Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen
31. Juli 2012
In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.
In diesem Video beschreiben wir ein zeit- und kosteneffizientes Verfahren zur Expression von sekretierten Proteinen aus hergestellten Durant HEC 2 9 3 T-Zellen. Zunächst wird eine 40%Cofluent HEC 2 9 3 T Zellkultur in einer Sechs-Welten-Platte hergestellt. Eine Transfektionsmischung wird dann hergestellt, indem Gensaft verdünnt und dann Plasmide in serumfreiem Medium getestet werden.
Das Transfektionsgemisch wird auf den Zellen abgelagert, die dann bei 37 Grad Celsius inkubiert werden, um die Proteinexpression zu ermöglichen. Der Nachweis des Proteins im Supan-Wirkstoff kann durch Western Blot erfolgen. Sobald ein geeignetes Konstrukt identifiziert ist, kann das Verfahren mit Hilfe von 10-Schicht-Zellfabriken skaliert werden.
Die Zellen werden mit PEI als Transfektion transfiziert. Reagenz und Protein können aus den Kulturüberständen mittels Tangentialflussfiltration und anschließender Affinitätschromatographie gewonnen werden. Letztendlich ermöglicht diese Plattform die Expression einer Vielzahl von Makromolekülen in Milligramm-Mengen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der auf dem Balovirus basierenden Insektenzellexpression, besteht darin, dass eine große Anzahl von Konstrukten gescreent und für die Expression skaliert werden kann, wobei die Ergebnisse innerhalb von drei Wochen erzielt werden. Dieses Verfahren wird von Hello Aiden für Shada Zini und Jonathan Cook demonstriert. Drei Doktoranden aus meinem Labor: Beginnen Sie mit der Aussaat von 250.000 HEC 2 9 3 T-Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von einem Milliliter in einer Sechs-Well-Platte, fügen Sie einen Milliliter pro Vertiefung mit 10 % hinzu, FBS, Pentre, ergänzt, DMEM und S swir, die Platte, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
Dann werden die Zellen über Nacht in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubiert. Sobald die Zellen eine Kofluenz von etwa 40 % erreicht haben, ersetzen Sie das SUP Natum durch zwei Milliliter frisches Medium, um die Transfektionsmischung vorzubereiten. Zuerst aliquotieren Sie 90 Mikroliter serumfreies DMEM in einem Eend-Orph-Röhrchen.
Dann fügen Sie drei Mikroliter Gensaft hinzu, das Transfektionsreagenz, mischen Sie vorsichtig den Inhalt des Röhrchens und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie als Nächstes 10 Mikroliter eines Vorrats von 100 Nanogramm pro Mikroliter des gereinigten Plasmids der Mini-Vorbereitung, DNA, hinzu. Zu transfizieren.
Mischen Sie den Inhalt der Tube und lassen Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Um die Transfektion durchzuführen, scheiden Sie das Gemisch auf die HEC 2 9 3 T-Zellen ab. Tropfen für Tropfen die Platte vorsichtig aufquellen, um die Transfektionsmischung gleichmäßig zu verteilen.
Dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. 24 Stunden später geben Sie jeweils einen Milliliter frisches Medium in die Vertiefung und inkubieren weitere 48 Stunden. Drei Tage nach der Transfektion, ernten Sie das Supinat und bestimmen Sie die Expressionsniveaus des interessierenden Proteins durch Western Blot.
Sobald ein geeignetes Konstrukt identifiziert wurde, kann das Transfektionsverfahren skaliert werden. Befüllen Sie eine Zellfabrik mit 10 Schichtzellenfabriken mit 1,2 Litern DMEM, ergänzt mit 5 % FBS. Fügen Sie dann 200 Millionen HEC 2 9 3 T-Zellen hinzu und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig auf alle Schichten.
Vier 225 Zentimeter große quadratische T-Zellkulturflaschen, die auf 100 % Co-Fluenz gezüchtet wurden, enthalten etwa 200 Millionen Zellen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Das Transfektionsgemisch wird in einem Kolben T 75 hergestellt, indem 840 Mikrogramm DNA in 84 Millilitern sterilem Kolben einmal verdünnt werden. Pbs.
Fügen Sie 2,5 Milliliter eines Milligramms pro Milliliter, Polyethylen-Ionenlösung oder PEI hinzu und inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Lösung sollte trüb werden. Gießen Sie dann die Transfektionsmischung langsam in die Zellfabrik und verteilen Sie sie gründlich.
Gesamt-Schichten. Valproinsäure in einer Endkonzentration von vier Millimolar zugeben. Dies erhöht die Expressionsausbeute, sobald die Transfektionsmischung hinzugefügt wurde.
Inkubieren Sie die Kultur vier Tage lang bei 37 Grad Celsius, um die Proteinexpression zu ermöglichen. Ernten Sie das Medium vier Tage nach der Transfektion und reinigen Sie die Zellfabrik sofort für die Wiederverwendung, zentrifugieren Sie das gesammelte Medium 30 Minuten lang bei 6.000 g bei vier Grad Celsius und filtrieren Sie es durch einen 0,22-Mikron-Vakuumfilterapparat, um Feinstaub zu entfernen. Verwenden Sie dann das centra mate Tangentialfluss-Filtrationssystem, um den Überstand auf 75 Milliliter zu konzentrieren.
