Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die neuronale Aktivität der Maus mittels Mangan-verstärkter MRT abzubilden. Dies geschieht durch einseitige Stimulation der Vibrissen und Abbildung der neuronalen Antwort im kontralateralen Barrel-Feld-Kortex. Der erste Schritt ist der Aufbau und die Kalibrierung des Ultraschallsystems, das aus einem unkonzentrierten Ultraschallwandler besteht, der von einem Signalgenerator und Verstärker für das Experiment angesteuert wird.

Nach einer intraperitonealen Injektion von Mangan wird die Blut-Hirn-Schranke mittels Ultraschall und Mikrobläschen geöffnet, wodurch das Mangan in das Hirnparenchym eindringen kann. Anschließend wird das Mausmodell einem neuronalen Stimulationsprotokoll unterzogen, das zu einer stärkeren Anreicherung von Mangan in den aktiveren Hirnregionen führt. Schließlich werden MRT-Bilder aufgenommen, die regionale Unterschiede in der T1-gewichteten MR-Bildintensität aufgrund unterschiedlicher Mangananreicherung im Gehirn zeigen.

In der Neurowissenschaft ist die Maus das dominierende Modellsystem zur Untersuchung der genetischen und molekularen Grundlagen der Gehirnentwicklung und von Erkrankungen. Diese Technik stellt ein nicht-invasives Werkzeug zur Abbildung neuronaler Aktivität in diesen Mausmodellen bereit. Die ultraschallinduzierte Störung der Blut-Hirn-Schranke kann nicht nur zur gezielten Abgabe von Mangan in das Hirnparenchym für die funktionelle Neurobildgebung genutzt werden, sondern auch zur Verabreichung einer Vielzahl anderer Substanzen in das Hirnparenchym, einschließlich gadoliniumbasierter Kontrastmittel oder Chemotherapeutika.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten bei der Kalibrierung des Ultraschallsystems und beim Umgang mit den Mikro-Rührstäbchen. Die Durchführung des Verfahrens wird von jeweils einem der Techniker in unserem Labor demonstriert. Das Ultraschallsystem besteht aus einem Ultraschallwandler mit einem einzigen Element, dessen Durchmesser groß genug ist, um das Maushirn abzudecken, sowie einer Mittenfrequenz im Bereich von zwei Megahertz.

Der Wandler wird von einem Signalgenerator und einem 50 Dezibel leistungsstarken Verstärker angesteuert, die die Ultraschallimpulssequenz erzeugten. Kalibrieren Sie das Ultraschallsystem in einem Wassertank. Platzieren Sie das Hydrophon am Boden des Tanks und positionieren Sie den Wandler mithilfe eines Dreiachs-Translationsstages darüber.

Danach wird eine kurze Abfolge sinusförmiger Pulse auf den Wandler angewendet und der Probentisch justiert, um die maximale Antwort zu finden, die sich in der Mitte des Ultraschallstrahls und im natürlichen Fokus des Wandlers befinden sollte. Anschließend werden mehrere Schalldruckmessungen über einen Bereich von Eingangsspannungen hinweg durchgeführt und eine lineare Regression verwendet, um den Zusammenhang zwischen Eingangsspannung und Schalldruck abzuschätzen. Ermitteln Sie die Pulsamplitude, die einen maximalen negativen Schalldruck von etwa 0,36 Megapascal erzeugt.

In diesem Schritt betäuben Sie das Tier, indem Sie das Isofluran über die Nasenkonneke zuführen. Die Nasenkonnek-Apparatur sollte den Kopf des Tieres jedes Mal präzise und zuverlässig in derselben Position fixieren, während unser Gerät den Schädel in flacher Position hält. Zur Überwachung der Atemfrequenz und Dosierung des Anästhetikums dient ein pneumatisches Kissen, um eine Atemfrequenz zwischen 85 und 125 Atemzügen pro Minute aufrechtzuerhalten. Gleichzeitig überwachen Sie die Körpertemperatur des Tieres mit einer Rektalsonde und halten die Körpertemperatur mittels Wärmelampe oder Warmluftzufuhr konstant.

Danach wird ein Venenkatheter in die Schwanzvene und ein intraperitonealer Katheter beim Tier platziert. Im nächsten Schritt wird das Haar abrasiert, um eine einseitige Stimulation des N. facialis zu demonstrieren und die neuronale Antwort im kontralateralen Barrel-Kortex abzubilden. Durchtrennen Sie den kontralateralen N. facialis so nah wie möglich an der Hautoberfläche, ohne den Follikel oder die umgebende Haut zu reizen.

