Name: A Human Eileiter Modell zur Untersuchung der C trachomatis Infektionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Erfahren Sie, wie ein ex vivo Infektionsmodell des menschlichen Eileiters zur Untersuchung von C. trachomatis-Infektionen etabliert wird. Diese Methode ermöglicht die Analyse chlamydieninduzierter Zellschäden und entzündlicher Prozesse.

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Diese Arbeit wurde von der DFG-Exzellenzcluster &quot;Entzündung an Grenzflächen&quot; (RA-Falls, RA-D) unterstützt. Wir sind dankbar für die ausgezeichnete technische Unterstützung von Kristin Wischnat.

1. Vorbereitung von Chlamydia trachomatis Serovar D Lager <ol><li> Infect konfluente 175 cm 2 Zellkulturflasche mit HeLa-229 Zellen mit 4 ml C trachomatis D in SPG-Puffer. </li><li> Inkubieren Sie für 1 Stunde bei 37 ° C während ständigem Schütteln. </li><li> 20 ml DMEM mit 10% FCS und 240 ul Cycloheximid. </li><li> Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator für 48 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> 5 ml steriler Glasperlen, starkes Schütteln zu lösen und zu zerstören C. trachomatis beherbergen HeLa-229 Zellen. </li><li> Sammle Überstand und fügen Sie eine weitere 5 ml steriler Glasperlen. </li><li> Felsen dreimal für 1 min, alles zu zerstören HeLa-229 Zellen und Freisetzung C. trachomatis. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 1000 RPMI und 4 ° C zu beseitigen Zelltrümmer. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit für die Infektion von 8 bis 10 175 cm 2 Zellkulturflaschen konfluent grown mit HeLa 229-Zellen. </li><li> Inkubieren Sie jede Flasche mit 4 ml SPG-Puffer und 4 ml Überstand aus früheren Infektionen für eine Stunde bei 37 ° C unter ständigem Schütteln. </li><li> Nach einer Stunde mit 15 ml DMEM mit 10% FCS und 230 ul Cycloheximid nach 48 h Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 an. </li><li> 5 ml steriler Glasperlen, schütteln zu lösen und zu zerstören C. trachomatis beherbergen HeLa-229 Zellen. </li><li> Sammeln Sie den Überstand und fügen Sie eine weitere 5 ml steriler Glasperlen. </li><li> Felsen dreimal für 1 min, alles zu zerstören HeLa-229 Zellen und Freisetzung C. trachomatis. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 1000 RPMI bei 4 ° C zu beseitigen Zelltrümmer. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit. </li><li> Füllen Sie 40 ml Überstand in 50 ml Falcon-Röhrchen, Zentrifuge für 99 min mit 11000 RPMI. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und Waschen des Pellets mit 1 ml SPG-Puffer. </li><li> Homogenisieren derPellet in 1 ml SPG und 20 ul Aliquot in einem 1, 5 ml Eppendorf-Röhrchen, Lagerung bei -70 ° C bis zur Verwendung. Biologische Aktivität der hergestellten Stammlösung wurde in einem etablierten HeLa-229 Zellinfektion Modell bestätigt. </li></ol> 2. Preparation of Human Eileiter <ol><li> Shop menschlichen Eileiter (HFT) von Frauen, die sich einer Hysterektomie unmittelbar nach der Operation in RPMI mit 5% FCS ohne Antibiotika in 4 ° C bis Vorbereitung. