulturflüssigkeiten freigesetzt. Dies deutet darauf hin, dass die Virusproduktion eine Zellfusion und die Expression viraler Proteine in den Verpackungszelllinien erfordert. Nicht nur die Hetero-Carons von HUH 7,5 menschlichen Hepatomzellen, sondern auch Hetero-Carons mit humanen nicht-lebenden und Maus-Leberzellen ermöglichten die Freisetzung von Viren, was darauf hindeutet, dass Assemblierung und Freisetzung in diesen Zelltypen nicht dominant durch mögliche Restriktionsfaktoren gehemmt werden. In einem alternativen Ansatz wurde die somatische Zellfusion durch die Expression eines genetischen Glykoproteins nach Kultivierung der Zellen induziert.

Hetero-Caronen wurden durch Färben separater Zelllinien mit Zelltracker-Farbstoffen vor der Co-Kultivierung visualisiert und die Transfektion mit den genen Proteinzellen wurden fixiert und 30 Stunden nach der Transfektion mit DPI gefärbt, und ein repräsentatives Ergebnis ist in dieser Abbildung dargestellt. Die Fusion zweier Zelltypen wird durch ein Hetero-Carryon mit homogen verteilten Farbstoffen im Zytoplasma angezeigt, wie hier dargestellt. Im Gegensatz dazu zeigen die Bilder im unteren Bild das Fehlen von Zellen mit einer Doppelfärbung des Zytoplasmas, was auf das Fehlen einer Zellfusion hinweist.

Diese abschließende Grafik zeigt, dass alle HCV-Eintragsfaktoren nur in Hetero-Trägern von Luna N-Zellen exprimiert werden, wobei Hela- oder Hep 56 1D-Zellen humane CD 81 exprimieren. Hier wurden die Kulturen mit infektiösen HCV-Partikeln beimpft. Die Kulturflüssigkeiten wurden 48 Stunden später entnommen und die De-novo-Partikelfreisetzung aus Heterocaronen wurde durch einen Limitierungsverdünnungsassay mit naiven HUH 7,5-Zielzellen bestimmt, die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten sind dargestellt, und der graue horizontale Balken stellt die Nachweisgrenze des Assays dar.

A als Kontroll-N-Zellen des Mondes wurden mit N-Zellen des Mondes fusioniert, was zu sehr niedrigen Konzentrationen von infektiösem HCV nahe der Nachweisgrenze führte. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn lunare N-Zellen mit naiven HEP 56 1D-Zellen fusioniert wurden. In beiden Fällen fehlte humanes CD 81, so dass HCV die Heteros nicht produktiv infizieren konnte.

Im Gegensatz dazu wurde eine De-novo-Produktion infektiöser viraler Nachkommen etwa zehnmal über dem Hintergrund des Assays in Mond-10-Zellansichten mit Heer und in Mondhandzellen beobachtet, die mit HEP 56 1D-Zellen fusioniert waren, die humane CD 81 exprimierten. Dies deutet darauf hin, dass HCV seinen Replikationszyklus in RetroCars erfolgreich abgeschlossen hat, was die Expression dominanter Restriktionsfaktoren in diesen Zelllinien ausschließt. Sobald Sie es beherrschen, kann das gesamte experimentelle Verfahren in einer Woche durchgeführt werden, wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Hetero-Carryon zur Identifizierung möglicher HV-Restriktionsfaktoren generieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Hepatitis-C-Virus äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie eine hohe Biosicherheit bei der Durchführung dieses Verfahrens immer berücksichtigt werden sollten.