RNA Extraktion aus Neuroprecursor Zellen unter Verwendung des Bio-Rad Total RNA Kit

Hallo, ich bin Josh Sh, Doktorand im Labor von Dr. Ed Maki an der University of California Irvine. Ich zeige Ihnen, wie man RNA aus neuronalen Vorläuferzellen mit dem BioRad to RNA Mini-Kit extrahiert. Ich verwende dieses Kit bereits seit mehreren Jahren in diesem Labor und erhalte stets konsistente Ergebnisse mit hohen Ausbeuten.

Die Zellen, die wir verwenden, sind Eton-und-ein-Halb-Neuro-Vorläuferzellen, die akut aus embryonalen Kortizes isoliert wurden, und wir geben sie normalerweise in eine 24-Well-Zellkulturplatte, die mit PD-L und Laminin beschichtet ist, und ich säte sie mit je hunderttausend Zellen pro Vertiefung aus. Bevor ich beginne, muss ich Ihnen sagen, dass Sie an einer festgelegten Arbeitsfläche arbeiten sollten, die Sie für Ihre RNA-Arbeiten nutzen. Zunächst ist sicherzustellen, dass Ihre RNA-Arbeitsfläche sauber ist.

Die geeignete Methode, um die Arbeitsfläche zu reinigen, besteht darin, dieses RNA-Zap zu verwenden. Im Grunde eliminiert es jegliche RNA, da die Substanz die RNA abbaut. Eine weitere Maßnahme ist, stets Handschuhe zu tragen, wenn Sie die Extraktion durchführen, da Ihre Haut voller RNA ist.

Es ist also strengstens verboten. Okay, was ich hier habe, ist das BioRad Total-RA-Mini-Kit. Ich habe den Inhalt herausgenommen, damit ich Ihnen zeigen kann, was enthalten ist.

Als Erstes haben wir eine X-dep-C-behandelte PBS-Lösung und 70 % DEP-behandelten Ethanol. Außerdem liegt eine Gesamt-RNA-Elutionslösung vor, der Dan-me in Großbuchstaben enthaltender Ethanol zugesetzt wurde. Als Zweites folgt eine Waschpufferlösung mit geringer Stringenz, der 100 % Ethanol zugesetzt wurde, die Waschpufferlösung mit hoher Stringenz, die DNA-Verdünnungslösung sowie die DNA selbst und die Gesamt-RNA-Elution.

So lösen Sie die Probe in dem 70-Grad-Wärmeblock. Die weiteren benötigten Materialien sind 1,5-ml-Captuben. Diese dürfen keine DNAse oder RNase enthalten; stellen Sie daher sicher, dass Sie Röhrchen verwenden, die frei von diesen Substanzen sind.

Und wir haben zwei 2-ml-Röhrchen ohne Verschluss. Und das Wichtigste von allem sind die RNA-Säulen selbst. Ohne diese können Sie keine RNA-Isolierungen durchführen.

Um diese Säulen zusammenzubauen, benötigen Sie also die RNA-Säule und die beiden milchigen kapillarlosen Säulchen und setzen Sie sie einfach so zusammen. Dann sollten Sie bereit sein, loszulegen. Okay, und das Letzte, was wir immer benötigen, sind diese Zellen. Die hier verwendeten Zellen sind Eton- und eineinhalb-neuronale Präkernzellen.

Sie wurden akut aus embryonalen Kortizes isoliert. Sie wurden einige Tage in Temperaturmedien kultiviert. Ich habe die Zellen aus dem 37-Grad-Inkubator entnommen.

Dieses Protokoll ist spezifisch für Anheftungszellen. Diese Zellen wurden in mit Gewebekultur behandelten 0,4-Loch-Platten kultiviert, die mit PDL und Laminat beschichtet sind. Nun nehme ich einen Vakuumschlauch und werde das Medium absaugen.

Und der nächste Schritt besteht darin, etwa 500 Mikroliter des dep SEA PBS hinzuzufügen. Und erneut möchten wir Filtertips verwenden. Das PBS spült im Wesentlichen das Medium ab.

Sie möchten also keine Bestandteile des Mediums in Ihre RNA-Säule bringen oder Ihre RNA-Extraktion beeinträchtigen, da Sie sonst keine guten Ausbeuten erhalten. Ich werde das PBS nun schnell abpipettieren, da die neuronalen Stammzellen das PBS nicht vertragen. Anschließend gebe ich 350 Mikroliter Puffer zur Zelllyse zu jedem Ansatz hinzu.

Noch einmal: Stellen Sie sicher, dass sich beta mein absolutes Ethanol im Lizispuffer befindet. Nun pipettiere ich den Lizispuffer 15-mal auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellen lysiert sind, damit wir die RNA-Inhalte gewinnen können.

Jetzt werde ich 70 %iges Deethylethanol in jede Vertiefung geben. Nachdem ich 350 Mikroliter dieses 70 %igen Deethylethanol hinzugefügt habe, werde ich jede Vertiefung 10-mal auf- und abpipettiert. Ich habe jede Vertiefung 10-mal auf- und abpipettiert. Nun stelle ich meinen Pipettierer auf über 700 Mikroliter ein, da das Gesamtvolumen jeder Vertiefung 700 Mikroliter beträgt.