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Universität zu Lübeck (09-153) genehmigt. Frauen in die Studie eingeschlossen (Alter 34 bis 53) hatte keine Geschichte vor C. trachomatis-Infektion. Gewebe der Eileiter wurde auf peripartalen Sterilisation auf Wunsch der Mutter während der Kaiserschnitte oder während Hysterektomien wegen symptomatischer Uterusmyome in der Lutealphase gesammelt. Alle HFT wurden negativ getestet C. trachomatis durch PCR. </li><li> Präparieren Sie die HFT in eine Petrischale mit RPMI mit5% FCS ohne Antibiotika. Während der gesamten Bearbeitung des Gewebes sollte in Medien ein Austrocknen zu verhindern untergetaucht werden. </li><li> Abgeschnitten und entsorgen Bindegewebe und Gewebe während der Operation zerstört. </li><li> Nach Dissektion öffnen Sie die HFT vorsichtig mit einem kleinen Skalpell. </li><li> Weitere Experimente vorzubereiten Gewebestücke in der Größe von 0,5 cm x 0,5 cm bis 1 cm × 1 cm. </li><li> Zur Infektion Shop HFT Probe in 1 ml RPMI mit 5% FCS ohne Antibiotika. HFT Proben wurden mit 5.5x10 5 IFU (inclusion forming units) von C infiziert trachomatis. </li><li> Inkubieren HFT Muster in 37 ° C, 5% CO 2 und 21% O 2 als auch in 37 ° C, 5% CO 2 und 2% O 2 für 24 Stunden. </li><li> Nach Inkubationszeit die Probe entnehmen und lagern in Monti Fixativ für mindestens drei Tage bei 4 ° C bis SEM / TEM Vorbereitung. </li></ol> 3. Vorbereitung der Proben für TEM-HFT <ol><li> FürTEM entfernen Probe aus Montis Fixiermittel und geschnitten 2 x 2 mm bis 4 x 5 mm große Stücke. Der verbleibende Gewebe für SEM verwendet werden. </li><li> Waschen Stücke mit Natriumcacodylatpuffer, pH 7,35 für 1 h. </li><li> Inkubieren in 1% (w / v) Osmiumtetroxid in Aqua dest. über Nacht. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Osmiumtetroxid durch Waschen 6x5 min in Natriumcacodylatpuffer, pH 7,35. </li><li> Entfernen Wasser durch Inkubation in steigenden Konzentrationen von Ethanol in Wasser (v / v) (30% für 2 h, 40% für 2 h, 50% für 2 h, 60% für 2 h, 70% über Nacht, 80% für 2 h, 90% für 1 h, 95% für 1 h, 100% für 1 h. </li><li> Auswaschen Ethanol für 2 x 15 min in Propylenoxid und anschließend zu einer Mischung von 50% (v / v) frisch hergestellt Araldit (einschließlich aller Komponenten) in Propylencarbonat übertragen und über Nacht inkubieren. </li><li> Transfer zum frisch zubereiteten Araldite (einschließlich aller Komponenten) für mindestens 1 h. </li><li> Transfer zum flachen Einbettformen und füllen mit Araldite. </li><li> Lassen Araldite aushärtenmindestens 48 h bei 60 ° C </li><li> Nach dem Trimmen von Embedded-Probe geschnitten halb Dünnschliffen (700 nm) auf einem Ultramikrotom Verwendung von Glas-Messer oder eine Histo Diamantmesser und Flecken mit Richardson-Färbung. </li><li> Schneiden Sie ultra-dünne Schnitte (ca. 70 nm) mit Hilfe einer Diamant-Messer und Transfer zum Kupfer-Grids (zB 150 quadratischen Maschen). </li><li> Stain ultradünne Schnitte mit 0,5% (w / v) Uranylacetat in Aqua dest. gefolgt von 3% (w / v) Bleicitrat in Aqua dest. in einem automatischen Abschnitt Stainer. Alternativ können Abschnitte manuell durch Verlassen Grids 15 min auf einem gesättigten zentrifugierten Lösung von Uranylacetat in Aqua dest gefärbt werden. gefolgt von 0,3% Bleicitrat (w / v) in Aqua dest. </li></ol> 4. Vorbereitung der Probe HFT für SEM <ol><li> Für SEM entfernen Probe von Monti Fixativ, orientieren mit Epithel nach oben auf einem 1,5 x 1 cm Korkplatte und fixieren Position mit Insekten-Nadeln. </li><li> Übertragen Probe auf Kork zu geeigneten Metall und KörbeWaschen für 30 Minuten in Natriumcacodylat, pH 7,35. </li><li> Entfernen Wasser durch Inkubieren Muster in steigender Konzentration von Aceton / Wasser-Mischungen (v / v) 30% für 6 h, 40% für 6 h, 60% für 8 h, 70% über Nacht, 80% für 2 h, 90% für 2 h und 100% über Nacht (äußerst vorsichtig sein, damit Probe kontinuierlich unter Wasser). </li><li> Transfer zum frischen 100% Aceton und trockenen Probe durch