Name: Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Lernen Sie eine zeit- und kosteneffiziente Methode zur Expression sekretierter Proteine aus HEK 293T-Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Produktion rekombinanter Proteine in nativer Konformation für biomedizinische Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von einer HIV-Behandlung Ontario Network Research Operating Grant (ROG-G645) und der kanadischen Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) zur JEL, und University of Toronto-Stipendien an HA, FCA, und das JDC unterstützt. Die Autoren bedanken sich Marnie Fusco, Dafna Abelson und Dr. Erica Ollmann Saphire am Scripps Research Institute (La Jolla, CA) danken für die Bereitstellung von Zellen, Ebolavirus GP Expressionsvektor und allgemeine Beratung.

<ol><li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li>
<li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li>
<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li>
<li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li>
<li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric%2C+prefusion+Ebola+virus+GP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li>
<li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression%3A+developments+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li>
<li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li>
<li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li>
<li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha%2C+beta%2C+and+gammac+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die 10-Schicht Zellfabriken sind eine effektive Behälter für die Herstellung von Milligramm-Mengen des Proteins. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung der Zellfabrik gegenüber anderen traditionellen Schiffe, wie z. B. Rollerflaschen, Schüttelkolben oder Spinnerflaschen, ist, dass sie bedürfen nicht der Kauf eines zusätzlichen Laborgeräte. Ein Standard-CO 2-Inkubator (~ 6,0 cu. Ft.) wird leicht Platz für vier 10-Schicht Zellfabriken (Abb. 2). Darüber hinaus erfordern diese Gefäße weniger arb...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Die alkalische Phosphatase (BCIP / NBT) flüssiges Substrat-Lösung </td><td> Sigma </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotikum / Antimykotikum, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA Affinitätsmatrix, Klon 3F10 </td><td> Roche </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA murinen mAk, Klon 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturflasche, behandelt T75 cm 2 Gewebekultur </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturflasche, behandelt T225 cm 2 Gewebekultur </td><td> Corning </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten ,6-Well-Gewebekulturplatten behandelt </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Zellfabrik, 10-Schicht CellSTACK </td><td> Corning </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 5K Cassette </td><td> Leichentuch </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 30K Cassette </td><td> Leichentuch </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> Chromatographie-Glassäule, 1.0x10 cm </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacin </td><td> Sigma </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS), hitze-inaktiviert </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE HD Transfektionsreagenz </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice Transfektionsreagenz </td><td> EMD / Merck </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus-IgG F (ab &#39;) 2 alkalischen </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatase-konjugierten Antikörper </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hämagglutinin (HA)-Peptid, 100 mg </td><td> Genscript </td><td> Custom Synthesis </td><td></td></tr><tr><td> (Sequenz: YPYDVPDYA, 95% Reinheit) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Household Bleichmittel (4% w / v Natriumhypochlorit) </td><td> verschiedenen Marken stehen zur Verfügung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF-Membran </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep Plasmid Purification Kit, PureLink Schnellsuche </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> Maxiprep Plasmid Purification Kit, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDisplay Expressionsvektor </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep), 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), sterile 1X </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenimin (PEI), lineares 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> Magermilch trockenes Pulver </td><td> Nelke </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP PES Vakuumfiltrationsgerät, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um, 500 ml Fassungsvermögen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA, 0,05% (w / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> Valproinsäure </td><td> Sigma </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Tangentialströmung System </td><td> Leichentuch </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 befeuchteten Inkubator, Standard 6,0 cu. ft. </td><td> verschiedenen Marken stehen zur Verfügung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektrophorese und Transfer-Einheit </td><td> verschiedenen Marken stehen zur Verfügung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inkubator, 37 ° C </td><td> verschiedenen Marken stehen zur Verfügung </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine bequeme und allgemein expression plattform für die produktion von sekretierten proteinen aus menschlichen zellen

