A Human Eileiter Modell zur Untersuchung der

Chlamydia trachomatis ist ein gramnegatives, obligat intrazelluläres Bakterium. Es sind verschiedene Chlamydien-Serovare bekannt, die Infektionen des Auges oder des Genitaltrakts verursachen. Infektionen des Genitaltrakts mit Chlamydia trachomatis sind weltweit die häufigste sexuell übertragbare Krankheit.

Sie treten mit einer Prävalenz von nahezu 3 Millionen gemeldeten Infektionen in der Europäischen Union zwischen 1990 und 2009 auf. Im Jahr 2009 wurden fast 400.000 Fälle gemeldet. Obwohl die öffentliche Gesundheitsversorgung und die Aufklärung in Bezug auf Sexualität kontinuierlich verbessert werden, wird ein ansteigender Trend bei den Neuerkrankungen durch genitalen Chlamydienbefall festgestellt, der von 70.000 Fällen im Jahr 1990 auf 400.000 Fälle im Jahr 2009 angestiegen ist.

75 % aller neuen Infektionen werden bei jungen Menschen im Alter von 15 bis 24 Jahren gemeldet. Klinische Spätfolgen sollen auf einer ineffizienten Eliminierung der Erreger beruhen, was zu aufsteigenden Infektionen von der unteren zur oberen Geschlechtsorgane führen kann und anschließend chronisch-entzündliche Schäden im infizierten Gewebe verursachen kann. 10 bis 30 % der Frauen, die mit Chlamydia trachomatis infiziert sind, entwickeln eine entzündliche Beckenerkrankung (Pelvic Inflammatory Disease, PID), und bis zu 50 % der PID-Fälle werden auf Infektionen mit Chlamydia trachomatis zurückgeführt.

Als Konsequenz wird bei 50 % der Patientinnen mit tubärer Unfruchtbarkeit und bei 40 % der Patientinnen mit einer Eileiterschwangerschaft *Chlamydia trachomatis* als auslösende Pathogen verursacht. Bei einer gesunden, nicht infizierten Frau wandert die befruchtete Eizelle durch die Eileiter in die Gebärmutter, wo sie sich bis zur Geburt entwickelt. Bei infizierten Patientinnen kann *Chlamydia* von der unteren Genitalregion in die Eileiter aufsteigen und chronische Entzündungsprozesse auslösen.

Es wird angenommen, dass eine durch Krankheitserreger verursachte Schädigung der Epithelzellen und der Verlust zentraler Epithelzellfunktionen letztlich eine Tubenverschlussung verursachen, die zu einer verminderten oder vollständig aufgehobenen Eizelltransport von den Eierstöcken zum Uterus führt. Zu diesem Zweck werden humane Eileiter von Frauen, die eine Hysterektomie durchlaufen, gesammelt und aufbewahrt. Die Eileiter werden präpariert und vorsichtig eröffnet.

Je nach experimentellem Aufbau werden sie in kleine Proben geschnitten und nach entsprechenden Zeitpunkten 24 bis 48 Stunden mit infektiösen elementaren Körpern von Chlamydia trachomatis infiziert. Die Proben werden mindestens drei Tage lang mit Montys Fixiermittel fixiert, bis sie weiterverarbeitet werden. Lagern Sie humane Eileiter (HFT) von Frauen, die einer Hysterektomie unterzogen werden, unmittelbar nach der Operation.

In RPMI mit 5 % FCS ohne Antibiotika bei vier Grad Celsius lagern, bis die Vorbereitung erfolgt. Die menschliche Eileiterprobe in einer Petrischale mit RPMI mit 5 % FCS ohne Antibiotika unter gesamter Verarbeitung dissezieren. Die Probe sollte mit Medium bedeckt sein, um Austrocknung zu verhindern; Bindegewebe und während der Operation beschädigtes Gewebe abschneiden und entsorgen.

Nach der Dissektion öffnen Sie den HFT vorsichtig mit einem kleinen Skalpell. Vermeiden Sie Gewebeschäden durch unsachgemäße Handhabung mit Pinzette und Skalpell. Bereiten Sie kleine Gewebestücke mit einer Größe von fünf mal fünf Millimetern für die Infektion vor, lagern Sie die HFT-Proben in einem Milliliter RPMI, das 5 % FCS ohne Antibiotika enthält, und geben Sie C-Track hinzu.

OMAS-Elementarkörper HFT-Proben werden bis zu 48 Stunden bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2 und 20 % O2 in einem normalen Inkubator oder in einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt, weniger als 5 % O2 in einer Hypoxiekammer, inkubiert. Nach den jeweiligen Inkubationszeitpunkten werden die Proben gesammelt und mindestens drei Tage lang bei vier Grad Celsius in Monty's Fixativ aufbewahrt, bis sie für die Präparation für Rasterelektronenmikroskopie oder Transmissionsmikroskopie bereitstehen. Das fixierte Gewebe wird in kleine Stücke geschnitten, gewaschen und über Nacht mit 1 % OsO4 (Osmiumtetroxid) inkubiert.