kritische Punkt-Trocknung (Temperatur 40 ° C, Druck 80 bar). </li><li> Entfernen Sie Nadeln, Kork und Leim Probe mit dem Epithel nach oben auf SEM Probenhalter mit einem leitfähigen Kohlenstoff Registerkarte mit leitfähigem Kohlenstoff Zement ausgestattet. Verwenden Sie flüssiges Leitsilber, um die Leitfähigkeit zwischen der Halterung und dem leitfähigen Kohlenstoff-Register zu verbessern. </li><li> Bereiten Sie eine leitende Platin, Gold oder Palladium-Beschichtung der Probe mit einem Sputtergerät. </li></ol> 5. Die Färbung der Semi Dünnschliffen mit Richardson-Färbung <ol><li> Lassen halb dünne Schnitte auf dem Objektträger trocken. </li><li> Stain Abschnitte mit Färbelösung bei 60 ° C für 1-2 min. </li><li> Waschen in Aqua dest. </li><li> Trockene Abschnitte und Deckglas. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Innerhalb des menschlichen Eileiter Infektionsmodell konnten wir Unterschiede in der epitheliale Morphologie zwischen den nicht-infizierten Kontrollen (Abbildung 1) und dem C visualisieren trachomatis - infizierten Röhren (Abbildung 2) unter normoxischen Zustand. Charakteristische morphologische Unterschiede impliziert Pathogen-induzierte Schwellung und Lyse der Eileiter Epithelzellen, die nicht in nicht-infizierten Kontrollen nachgewiesen werden konnte. Mit halb dünne Schnitte und Transmissions-Elektronenmikroskopie konnten wir nachweisen intrazellulären C trachomatis Einbeziehung Bildung in der ex vivo infiziert menschlichen Eileiter Gewebe (Abbildung 3, 5), aber nicht in nicht-infizierten Kontrollen (Abbildung 4). Als Sauerstoff-Konzentrationgen in den weiblichen Genitaltrakt sind bereits unter physiologischen Bedingungen 11, und weiteren Rückgang gering während eines entzündlichen Prozesses untersuchten wir auch unser Modell unter hypoxischen Bedingungen. Vorläufige Ergebnisse zeigen, das Modell ist nützlich, um Chlamydien-Wachstum und die Nachkommen unter verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen zu analysieren. Chlamydien-induzierten Epithelzellschädigung muss von Artefakten, die durch unvorsichtige Handhabung der Zubereitung und der Eileiter vor der Infektion (Abbildung 6) vermittelt werden, getrennt werden. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) eines nicht-infizierten menschlichen Eileiter nach einem Tag Inkubation in Medium-Steuerung (grüner Pfeil zeigt bewimperte Zelle, blauer Pfeil zeigen nicht-bewimperte Zelle). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Rasterelektronenmikroskopie<html> Kopie (SEM) von einem Ex-vivo C. trachomatis infiziert menschlichen Eileiter 1 Tag nach der Infektion (weißer Pfeil rupturierten Inklusion). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Semi Dünnschliffe zeigen typische intrazelluläre Einschlüsse (weiße Pfeile) 1d nach der Infektion des menschlichen Eileiter mit C. trachomatis ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> 4. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) aus einem nicht-infizierten menschlichen Eileiter nach einem Tag Inkubation in Kontrollmedium. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von einem Ex-vivo C. trachomatis infiziert menschlichen Eileiter 1 Tag nach der Infektion (weiße Pfeile markieren Chlamydien-Einschlüsse). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="6" /> Abbildung 6. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) der Eileiter Epithel durch unvorsichtige Herstellung und Handhabung der Proben (weiße Pfeile markieren zerstört Epithelgewebe) beschädigt.