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Rekombinante Proteinexpression in Bakterien, typischerweise E. coli, war die erfolgreichste Strategie zur Milligramm Menge Expression von Proteinen. Jedoch sind prokaryotische Wirte oft keine Bedeutung für die Expression von Mensch, viralen oder eukaryotischen Proteinen aufgrund der Toxizität der ausländischen Makromolekül, Unterschiede in der Proteinfaltung Maschinen oder aufgrund des Fehlens bestimmter Co-oder post-translationale Modifikationen in Bakterien. Expressionssysteme auf Hefe (P. pastoris oder S. cerevisiae) 1,2, Baculovirus-infizierten Insektenzellen (S. frugiperda oder T. ni) Zellen 3 und zellfreien in vitro-Translation-Systeme basieren 2,4 wurden erfolgreich eingesetzt, um Säugetier-Proteine ​​herzustellen. Intuitiv ist die beste Übereinstimmung mit einem Säugetier-Wirt verwenden, um die Produktion von rekombinanten Proteinen, die die entsprechenden post-translationale Modifikationen beinhalten gewährleisten. Eine Reihe von Säugetier-Zelllinien (Human Embryonic KidNey (HEK) 293, haben C V-1 Zellen in O Rigin tragenden S V40 larget T-Antigen (COS), Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), und andere) erfolgreich verwendet, um Milligramm-Mengen einer Reihe von humanen Proteine ​​überexprimieren 5-9. Allerdings sind die Vorteile der Verwendung von Säugerzellen oft durch höhere Kosten, Erfordernis von speziellen Laborgeräten, niedriger Protein-Ausbeuten und lange Zeiten auf stabile Expression-Zelllinien zu entwickeln begegnet. Höherer Ertrag und Produktion von Proteinen schneller, während die Kosten niedrig hält, sind die Hauptfaktoren für viele akademische und kommerzielle Labors. Hier beschreiben wir eine zeit-und kosteneffiziente, zweiteiliges Verfahren zur Expression von sezernierten humanen Proteinen aus adhärenten HEK 293T-Zellen. Dieses System ist in der Lage Mikrogramm bis Milligramm-Mengen an funktionellem Protein aus strukturellen, biophysikalischen und biochemischen Studien. Der erste Teil, mehrere Konstrukte des Gens von Interesse zu erzeugend parallel und transient in HEK 293T-Zellen adhärent in kleinem Maßstab transfiziert. Die Detektion und Analyse von rekombinantem Protein in das Zellkulturmedium sekretiert wird durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper gegen ein Vektor-kodierte Proteinreinigung Tag gerichteten durchgeführt. Anschließend werden geeignete Konstrukte für die großtechnische Produktion Protein transient transfiziert mit Polyethylenimin (PEI) im 10-Schicht Zellfabriken. Proteine ​​in Liter-Volumen von konditioniertem Medium sezerniert werden in handhabbare Mengen unter Verwendung Tangentialflussfiltration, gefolgt von Reinigung durch Anti-HA-Affinitätschromatographie eingeengt. Der Nutzen dieser Plattform wird durch seine Fähigkeit, Milligramm-Mengen von Cytokinen, Cytokinrezeptoren, Zelloberflächenrezeptoren, intrinsische Restriktionsfaktoren und viralen Glykoproteine ​​exprimieren erwiesen. Diese Methode wurde auch erfolgreich bei der Strukturaufklärung der trimeren Ebolavirus Glykoprotein 5,10 verwendet. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Abschließend bietet diese Plattform Benutzerfreundlichkeit, Geschwindigkeit und Skalierbarkeit bei gleichzeitiger Maximierung der Protein Qualität und Funktionalität. Darüber hinaus ist keine zusätzliche Ausrüstung, andere als eine Standard-befeuchteten CO 2-Inkubator, erforderlich. Dieses Verfahren kann schneller auf Systeme mit höherer Komplexität, wie Co-Expression von Protein-Komplexe, Antigenen und Antikörpern, die Produktion von Virus-ähnlichen Partikeln für Impfstoffe oder Herstellung von Adenoviren oder Lentiviren zur Transduktion von schwierigen Zelllinien erweitert werden.