Überführen Sie dann das Tier zum Ultraschallsystem und geben Sie Ultraschallgel auf die Kopfhaut, wobei eine dünne Kunststofffolie, die eine Wassersäule enthält, auf den Kopf gelegt wird. Greifen Sie mit einem Wattestäbchen durch die Wassersäule, um eingeschlossene Luftblasen im Ultraschallgel zu entfernen. Positionieren Sie dann den Ultraschallwandler im Wasser in seiner natürlichen Fokusdistanz direkt über dem Maushirn und streichen Sie mit dem Finger über den Wandler, um eventuelle eingeschlossene Luftblasen zu beseitigen.

Anschließend die Perrin-Lipidmikrosphären herstellen, indem das Fläschchen während der Arbeit 45 Sekunden lang im Agitator geschüttelt wird. Das Fläschchen bei Raumtemperatur aufbewahren, nach der letzten Verwendung am Tag jedoch vor der ersten Verwendung an den folgenden Tagen im Kühlschrank lagern. An darauf folgenden Tagen das gelagerte Fläschchen erneut im Agitator schütteln.

Als Nächstes injizieren Sie 0,5 Millimol pro Kilogramm Manganchlorid intraperitoneal und warten 10 Minuten, um die Verteilung zu ermöglichen. Danach schütteln Sie das Gefäß mit Mikrobläschen eine Minute lang von Hand, um die Mikrosphären erneut in Suspension zu bringen. Anschließend entnehmen Sie 30 Mikroliter zuzüglich des Totvolumens des Katheters.

Vermeiden Sie es sorgfältig, Luft in das Fläschchen zu injizieren, da dies die verbleibenden Mikrobläschen schädigen würde. Beginnen Sie unverzüglich mit der Ultraschallimpulssequenz und injizieren Sie die Mikrokugeln über den Venenkatheter im Schwanz mit minimalem Zeitverzug. Setzen Sie die Beschallung drei Minuten lang fort.

Schalten Sie dann das Ultraschallsystem aus. Nachdem sich der Mangangehalt im Gehirn etwa 40 Minuten lang stabilisiert hat, schalten Sie das Isofluran ab und entfernen Sie die Nasenkappe. Beginnen Sie an diesem Punkt mit dem neuronalen Stimulationsparadigma, um den Barrel-Feld-Kortex abzubilden.

Bewegen Sie einen Pinsel 90 Minuten lang mit einer kreisförmigen Bewegung von etwa ein bis fünf Hertz durch das kontralaterale Vibra-Array. Setzen Sie die Anästhesie nach der Stimulation erneut ein und fahren Sie anschließend mit der Aufrechterhaltung der Körpertemperatur fort, indem Sie die Isofloran-Konzentration auf eine Atemfrequenz von 85 bis 125 Atemzügen pro Minute einstellen. Danach platzieren Sie die Maus in einer MRT-Spule und überführen sie in das MRT-System.

Danach die hochauflösenden 3D-T1-gewichteten Bilder wie hier gezeigt aufnehmen. Eine Störung der Blut-Hirn-Schranke nach Verabreichung eines T1-verkürzenden Kontrastmittels wie Mangan oder eines Gadolinium-basierten Mittels führt im Vergleich zu Gehirnen, bei denen keine BOMA durchgeführt wurde, zu einer Signalzunahme im Hirnparenchym in der T1-gewichteten Bildgebung. In der ersten Spalte sind hier die durch einseitige Stimulation des Risi bei sieben Tieren erzeugten neuronalen Aktivitätskarten dargestellt.

Differenzkarten an zwei verschiedenen Positionen zeigen ein erhöhtes MRT-Signal kontralateral zur durch Brissy stimulierte Region. In der zweiten Spalte zeigen p-Wert-Karten die relative Signifikanz dieser Unterschiede. In der dritten Spalte zeigen die entsprechenden Hirnatlas-Diagramme, dass diese aktiven Bereiche dem Barrel-Feld der primären sensorischen Rinde entsprechen.

Mit etwas Übung kann diese Technik innerhalb von etwa zwei Stunden plus Simulationsdauer durchgeführt werden. Bei der Durchführung des Verfahrens ist es wichtig, die Mikrobläschenflasche vor der Injektion zu schütteln und darauf zu achten, keine Luft in die Flasche zu injizieren. Außerdem ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen im Ultraschallgel oder unterhalb des Ultraschallwandlers eingeschlossen sind.

Für diese Demonstration haben wir uns dafür entschieden, die Schnurrhaare zu stimulieren, doch offensichtlich kann diese Technik an jeden Stimulus angepasst werden, der von Interesse ist. Nach dem Eingriff kann sich das Tier vollständig erholen, wodurch Längsschnittstudien ermöglicht werden.