Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen von Restriktionsfaktoren auf den Abschluss des Replikationszyklus des Hepatitis-C-Virus in einer beliebigen Zelllinie zu untersuchen, wobei zwei Methoden verwendet werden, die auf der Heca-Bildung basieren. Für die erste Methode beginnen Sie mit dem Kultivieren menschlicher Leberzellen sowie der Heal A- und der Hep 56 1D-Verpackungszellen. Danach wird Hepatitis-C-Virus-RNA mittels Elektroporation in die Leberzellen transfiziert. Anschließend werden die HCV-replizierenden Zellen mittels Polyethylenglykol mit der jeweiligen Verpackungszelllinie fusioniert. Bei der zweiten Fusionsmethode ist der erste Schritt die Herstellung einer HCV-Stammlösung mit hoher Titerzahl.

Anschließend werden verschiedene Zelllinien gemeinsam kultiviert und die Zellfusion wird durch Transfektion mit dem Glykoprotein des Prototyp-Foamyvirus induziert. Danach werden die Heterokaryone mit HCV infiziert. Nach einer der beiden Methoden zur Heterokaryon-Bildung wird eine fluoreszenzmikroskopische Analyse durchgeführt, um die Fusion zu bestätigen, und die Produktion infektiöser Partikel wird quantifiziert.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur Untersuchung einer großen Anzahl von Zelllinien und primären Zellen hinsichtlich der Expression von HV-spezifischen dominanten Restriktionsfaktoren geeignet ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Spezies-Spezifität und den Nomenklaturen von HCV zu beantworten. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, um das Verständnis der zugrundeliegenden Konzepte der beiden Fusionssysteme vor der Induktion der Zellfusion durch Polyethylenglykol zu erleichtern.

HUH 7,5-Zellen werden gemäß Standardprotokollen mit H-C-V-R-N-A transfiziert und am folgenden Tag 24 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid kultiviert. Gewinnen Sie transfizierte HUH 7,5-Zellen, die das subgenomische Replikon tragen, sowie die HeLa R- und Hep 56 1D-Verpackungszellen. Diese Verpackungszellen wurden so konstruiert, dass sie nach Trypsinisierung HCV-Proteine (Core, E1, E2, p7 und NS2) ektopisch exprimieren. Suspendieren Sie die Zellen in komplettem DMEM-Medium, verdünnen Sie die Zellsuspensionen auf folgende Konzentrationen: HUH 7,5 auf 5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter und HeLa sowie Hep 56 1D auf 2 × 10⁵ Zellen pro Milliliter.

Bereiten Sie als Nächstes eine sechs-Loch-Kulturplatte mit zwei bis drei sterilen Glas-Deckgläsern pro Loch vor. Zur weiteren Analyse der Fusions-Effizienz mischen Sie ein Milliliter transfizierte HUH 7.5-Zellen mit einem Milliliter Verpackungszellen und geben die Suspension in ein Loch der sechs-Loch-Platte; inkubieren Sie 24 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie nach 24 Stunden die Zelldichte.

Die Zelldichte sollte vor der Induktion der Zellfusion zwischen 60 und 80 % Konfluenz liegen, damit die Zellen nahe beieinanderstehen und ihre Zellmembranen fusionieren können. Aspirieren Sie das Medium aus den kokultivierten Zellen und waschen Sie einmal mit einem Milliliter PBS. Geben Sie anschließend vorsichtig 500 Mikroliter vorgewärmtes 40 %iges Polyethylenglykol oder PEG 1.500 hinzu. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS in eine andere Mulde mit Kokulturzellen als Kontrolle hinzu. Inkubieren Sie fünf Minuten bei 37 °C, um die Heterokaryonbildung zu induzieren. Aspirieren Sie das PEG und geben Sie vorsichtig zwei Milliliter PBS hinzu. Nach einer Minute aspirieren Sie das PBS und geben zwei Milliliter frisches PBS hinzu. Waschen Sie 3 bis 5 Mal mit jeweils einem Minute pro Waschgang, um überschüssiges PEG zu entfernen.

Schließlich zwei Milliliter DMEM, komplettes Medium, zu jedem Brunnen hinzufügen und 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. 48 Stunden nach der Fusion. Jedes SNAT sammeln und nach dem Sammeln des Zellkultur-SNAT durch einen 0,45-Mikrometer-Filter filtrieren. Die Fusions-Effizienz kann durch Immunfluoreszenz bestimmt werden. Die Brunnen mit Deckgläsern einmal mit einem Milliliter PBS eine Minute lang waschen.

Fixieren Sie die Zellen mit 600 µL 3 % Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten. Waschen Sie dreimal mit PBS, jeweils eine Minute pro Waschgang; nach dem letzten Waschgang. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig in eine 24-Loch-Platte zu überführen, und permeabilisieren Sie die Zellen mit 500 µL 0,5 % Triton X-100 in PBS für fünf Minuten.