<ol><li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li>
<li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li>
<li>Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeipert%2C+JF+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 349, 2424-2430 (2003).</li>
<li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubal+factor+infertility%2C+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li>
<li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55(2006).</li>
<li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li>
<li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li>
<li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li>
<li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li>
<li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Visualisierung von Pathogen-induzierte Schädigung des infizierten Gewebes ist mühsam und oft beschränkt auf experimentelle Verfahren bei Mäusen. Wir gründeten eine ex-vivo Modell Infektion im menschlichen Eileiter zu analysieren C. trachomatis-Infektionen des oberen weiblichen Genitaltrakt. Durch die Verwendung dieses Verfahrens konnten wir C visualisieren trachomatis - induzierte Schäden an der menschlichen Eileiter Epithel innerhalb eines Tages nach der Infektion. Cellular Schwellung und Lyse waren typisch für morphologische Veränderungen, die in C beobachtet wurden, trachomatis - infizierten Eileiter, aber nicht in nicht-infizierten Kontrollen. TEM-Analysen zeigten, dass Chlamydien einen typischen intrazellulären Entwicklungszyklus implementieren innerhalb infizierten Geweben, welche große Einschlüsse mit Re-differenzierte elementaren Körper, sondern auch kleinere Einschlüsse mit erweiterten Retikularkörper, die Persistenz hinweisen könnten. Allerdings ist die morphologische Bild allein nicht ausreichen, um zwischen repl diskriminierenicating und persistierende Infektionen, die durch reduzierte Stoffwechsel charakterisiert sind und eine erhöhte Resistenz gegen antimikrobielle Substanzen 10. Die Zerstörung des Epithels in infizierten Eileiter ist entweder infolge der Unterbrechung des C. trachomatis - infizierten Epithelzellen nach Abschluss der intrazellulären Entwicklungszyklus und Freisetzung infektiöser elementaren Körper oder die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen 8. Pathogen Gewebeschädigung und Host-induzierte Immunreaktionen gegen C. trachomatis sollen die wichtigsten Faktoren, die zu einem Verlust von epithelialen Zell-Funktion, Fibroblasten-Umbau und schließlich Eileiterunfruchtbarkeit in vivo 8,11 sein. Eine der wichtigsten Grenzen dieses Modells ist die Abwesenheit von Entzündungszellen, die die Analyse der sekundären Effekte behindert auf die ursprüngliche C. trachomatis-Infektion der Eileiter Epithel. Jedoch ist das Modell apchenden an verschiedene Umweltbedingungen (zB Sauerstoffgehalt) und die erste Host-Immunantwort bei akuten C. untersuchen trachomatis-Infektionen 8,9. Weitere Pläne sind, um ein Modell zum Testen von Antibiotika gegen C. etablieren trachomatis in ganzen menschlichen Eileiter und die metabolische Zustände der verschiedenen Entwicklungsstadien im Epithel der Eileiter durch 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet zu charakterisieren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximid </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG-Puffer </td><td> verschiedene </td><td></td><td> siehe Rezept unten </td></tr><tr><td> Monti Fixativ </td><td> verschiedene </td><td></td><td> siehe Rezept unten </td></tr><tr><td> Natriumcacodylatpuffer </td><td> verschiedene </td><td></td><td> siehe Rezept unten </td></tr><tr><td> Richardson-Färbung </td><td> verschiedene </td><td></td><td> siehe Rezept unten </td></tr></tbody></table> Rezepte: 1. SPG-Puffer <ol><li> Fügen Sie 75 g Saccharose. </li><li> In 2,47 g Dinatriumphosphat. </li><li> In 0,36 g Mononatriumphosphat. </li><li> In 0,72 g Glutaminsäure. </li><li> Füllen Sie auf 1 l mit Aqua dest. </li><li> Der pH-Wert auf 7,3. </li></ol> 2. 0,1 M Natriumcacodylat, pH 7,35. <ol><li> In 42,80 g Dimethylarsensäure Natriumsalz. </li><li> In 68,46 g Saccharose. </li><li> Füllen Sie auf 1 l mit Aqua dest. bis 0,2 M Natriumcacodylatpuffer zu erhalten. </li><li> Vor dem Gebrauch verdünnten Lösung mit Aqua dest. auf die gewünschte Konzentration und pH-Einstellung auf 7,35, wenn nötig. </li></ol> 3. Monti Fixativ <ol><li> In 156 ml 0,12 M Natriumcacodylatpuffer. 3,2 25 ml 25% Glutardialdehyd in aqua dest. </li><li> Fügen Sie 19 ml10% Paraformaldehyd in Aqua dest. </li><li> 3 ml 3% CaCl 2 in aqua dest. </li><li> Der pH-Wert auf 7,35 und füllen mit Aqua dest. bis 312 ml Endlösung. </li></ol> 4. Richardson-Färbung <ol><li> Mischen Sie zu gleichen Teilen von 1% Methylenblau in 1% ige wässrige Lösung Borax und 1% Azur II in Aqua dest. </li></ol>