Dann, nachdem ich die Substanz aufgenommen habe, die über 700 Mikroliter beträgt, werde ich sie auf eine RNA-Säule übertragen. Nachdem ich den Inhalt der Säule hinzugefügt habe, gehe ich zum Zentrifugieren und zentrifugiere 30 Sekunden bei maximaler Drehzahl. Nach dem ersten 32-Sekunden-Zentrifugierschritt des Lysats werde ich das Filtrat verwerfen, indem ich es in einen leeren Behälter entsorge.

Oder was manche andere Leute tun, ist, einen Rückspülschlauch zu verwenden und das Filtrat abzusaugen. Als Nächstes geben Sie 700 Mikroliter Puffer für die Wäsche unter niedriger Stringenz hinzu. Und auch hier stellen Sie sicher, dass Sie Ethanol hinzufügen.

Jetzt werde ich es 30 Sekunden lang bei voller Geschwindigkeit zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren des Pufferlösungs-Filters mit niedriger Stringenz werde ich das Filtrat entsorgen. Verstanden? Danach werde ich die D, die DNA-Lösung, vorbereiten.

Also fügen Sie für jede Probe fünf µL DNA hinzu. Für uns haben wir die DNA tatsächlich bereits aliquotiert, bevor wir damit beginnen, da es sich erneut um ein Enzym handelt.

Es ist besser, sie als Aliquote zu lagern. Wenn Sie sie als Ganzes lagern, zerstören die Einfrier- und Auftauvorgänge die enzymatische Aktivität. Nachdem ich also fünf Mikroliter DNA hinzugefügt habe, werde ich sie mit 75 Mikrolitern der DNA-Verdünnungslösung verdünnen.

Nachdem Sie dies hinzugefügt haben, beträgt das Gesamtvolumen 80 µL DNA-Lösung. Nun werde ich 80 µL der DNA-Lösung zu jeder Probe hinzufügen. Achten Sie darauf, dass die Lösung vollständig auf die Membran der Säule gelangt.

Sie möchten, dass die DNA-Lösung die Membran durchtränkt. Dadurch entfernen Sie die DNA und erhöhen Ihre RNA-Ausbeute.

Nachdem Sie die DNA hinzugefügt haben, lassen Sie die Säule 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen, damit das Enzym seine Wirkung entfalten kann. Und erneut inkubieren Sie sie für 15 Minuten. In Ordnung, der Timer ist abgelaufen.

Nach der 15-minütigen Inkubation werde ich die DNA-Proben zur Zentrifugation bringen und 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Gut, nach dem 30-sekündigen Zentrifugieren, um die DNA zu pelletieren, werde ich das Filtrat verwerfen. Nun werde ich 700 µL eines Pufferlösungsreagenz mit hoher Stringenz hinzufügen, um eventuell verbliebene Restmengen an DNA auszuwaschen.

Und danach, nachdem ich das hinzugefügt habe, werde ich erneut für weitere 30 Sekunden in der Zentrifuge zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren werde ich den Filtrat mit hoher Stringenz entfernen und ihn einfach in einen Behälter entsorgen. Anschließend werden wir 700 Mikroliter des Puffers mit niedriger Stringenz hinzufügen.

Dieses Mal werde ich es eine Minute lang mit voller Geschwindigkeit in der Centri Beach zentrifugieren. Nach der ersten Einminuten-Waschung mit niedriger Stringenz werde ich das Filtrat verwerfen. Dieses Mal füge ich nichts hinzu, sondern zentrifugiere erneut zwei Minuten lang, um den restlichen Puffer mit niedriger Stringenz vollständig zu entfernen, da dieser Ethanol enthält, der die RNA-Ausbeute verringern würde.

Jetzt hole ich den Elutionspuffer aus dem 70-Grad-Wärmeprotokoll. Zur Erinnerung: Stellen Sie vor Beginn des Experiments sicher, dass der Elutionspuffer auf 70 Grad erwärmt ist, und halten Sie ihn warm, um die Effizienz Ihrer RNA-Ausbeute zu erhöhen. Ich habe die Säulen vorbereitet.

Sie wurden aus der Zentrifuge genommen. Als nächster Schritt nehmen sie die Säulen heraus. Okay, ich werde die Kapillar-Röhrchen entsorgen und sie in diese Kat-Röhrchen überführen.

Sie werden 50 µL des Lucian-Puffers zu jeder Säule hinzugeben. Achten Sie darauf, dass der Elutionspuffer auf die Membran gelangt und diese gut durchtränkt. Andernfalls erhalten Sie keine hohe RNA-Ausbeute.

Jetzt lassen Sie die Säule eine oder zwei Minuten stehen, um sicherzustellen, dass die Lösung die Membran der Säule vollständig durchdringt. Gut, jetzt ist eine Minute vergangen. Nun kann ich sie in die Zentrifuge geben.