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Die rekombinante Proteinexpression in Bakterien, typischerweise E. coli, war die erfolgreichste Strategie zur Expression von Proteinen in Milligramm-Mengen. ...

In diesem Video beschreiben wir ein zeiteffizientes und kostengünstiges Verfahren zur Expression sekretierter Proteine aus HEC 293T-Zellen. Zunächst wird eine 40 % konfluente HEC 293T-Zellkultur in einer Sechswellplatte vorbereitet. Anschließend wird ein Transfektionsgemisch hergestellt, indem Gene-Juice und Testplasmide in serumfreiem Medium verdünnt werden.Das Transfektionsgemisch wird auf die Zellen aufgebracht, die anschließend bei 37 Grad Celsius inkubiert werden, um die Proteinsynthese zu ermöglichen. Der Nachweis des Proteins im Überstand kann mittels Western Blot durchgeführt werden. Sobald ein geeigneter Konstrukt identifiziert ist, kann das Verfahren mit 10-Schicht-Zellfabriken skaliert werden.Die Zellen werden mittels PEI als Transfektionsreagenz transfiziert. Das Protein kann aus den Kulturüberständen mittels tangentialer Flussfiltration gefolgt von einer Affinitätschromatographie gewonnen werden. Letztendlich ermöglicht diese Plattform die Expression einer breiten Palette von Makromolekülen in Milligramm-Mengen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der auf dem Balo-Virus basierenden Insektenzell-Expression besteht darin, dass eine große Anz

a-convenient-general-expression-platform-for-production-secreted

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein High-Throughput-, automatisierten Plattform zur Herstellung von Zelllinien-Entwicklung für die Herstellung von Protein-Therapeutika wird beschrieben. Implementierung von BD FACS Aria Cell Sorter hat CloneSelect Imager und Tecan Freedom EVO Liquid-Handling-System deutlich erhöht Verarbeitungskapazität in Zelllinien-Entwicklung mit verbesserten Zell-Linie Qualität und hohe Reproduzierbarkeit nachgewiesen.

Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

Das Fünf-Tage-Protokoll beschreibt alle Schritte, Geräte und Zusatzsoftware notwendig für die Schaffung und den Betrieb einer effizienten endogenen Escherichia coli basierten TX-TL zellfreien Expressionssystem von Grund auf neu. Mit Reagenzien, nimmt das Protokoll 8 Stunden oder weniger, um das Setup eine Reaktion, sammeln und Prozessdaten.

Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen.

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Die Expression rekombinanter Proteine durch Säugetiersysteme wird zu einer attraktiven Methode zur Herstellung von Proteinkomplexen für die Strukturbiologie. Hier stellen wir ein einfaches, aber hocheffizientes Expressionssystem vor, bei dem suspensionsgezüchtete Säugetierzellen zur Aufreinigung von Proteinkomplexen für Strukturstudien verwendet werden.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Wir beschreiben hier ein kosteneffizientes Granzym-Expressionssystem mit HEK293T Zellen, das hohe Ausbeuten an reiner, vollständig glykosylierter und enzymatisch aktiver Protease produziert.

Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen

Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle zur Nutzung von Insekten Zell- und Baculovirus Protein Expressionssystems zu produzieren große Mengen an Pflanzeneiweiß abgesondert für Protein Kristallisation. Ein Baculovirus Expressionsvektor wurde entweder mit GP67 oder Insekt Hemolin Signalpeptid für Pflanze Sekretion Proteinexpression in Insektenzellen geändert.

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die Kosten und die notwendige Ausrüstung für E. Colizu generieren-basierte Zellextrakte und in-vitro- Protein Synthesereaktionen innerhalb von 4 Tagen oder weniger zu implementieren. Um die flexiblen Charakter dieser Plattform für breite Anwendungen nutzen zu können, diskutieren wir Reaktionsbedingungen, die angepasst und optimiert werden können.

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

Lernen Sie eine zeit- und kosteneffiziente Methode zur Expression sekretierter Proteine aus HEK 293T-Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Produktion rekombinanter Proteine in nativer Konformation für biomedizinische Forschung.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Weitere Videos entdecken