Anschließend dreimal mit PBS waschen und 250 Mikroliter der primären Antikörperlösung je Vertiefung hinzufügen. Verwenden Sie einen anti-NS5a-Antikörper in einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter und einen humanen monoklonalen anti-E2-Antikörper in einer Konzentration von 6,4 Nanogramm pro Milliliter. 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 45 Minuten dreimal mit PBS waschen.

Fügen Sie anschließend 250 Mikroliter sekundäre Antikörper pro Vertiefung hinzu; sekundäre Ziegen-Anti-Maus- oder Ziegen-Anti-Human-IgG-spezifische Antikörper, konjugiert mit Alexa Fluor 546 oder Alexa Fluor 488, werden in einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter verwendet. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach 30 Minuten waschen Sie einmal mit PBS.

Färben Sie anschließend die Zellkerne mit 250 Mikrolitern DPI, das im Verhältnis 1 zu 3000 in PBS verdünnt wurde. Inkubieren Sie eine Minute bei Raumtemperatur im Dunkeln, waschen Sie viermal mit PBS und einmal mit Wasser. Bringen Sie schließlich die Deckgläser umgekehrt auf einen Tropfen Flora-Mount auf einem Objektträger auf und lassen Sie sie im Dunkeln trocknen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, gewinnen und bereiten Sie Einzelzell-Suspensionen der folgenden Zellen vor: die menschliche Leberzelllinie Luna NA, die über keine endogene Expression von CD81 verfügt, He r-Verpackungszellen und Hep56.1D-Zellen, die humanes CD81 stabil exprimieren. Kultivieren Sie Luna-n-Zellen gemeinsam mit He r-Zellen im Verhältnis eins zu eins und mit Hep56.1D-HCD81-Zellen im Verhältnis eins zu zwei, wodurch eine Gesamtzellendichte von 1,5 × 10⁵ Zellen pro 12 erzielt wird.

Am folgenden Tag 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Zellen transient mit einem stark fusogenen PFE-Hüllprotein mittels Lipectomy 2000 gemäß Herstelleranleitung transfectieren. 30 Stunden nach der Transfektion mit dem PFE-Glykoprotein Heterokarionen mit 350 Mikroliter einer zuvor hergestellten Virusstammlösung bei einem MOI von etwa 2,3 infizieren.

Inkubieren Sie 12 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid am folgenden Morgen. Waschen Sie einmal mit PBS und geben Sie je Vertiefung ein Milliliter vollständiges DMEM-Medium hinzu. Inkubieren Sie 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach 48 Stunden gewinnen Sie das Überstandmedium der Heterokaryon-Kulturen, filtrieren das Überstandmedium durch einen 0,45-Mikrometer-Filter. Verwenden Sie anschließend das Überstandmedium, um HUH-7,5-Zellen in 96-Well-Platten, die am Vortag für einen Grenzverdünnungs-Assay ausgesät wurden, zu infizieren. Inkubieren Sie 72 Stunden, bevor Sie die Produktion infektiöser Nachkommenviren quantifizieren.

Das Verfahren zur Visualisierung von Fusionsereignissen muss sechs Stunden vor der Ko-Kultur abgeschlossen werden. Waschen Sie die Anhaftungszellen einmal mit fünf Millilitern PBS und geben Sie dann vier Milliliter der geeigneten DI-Lösung pro 10-Zentimeter-Petrischale hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen danach einmal mit fünf Millilitern PBS für eine Minute und geben Sie dann das komplette DMEM-Medium hinzu. Inkubieren Sie sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie die Zellen ansäen. Geben Sie nach dem Ansäen einen Deckglaser auf jedes Loch der 12-Loch-Platte und transfectieren und färben Sie die Zellen wie zuvor gezeigt. 30 Stunden nach der Transfektion waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter PBS für eine Minute und fixieren Sie sie anschließend mit 250 Mikrolitern 3 %iger Paraformaldehydlösung 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter PBS für eine Minute und färben Sie anschließend nach erneutem Waschen der Zellen einmal mit PBS und einmal mit Wasser mit Dappy für eine Minute. Bringen Sie Deckgläser, Sonnenbrillen, Objektträger in der ersten Herangehensweise an, um die Auswirkung von Restriktionsfaktoren auf den Abschluss des HCV-Replikationszyklus zu untersuchen. In Heterokarionen wurden HUH 7.5-Zellen zunächst vorübergehend mit einem subgenomischen Replikon transfiziert, das ein Luciferase-Transgen und HCV-nichtstrukturelle Proteine exprimierte, und anschließend gemeinsam kultiviert und mit Zelllinien fusioniert, die die HCV-strukturellen Proteine Core und die zugelagerten Proteine exprimieren. Ein repräsentatives Ergebnis ist in dieser Abbildung dargestellt: Zellen oder Immunfärbungen unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen das strukturelle Protein E2 und das nichtstrukturelle Protein NS5A.