a human eileiter modell zur untersuchung der<em&gt; c trachomatis</em&gt; infektionen

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Genitale Infektionen mit Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) sind die häufigste sexuell übertragene Krankheit bei Frauen weltweit. Ineffiziente Clearance oder Persistenz der Erreger können zu aufsteigenden Infektionen der oberen Genitaltrakt und sollen chronisch entzündliche Schäden an infizierten Geweben verursachen 1,2 führen. Als Folge können schwere klinische Folgen wie Adnexitis (PID), Eileiter und Unfruchtbarkeit auftreten 3,4. Ein Großteil der Forschung mit C. trachomatis in Epithelzelllinien (z. B. HEp-2 Zellen und HeLa-229) oder an Mäusen durchgeführt. Wie bei Zellkultur-Modelle, während sie weder die Physiologie von nativem Gewebe noch die Pathophysiologie von C. trachomatis Genitaltrakt Infektionen in vivo 5. Weitere Einschränkungen sind durch die Tatsache gegeben, dass zentrale Signalkaskaden (zB IFN-γ mediated JAK / STAT-Signalweg), die intrazellulären Chlamydien-Wachstum zu kontrollieren grundsätzlich zwischen Mäusen und Menschen 6,7 unterscheiden. Wir und andere daher ein ganzes Organ Eileiter Modell, um direkte Interaktionen zwischen C untersuchen trachomatis und menschlichen Eileiter Zellen ex vivo 8,9. Zu diesem Zweck wurden humane Eileiter von Frauen, die sich Hysterektomie gesammelt und mit C infiziert trachomatis Serovar D. Innerhalb von 24 h nach Infektion, Probe analysiert, wo mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) auf Chlamydia trachomatis erkennen vermittelt epithelialen Schäden sowie C. trachomatis Einbeziehung Bildung im Eileiter Gewebe.

Wir beschreiben ein<em&gt; Ex-vivo-Infektion</em&gt; Modell zur Visualisierung von direkten Interaktionen von bakteriellen Erregern mit menschlichen Eileiter Zellen. Die ganze Organgewebe Modell wurde gegründet, um zu untersuchen<em&gt; C trachomatis</em&gt; Induzierten Pathologie der weiblichen Eileiter unter &quot;lebensechte&quot; Bedingungen.

A Human Eileiter Modell zur Untersuchung der<em&gt; C trachomatis</em&gt; Infektionen

Infektionen des Genitaltraktes mit Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) sind weltweit die häufigsten sexuell übertragbaren Krankheiten bei Frauen. Ineffiziente ...