Nach mehreren Wasch- und Trocknungsschritten werden die dehydrierten Proben in frisch hergestelltes Aite überführt und 48 Stunden bei 60 Grad Celsius polymerisiert. Nach dem Einbetten werden semidünne und ultradünne Schnitte angefertigt und jeweils auf Objektträger oder Gitter übertragen. Nach der Färbung können semidünne Schnitte mit einem Lichtmikroskop oder zur Transmissionselektronenmikroskopie untersucht werden.

Entnehmen Sie die Probe aus Monty's Fixativ und schneiden Sie sie in Stücke von bis zu zwei mal zwei mal fünf Millimeter. Nach dem Waschen und der Inkubation in Natrium-CCO-Dilutionspuffer sowie Waschen mit Osmiumtetroxid, Dehydrierung und Behandlung mit aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol überführen Sie die Probe in eine Mischung aus 50 % Propylenoxid und Aite über Nacht. Am nächsten Tag überführen Sie die Probe in frisch zubereitetes Aite für mindestens eine Stunde.

Anschließend in flache Formen überführen, mit Aite auffüllen und 48 Stunden bei 60 Grad Celsius polymerisieren lassen. Nach dem Beschneiden der eingebetteten Probe schneiden Sie mitteldünne Schnitte von etwa 700 Nanometern oder ultradünne Schnitte von 70 Nanometern mit einem Ultramikrotom, das mit einem Glasskalpell oder bevorzugt mit einem Diamantkalpell ausgestattet ist. Mitteldünne und ultradünne Schnitte dienen der Analyse der Probe mittels Lichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie. Für die Rasterelektronenmikroskopie.

Die Proben werden mit der Epitheloberfläche nach oben auf Korkplatten gepinnt, gewaschen und mit ansteigenden Konzentrationen von Aceton dehydriert. Nach dem Trocknen im Gefrierpunkt-Trockner werden die Proben auf einen REM-Probenhalter übertragen und mit Platin, Gold oder Palladium mittels Sputter-Beschichtung beschichtet. Anschließend sind sie zur Analyse in einem Rasterelektronenmikroskop für die Rasterelektronenmikroskopie bereit.

Entfernen Sie die Probe aus Montys Fixiermittel und positionieren Sie das Gewebestück mit der Epitheloberfläche nach oben auf einem Korkbrett, fixieren Sie es mit Insektennadeln. Nach dem Waschen mit Natriumcaco-Puffer dilatieren Sie die Probe und trocknen Sie in einem kritischen Punkt-Trockner. Nach dem Übertragen der Probe vom Korkbrett auf einen REM-Probenhalter, tragen Sie eine leitfähige Beschichtung aus Platin, Gold oder Palladium mittels Sputtern auf, übertragen Sie die gesputterte Probe in ein Rasterelektronenmikroskop zur weiteren Analyse.

Die unverändert hohe Inzidenz von Lumenerkrankungen bei Frauen und die erheblichen klinischen Folgen aufsteigender Al-Infektionen sind die Begründung für die Intensivierung der Grundlagen- und translationsmedizinischen Forschung in diesem Bereich. Wir nutzten ein zuvor von der Gruppe von St. Perus etabliertes ex vivo-Gewebemodell der menschlichen Eileiter, um chlamydieninduzierte Zellschäden morphologisch zu charakterisieren. Mithilfe dieser Methode können die Bildung intrazellulärer Inklusionen in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet werden, wobei sowohl replizierende als auch persistierende Infektionen sichtbar sind.

Jedoch fehlen bisher experimentelle Nachweise für das Vorhandensein persistenter Chlamydien im menschlichen Eileitergewebe, und es bedarf weiterer Analysen hinsichtlich Chlamydien, Nachkommen und Transkriptionsaktivierung von Persistenzgenen. Eine der Hauptbeschränkungen dieses Modells ist das Fehlen entzündlicher Zellen, was die Untersuchung sekundärer Effekte infolge der initialen KLA-glaukomatösen Infektion erschwert. Dennoch erscheint dieses Modell geeignet, Umweltbedingungen wie den Sauerstoffgehalt im Kontext von Schäden an den Eileiter-Epithelzellen sowie die initiale Wirtsabwehrreaktion gegen eine akute glaukomatöse Infektion zu analysieren.

Eines der zukünftigen Ziele besteht darin, ein detaillierteres Modell für die MHK-Testung von CTUs im pH-Modell des menschlichen Eileitergewebes zu etablieren und dieses Modell zu nutzen, um die verschiedenen Entwicklungsstadien von CLIs metabolisch mithilfe der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie-Technik genau zu definieren.