Die Bilder in den oberen Feldern zeigen, dass nach Behandlung mit PEG Signale sowohl für MS fünf A als auch für D zwei gleichzeitig im gleichen Zytoplasma nachgewiesen wurden, was auf eine Selbstfusion hinweist. Im Gegensatz dazu zeigt die untere Bildreihe, dass bei mit PBS behandelten Kokulturen keine Fusion induziert wurde. Daher wurde keine Kolokalisation der Signale beobachtet. Um die virale Infektiosität zu quantifizieren, wurden aus den Kokulturen 48 Stunden nach der Fusioninduktion Heterokarionen gesammelt und zur Infektion naiver HUH-7.5-Zellen verwendet, gefolgt von anschließenden Luciferase-Assays.

In diesem Diagramm werden die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten angezeigt. Der graue horizontale Balken stellt die Hintergrundintensität für relative Licht-Einheiten oder RLU dar, die in nicht infizierten HUH 7.5-Zellen bestimmt wurden. Bemerkenswert ist, dass keine Infektiosität in den Kulturüberständen nachgewiesen wurde, wenn HUH 7.5-Replikantenzellen entweder mit naiven Zelllinien fusioniert oder als Kontrolle mit PBS behandelt wurden.

Wenn jedoch die Zellfusion zwischen HUH-7.5-Replicon- und Verpackungszelllinien durch PEG induziert wurde, wurden infektiöse Viruspartikel in die Kulturmedien freigesetzt. Dies zeigt, dass die Virusproduktion die Zellfusion und die Expression viraler Proteine in den Verpackungszelllinien erfordert, und deutet eindrucksvoll darauf hin, dass nicht nur die Heterokaryen der HUH-7.5-humanen Hepatomzellen, sondern auch Heterokaryen mit humanen nicht-lebenden und murinen Leberzellen die Virusfreisetzung ermöglichen, was darauf hindeutet, dass die Assemblierung und Freisetzung in diesen Zelltypen nicht dominant durch mögliche Restriktionsfaktoren gehemmt wird. In einem alternativen Ansatz wurde die somatische Zellfusion durch die Expression eines viralen Glykoproteins nach Kultivierung der Zellen induziert.

Heterokaryen wurden visualisiert, indem separate Zelllinien vor der Kokultivierung und Transfektion mit Zelltrakerfarbstoffen gefärbt wurden. Die Zellen wurden 30 Stunden nach der Transfektion fixiert und mit DAPI gefärbt, und ein repräsentatives Ergebnis ist in dieser Abbildung dargestellt. Die Fusion zweier Zelltypen zeigt sich durch ein Heterokaryon mit homogen im Zytoplasma verteilten Farbstoffen, wie hier veranschaulicht. Im Gegensatz dazu zeigen die Bilder im unteren Panel das Fehlen von Zellen mit doppelt gefärbtem Zytoplasma, was auf das Fehlen einer Zellfusion hinweist.

Dieses abschließende Diagramm zeigt, dass alle HCV-Eintrittsfaktoren nur in heterozygoten Trägern von Luna-N-Zellen mit Hela- oder Hep-56-1D-Zellen exprimiert werden, die menschliches CD81 exprimieren. Hier wurden die Kulturen mit infektiösen HCV-Partikeln infiziert. Die Kulturüberstände wurden 48 Stunden später gesammelt, und die neu produzierte Freisetzung von Partikeln aus den heterozygoten Trägern wurde mittels Grenzverdünnungs-Assay unter Verwendung naiver HUH-7.5-Targetzellen bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten, und der graue horizontale Balken kennzeichnet die Nachweisgrenze des Assays.

A diente als Kontrolle: Lunare N-Zellen wurden mit lunaren N-Zellen fusioniert, was zu sehr geringen Mengen infektiösen HCV führte, die nahe der Nachweisgrenze lagen. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn lunare N-Zellen mit naiven HEP 56 1D-Zellen fusioniert wurden. In beiden Fällen war menschliches CD 81 nicht vorhanden, sodass HCV die Heterokaryen nicht produktiv infizieren konnte.

Im Gegensatz dazu wurde in Lunar-10-Zellen, die mit Heer versucht wurden, und in Lunar-Hand-Zellen, die mit HEP-56-1D-Zellen, die humanes CD81 exprimieren, fusioniert wurden, eine de-novo-Produktion infektiöser viraler Nachkommen beobachtet, die etwa um den Faktor zehn über der Hintergrundrate des Assays lag. Dies zeigt an, dass HCV seinen Replikationszyklus in RetroCars erfolgreich abgeschlossen hat, wodurch die Expression dominanter Restriktionsfaktoren in diesen Zelllinien ausgeschlossen werden kann. Ist der Ablauf einmal beherrscht, kann die gesamte experimentelle Prozedur bei korrekter Durchführung innerhalb einer Woche durchgeführt werden.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Heteroträger für die Identifizierung möglicher HV-Restriktionsfaktoren erzeugt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Hepatitis-C-Virus äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie hohe Biosicherheit stets berücksichtigt werden müssen, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.