Chlamydia trachomatis ist ein gramnegatives, obligat intrazelluläres Bakterium. Es sind verschiedene Chlamydien-Serovare bekannt, die Infektionen des Auges oder des Genitaltrakts verursachen. Infektionen des Genitaltrakts mit Chlamydia trachomatis sind weltweit die häufigste sexuell übertragbare Krankheit.Sie treten mit einer Prävalenz von nahezu 3 Millionen gemeldeten Infektionen in der Europäischen Union zwischen 1990 und 2009 auf. Im Jahr 2009 wurden fast 400.000 Fälle gemeldet. Obwohl die öffentliche Gesundheitsversorgung und die Aufklärung in Bezug auf Sexualität kontinuierlich verbessert werden, wird ein ansteigender Trend bei den Neuerkrankungen durch genitalen Chlamydienbefall festgestellt, der von 70.000 Fällen im Jahr 1990 auf 400.000 Fälle im Jahr 2009 angestiegen ist.75 % aller neuen Infektionen werden bei jungen Menschen im Alter von 15 bis 24 Jahren gemeldet. Klinische Spätfolgen sollen auf einer ineffizienten Eliminierung der Erreger beruhen, was zu aufsteigenden Infektionen von der unteren zur oberen Geschlechtsorgane führen kann und anschließend chronisch-entzündliche Schäden im infizierten Gewebe verursachen kann. 10 bis 30 % der Frauen, die mit Chlamydia trachomatis infiziert sind, entwickeln eine entzündliche Beckenerkrankung (Pelvic Inflammatory Disease, PID), und bis zu 50 % der PID-Fälle werden auf Infektionen mit Chlamydia trachomatis zurückgeführt.Als Konsequenz wird bei 50 % der Patientinnen mit tubärer Unfruchtbarkeit und bei 40 % der Patientinnen mit einer Eileiterschwangerschaft *Chlamydia trachomatis* als auslösende Pathogen verursacht. Bei einer gesunden, nicht infizierten Frau wandert die befruchtete Eizelle durch die Eileiter in die Gebärmutter, wo sie sich bis zur Geburt entwickelt. Bei infizierten Patientinnen kann *Chlamydia* von der unteren Genitalregion in die Eileiter aufsteigen und chronische Entzündungsprozesse auslösen.Es wird angenommen, dass eine durch Krankheitserreger verursachte Schädigung der Epithelzellen und der Verlust zentraler Epithelzellfunktionen letztlich eine Tubenverschlussung verursachen, die zu einer verminderten oder vollständig aufgehobenen Eizelltransport von den Eierstöcken zum Uterus führt. Zu diesem Zweck werden humane Eileiter von Frauen, die eine Hysterektomie durchlaufen, gesammelt und aufbewahrt. Die Eileiter werden präpariert und vorsichtig eröffnet. Je nach experimentellem Aufbau werden sie in kleine Proben geschnitten und nach entsprechenden Zeitpunkten 24 bis 48 Stunden mit infektiösen elementaren Körpern von Chlamydia trachomatis infiziert. Die Proben werden mindestens drei Tage lang mit Montys Fixiermittel fixiert, bis sie weiterverarbeitet werden. Lagern Sie humane Eileiter (HFT) von Frauen, die einer Hysterektomie unterzogen werden, unmittelbar nach der Operation. In RPMI mit 5 % FCS ohne Antibiotika bei vier Grad Celsius lagern, bis die Vorbereitung erfolgt. Die menschliche Eileiterprobe in einer Petrischale mit RPMI mit 5 % FCS ohne Antibiotika unter gesamter Verarbeitung dissezieren. Die Probe sollte mit Medium bedeckt sein, um Austrocknung zu verhindern; Bindegewebe und während der Operation beschädigtes Gewebe abschneiden und entsorgen.Nach der Dissektion öffnen Sie den HFT vorsichtig mit einem kleinen Skalpell. Vermeiden Sie Gewebeschäden durch unsachgemäße Handhabung mit Pinzette und Skalpell. Bereiten Sie kleine Gewebestücke mit einer Größe von fünf mal fünf Millimetern für die Infektion vor, lagern Sie die HFT-Proben in einem Milliliter RPMI, das 5 % FCS ohne Antibiotika enthält, und geben Sie C-Track hinzu.OMAS-Elementarkörper HFT-Proben werden bis zu 48 Stunden bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2 und 20 % O2 in einem normalen Inkubator oder in einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt, weniger als 5 % O2 in einer Hypoxiekammer, inkubiert. Nach den jeweiligen Inkubationszeitpunkten werden die Proben gesammelt und mindestens drei Tage lang bei vier Grad Celsius in Monty's Fixativ aufbewahrt, bis sie für die Präparation für Rasterelektronenmikroskopie oder Transmissionsmikroskopie bereitstehen. Das fixierte Gewebe wird in kleine Stücke geschnitten, gewaschen und über Nacht mit 1 % OsO4 (Osmiumtetroxid) inkubiert.Nach mehreren Wasch- und Trocknungsschritten werden die