Jetzt werde ich die Säulen in die Zentrifuge geben. Ich werde sie eine Minute lang bei voller Geschwindigkeit zentrifugieren. Dies ist der letzte Zentrifugierungsschritt, bei dem Sie das Elutionsprodukt oder die RNA in diese Sammelgefäße sammeln.

Jetzt, nach der letzten Zentrifugation, nehmen Sie Ihren Inhalt heraus, entfernen Sie die Säule, können Sie sie entsorgen, schließen Sie das Röhrchen und können sie nun bei minus 80 lagern. Später können Sie damit beliebige weitere Schritte durchführen. Soeben habe ich RNA mit dem BioRad-RNA-Kit extrahiert. Nun werde ich die Konzentration der extrahierten RNA bestimmen, beziehungsweise das OD mittels eines Spektrophotometers ablesen.

Das werde ich Ihnen nun zeigen. Zunächst müssen wir eine Verdünnungslösung herstellen. Es handelt sich um eine Verdünnung im Verhältnis eins zu fünf.

Wir werden unsere RNA mit Molekularbiologie-gradigem, gefiltertem Wasser mischen. Zuerst bereite ich eine Blindprobe vor. Dazu entnehme ich zwei Mikroliter unserer Elutionslösung, die wir ursprünglich zum Eluieren der RNA verwendet haben, und gebe acht Mikroliter des Molekularwassers hinzu. In Ordnung?

Das ist also unsere Blindprobe. Nun werde ich die Probe vorbereiten. Es werden zwei Mikroliter sein, unsere RNA von Interesse.

Wir werden erneut acht Mikroliter MQ-Wasser hinzufügen. Dadurch ergibt sich eine Verdünnung im Verhältnis 1:5, richtig? Ich habe hier diese Glaspipette, in die ich meine Proben geben werde, und ich werde diese Pipette in das Spektrometer laden.

Messen wir das also. Bevor ich die OD der RNA-Proben messe, muss ich mein Küvetten reinigen. Hier ist also erneut die Glaszelle.

Sie sollten niemals die Vorderseite davon anfassen. Andernfalls hinterlassen Sie Fingerabdrücke, und ich erhalte falsche Messwerte. Als Erstes werde ich daher den Glasstab mit doppelt destilliertem Wasser reinigen.

Dann nehme ich einen Vakuumschlauch und sauge das Wasser ab. Nach dieser Spülung spüle ich mit 95 % Ethanol und verwende anschließend erneut einen Vakuumschlauch, um den Ethanol zu entfernen.

Jetzt bin ich bereit, meine Blindprobe aufzuladen. Wir benötigen zuerst die Blindprobe, um unsere Messwerte zu normalisieren. Daher entnehme ich 10 Mikroliter der soeben hergestellten Mischung.

Ich werde unsere Lösung nun mehrmals auf- und abpipettieren, um eine homogene Mischung zu erhalten. Anschließend führe ich sie dem Spektrumspeedometer zu. Dies ist die Ultra Spec 3, 100-Proben-Maschine, mit der wir die RNA-Konzentration messen werden.

Öffnen Sie also die Maschine und geben Sie sie in einen dieser Halter ein. Wir werden die Programme so manipulieren, dass nur RNA gelesen wird. Okay, erneut haben wir eine Verdünnung im Verhältnis 1:5 durchgeführt.

Wir möchten also unseren Verdünnungsfaktor auf fünf einstellen. Okay, ich bin bereit. Ich werde nun „Start“ drücken, um die Blindprobe zu erfassen.

In Ordnung, es ist jetzt auf Null gestellt. Jetzt können wir unsere Probe messen. Ich werde daher das Glas mit der Wägekugel herausnehmen.

Ich werde den Inhalt der Leerprobe erneut absaugen. Danach werde ich sie mit doppelt destilliertem Wasser spülen und anschließend mit 95 %igem Ethanol spülen.

Jetzt bin ich bereit, 10 Mikroliter unserer Probe der Untersuchung einzuladen. Stellen Sie also erneut sicher, dass Sie Ihre Probe gut gemischt haben. Füllen Sie sie in das Glasvial ein.

Jetzt sind wir bereit zur Messung. Nach der OD-Messung sollte ein guter Ertrag eine RNA-Absorptionsrate von 260 zu 280 von etwa 2 aufweisen. Der Ertrag beträgt etwa 144 Mikrogramm pro Milliliter.

Obwohl das Gerät 72 Mikrogramm pro Milliliter anzeigt, müssen wir diesen Wert aufgrund der halben Länge in unseren Vets verdoppeln, zwei Zentimeter haben Ihnen gezeigt, wie man RNA aus neurogenen Vorläuferzellen extrahiert. Wieder verwenden wir das Total Mini RNA-Kit von BioRad. Wir haben andere Kits ausprobiert, und dies ist das beste Kit, das wir basierend auf seiner Effizienz verwenden.

Das liefert RNA in hoher Qualität. Wenn Sie dieses Kit verwenden, erhalten Sie dieselben hochwertigen Ergebnisse, die wir stets erzielen.