Sobald der Überstand konzentriert ist, kann das interessierende Protein durch Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. In diesem Experiment reinigten wir die HA-gebundenen Untereinheiten der extrazellulären Domäne der humanen AAL-beiden Rezeptoren mit dem hier beschriebenen großskaligen System, gefolgt von einer hochaffinen Anti-THA-Chromatographie. Wie in dieser Analyse der kumasi-gefärbten SDS-Seite gezeigt.
Die extrazellulären Domänen des Interleukins, der beiden Rezeptor-Alpha- und -Gamma-Untereinheiten, wandern bei den Molekulargewichten von 40 Kilodalton und 46 Kilodalton. Die Heterogenität der EnLink-Glykane, die auf IL zwei R alpha und IL zwei R gamma vorhanden waren, verursachte eine Bandenverbreiterung auf dem SDS-Seitengel. Die höhere Molekulargewichtsbande stellt eine Kontamination von BSA dar.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine aus menschlichen Zellkulturen mit 10-Schicht-Zellfabriken exprimiert werden. Vergessen Sie nicht, dass HC 2 93 T-Zellen als biologisch gefährlich gelten und auf Biosicherheitsstufe zwei gehandhabt werden sollten. Bitte tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzkleidung, und Oberflächen sollten gemäß den institutionellen und behördlichen Richtlinien desinfiziert werden.
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein zeit- und kostensparendes Verfahren zur Expression sezernierter Proteine unter Verwendung menschlicher embryonaler Nieren-293T-Zellen. Die Methode ermöglicht die Produktion rekombinanter Proteine in nativen Konformationen, was für verschiedene Forschungsanwendungen unerlässlich ist.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Proteinexpression
- Rekombinante Proteine
- Zellkulturtechniken
Hintergrund
- Rekombinante Proteine sind entscheidend für strukturelle und funktionelle Studien.
- Menschliche embryonale Nieren-293T-Zellen werden häufig für die Proteinproduktion verwendet.
- Effiziente Proteinexpressionsmethoden können Forschung und therapeutische Entwicklung fördern.
- Western Blotting ist eine gängige Technik zur Proteindetektion.
Zweck der Studie
- Beschreibung eines skalierbaren Proteinexpressionssystems.
- Bereitstellung eines detaillierten Protokolls zur Produktion sezernierter Proteine.
- Erleichterung der Identifizierung geeigneter Konstrukte für weitere Forschung.
Verwendete Methoden
- Präparation einer 40% konfluenten 293T-Zellkultur in einer Sechs-Well-Platte.
- Herstellung einer Transfektionsmischung unter Verwendung serumfreien Mediums.
- Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius für die Proteinexpression.
- Nachweis von Proteinen im Überstand mittels Western Blot.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Expression sezernierter Proteine aus 293T-Zellen.
- Identifizierung geeigneter Konstrukte für die Proteinproduktion.
- Skalierbarkeit des Verfahrens unter Verwendung von 10-Schichten-Zellfabriken.
- Demonstration eines kosteneffektiven Ansatzes für die Produktion rekombinanter Proteine.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode ist effizient für die Produktion rekombinanter Proteine.
- Dieser Ansatz kann für größere Produktionsbedürfnisse skaliert werden.
- Western Blotting ist effektiv zur Bestätigung der Proteinexpression.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Efficient production of secreted human proteins in native conformations is a critical inflection point for biopharma discovery and preclinical research. This HEK 293T-based platform enables rapid, scalable, and cost-effective generation of milligram quantities of functional proteins, supporting structural, biophysical, and biochemical studies. The approach directly addresses the need for mammalian post-translational modifications and accelerates construct screening and scale-up for diverse therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid screening of multiple constructs to identify optimal protein expression candidates.
- Supports functional validation of secreted proteins with native post-translational modifications.
- Facilitates pathway interrogation and mechanistic de-risking for human and viral targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated, scalable protein production for downstream assay development.
- Delivers reproducible, quantitative protein yields suitable for standardization across platforms.
- Enables reliable supply of proteins for compound screening and binding studies.
Translational & Preclinical Research
- Supports production of disease-relevant proteins, including cytokines and viral glycoproteins, for translational studies.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by ensuring protein quality and functionality.
- Reduces risk of non-human glycosylation artifacts in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This platform integrates from early construct screening through large-scale protein production, bridging discovery biology and preclinical research.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and construct triage by enabling parallel expression and detection via western blot.
- Screening: Delivers assay-ready proteins with scalable yields and consistent quality.
- Analytics: Provides quantitative outputs for comparing construct performance and optimizing purification.
- Translational Research: Aligns protein production with disease-relevant systems and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a generalizable workflow adaptable to diverse protein classes and research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines protein production with minimal specialized equipment and rapid turnaround.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and improves capital efficiency in early R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing high-quality reagents for multiple programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and protein purification techniques.
- Needs access to standard CO2 incubators and tangential flow filtration systems for scale-up.
- Demands cross-team standardization of construct design and detection assays.
- Adaptable to co-expression, complex protein assemblies, and viral vector production.
- Biohazard handling and biosafety level 2 precautions are necessary for HEK 293T cells.