dehydrierten Proben in frisch hergestelltes Aite überführt und 48 Stunden bei 60 Grad Celsius polymerisiert. Nach dem Einbetten werden semidünne und ultradünne Schnitte angefertigt und jeweils auf Objektträger oder Gitter übertragen. Nach der Färbung können semidünne Schnitte mit einem Lichtmikroskop oder zur Transmissionselektronenmikroskopie untersucht werden.Entnehmen Sie die Probe aus Monty's Fixativ und schneiden Sie sie in Stücke von bis zu zwei mal zwei mal fünf Millimeter. Nach dem Waschen und der Inkubation in Natrium-CCO-Dilutionspuffer sowie Waschen mit Osmiumtetroxid, Dehydrierung und Behandlung mit aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol überführen Sie die Probe in eine Mischung aus 50 % Propylenoxid und Aite über Nacht. Am nächsten Tag überführen Sie die Probe in frisch zubereitetes Aite für mindestens eine Stunde.Anschließend in flache Formen überführen, mit Aite auffüllen und 48 Stunden bei 60 Grad Celsius polymerisieren lassen. Nach dem Beschneiden der eingebetteten Probe schneiden Sie mitteldünne Schnitte von etwa 700 Nanometern oder ultradünne Schnitte von 70 Nanometern mit einem Ultramikrotom, das mit einem Glasskalpell oder bevorzugt mit einem Diamantkalpell ausgestattet ist. Mitteldünne und ultradünne Schnitte dienen der Analyse der Probe mittels Lichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie. Für die Rasterelektronenmikroskopie.Die Proben werden mit der Epitheloberfläche nach oben auf Korkplatten gepinnt, gewaschen und mit ansteigenden Konzentrationen von Aceton dehydriert. Nach dem Trocknen im Gefrierpunkt-Trockner werden die Proben auf einen REM-Probenhalter übertragen und mit Platin, Gold oder Palladium mittels Sputter-Beschichtung beschichtet. Anschließend sind sie zur Analyse in einem Rasterelektronenmikroskop für die Rasterelektronenmikroskopie bereit.Entfernen Sie die Probe aus Montys Fixiermittel und positionieren Sie das Gewebestück mit der Epitheloberfläche nach oben auf einem Korkbrett, fixieren Sie es mit Insektennadeln. Nach dem Waschen mit Natriumcaco-Puffer dilatieren Sie die Probe und trocknen Sie in einem kritischen Punkt-Trockner. Nach dem Übertragen der Probe vom Korkbrett auf einen REM-Probenhalter, tragen Sie eine leitfähige Beschichtung aus Platin, Gold oder Palladium mittels Sputtern auf, übertragen Sie die gesputterte Probe in ein Rasterelektronenmikroskop zur weiteren Analyse.Die unverändert hohe Inzidenz von Lumenerkrankungen bei Frauen und die erheblichen klinischen Folgen aufsteigender Al-Infektionen sind die Begründung für die Intensivierung der Grundlagen- und translationsmedizinischen Forschung in diesem Bereich. Wir nutzten ein zuvor von der Gruppe von St. Perus etabliertes ex vivo-Gewebemodell der menschlichen Eileiter, um chlamydieninduzierte Zellschäden morphologisch zu charakterisieren. Mithilfe dieser Methode können die Bildung intrazellulärer Inklusionen in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet werden, wobei sowohl replizierende als auch persistierende Infektionen sichtbar sind.Jedoch fehlen bisher experimentelle Nachweise für das Vorhandensein persistenter Chlamydien im menschlichen Eileitergewebe, und es bedarf weiterer Analysen hinsichtlich Chlamydien, Nachkommen und Transkriptionsaktivierung von Persistenzgenen. Eine der Hauptbeschränkungen dieses Modells ist das Fehlen entzündlicher Zellen, was die Untersuchung sekundärer Effekte infolge der initialen KLA-glaukomatösen Infektion erschwert. Dennoch erscheint dieses Modell geeignet, Umweltbedingungen wie den Sauerstoffgehalt im Kontext von Schäden an den Eileiter-Epithelzellen sowie die initiale Wirtsabwehrreaktion gegen eine akute glaukomatöse Infektion zu analysieren.Eines der zukünftigen Ziele besteht darin, ein detaillierteres Modell für die MHK-Testung von CTUs im pH-Modell des menschlichen Eileitergewebes zu etablieren und dieses Modell zu nutzen, um die verschiedenen Entwicklungsstadien von CLIs metabolisch mithilfe der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie-Technik genau zu definieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die Eileiter (FT) wird als Alternative vor Ort Ursprungsbezeichnungen für seröse Ovarialkarzinom (SOC) entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Isolierung...

Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Trichuris muris Infektion ist ein Darm-Modell von Th2 Immunität, wo resistente Mäuse generieren eine schützende Th2-Antwort und anfälligen Mäusen erzeugen eine pathologische Th1-Antwort.

Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm

Quelle: O'Brien, V. P., et al., Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert den Einsatz der Rasterelektronenmikroskopie, um bakterielle Besiedlung und Wirts-Pathogen-Interaktionen im Blasenepithel eines vorinfizierten Mausmodells zu visualisieren.

Vorbereitung von Mausblasengewebe zur Visualisierung bakterieller Infektionen

Quelle:Ocean E. Clarke1, Romy A. Dop1, Tom Hasell1, Joanne L. Fothergill1, Daniel R. Neill21Universität Liverpool, 2 Universität DundeeDieses Video zeigt die Verwendung eines 3D-gedruckten, silikonbeschichteten Geräts, das die Innenfläche von Harnkathetern nachahmt, um katheterassoziierte Harnwegsinfektionen zu simulieren.

Ein 3D-gedrucktes, silikonbeschichtetes Gerät zur Modellierung von katheterassoziierten Harnwegsinfektionen

Dieses Video zeigt die Etablierung einer uropathogenen Escherichia coli-Infektion in einer weiblichen Mausblase durch transurethrale Katheterinstillation. Die injizierten Bakterien etablieren erfolgreich eine Harnwegsinfektion in der Blase und bieten eine wertvolle Plattform für die Untersuchung von nosokomialen Erkrankungen im Zusammenhang mit den Harnwegen.

Transurethrale Katheterisierung und bakterielle Inokulation zur Erstellung eines Harnwegsinfektionsmodells bei männlichen Mäusen

Etablierung eines Modells für Harnwegsinfektionen bei weiblichen Mäusen

Das etablierte Modell der transurethrale Katheterisierung von Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Erkrankungen der Blase, einschließlich urinausscheidende Fläche Infektion, aber kann nur bei Frauen durchgeführt werden. Ein neues Modell der männlichen transurethrale Instillation, das hier vorgestellte wird Forschung in einem Gebiet, geprägt von starken klinischen und epidemiologischen Unterschiede zwischen den Geschlechtern zu ermöglichen.

Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Wir erforschten eine Tubal-Zytologie-Methode durch die Probenahme der Eileiter direkt post-chirurgischen Exzision als ein Werkzeug der Eierstockkrebs Früherkennung. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Eileiterzellen aus frisch erhaltenen chirurgischen Proben zu sammeln.

Tubal-Zytologie der Eileiter als vielversprechendes Werkzeug für Eierstockkrebs Früherkennung

Ein Mausmodell der uropathogenen transurethralen E. coli (UPEC) -Inokulation zur Etablierung latenter intrazellulärer Blasenreservoirs und einer anschließenden Blasenexposition gegenüber G. vaginalis zur Induktion einer rezidivierenden UPEC-Harnwegsinfektion ist nachgewiesen. Ebenfalls demonstriert werden die Aufzählung von Bakterien, die Urinzytologie und die In-situ-Blasenfixierung und -verarbeitung für die Rasterelektronenmikroskopie.

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine eintägige Methode zur Isolierung von humanen Eileiterepithelzellen. Isolierte Epithelzellen können in 2-dimensionalen (2D) Kulturen plattiert oder in Einzelzellsuspensionen dissoziiert und in nachgelagerten Experimenten, einschließlich Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, verwendet werden.

Eine effiziente Methode zur Extraktion von Epithelien aus menschlichen Eileitern für Einzelzellanalysen

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Mausmodellen (HGSOC) in vitro und in vivo. Von der Gewinnung von murinen Eileiter-Organoiden über ihre genetische Modifikation zur Rekapitulation der menschlichen HGSOC-Genetik bis hin zu ihrer Einführung in den Eierstockschleimbeutel syngener Mäuse für die in vivo-Entwicklung von Tumoren.

Entwicklung von mausabgeleiteten Organoidlinien aus Epithelzellen des Eileiters für die Modellierung des hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms

Erfahren Sie, wie ein ex vivo Infektionsmodell des menschlichen Eileiters zur Untersuchung von C. trachomatis-Infektionen etabliert wird. Diese Methode ermöglicht die Analyse chlamydieninduzierter Zellschäden und entzündlicher Prozesse.

A Human Eileiter Modell zur Untersuchung der

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