Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln
23. Mai 2012
Dieses Video zeigt Verfahren zur Charakterisierung von humanen Langerhans-Inseln mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Immunhistochemie (IHC). Pankreas-Abschnitten von Kopf, Körper und Schwanz Regionen werden sowohl von H & E und IHC gefärbt, um Inselzellen endokrinen Zusammensetzung (Insulin, Glukagon und pankreatische Polypeptid), Zell-Replikation (Ki67) und entzündlichen Infiltraten (H & E, CD3) zu bestimmen. Die uncinatus Region lokalisiert ist mit IHC für pankreatische Polypeptid.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Charakterisierung menschlicher Pankreasösen mittels Hämatin- und Eosinfärbung und Immunhistochemie. Dies wird erreicht, indem serielle Schnitte aus einer Pankreasprobe erstellt werden, die in einen Paraffinblock eingebettet ist. Die Abschnitte werden dann in ihrer ursprünglichen Ausrichtung auf Folien platziert.
Ein Teil der Objektträger wird mit Hämatin und Eoin gefärbt, während die restlichen Objektträger immunhistochemisch gefärbt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die gefärbten Objektträger zu scannen und nach Fällen zu ordnen. Letztendlich können diese Bilder in eine Online-Pathologiedatenbank hochgeladen werden, wo sie von anderen Forschern auf diesem Gebiet eingesehen werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Objektträger in Reihe gefärbt werden, wobei ihre ursprüngliche Ausrichtung beibehalten wird.
Linda Snyder, Histotechnologin, Emily Montgomery, Biowissenschaftlerin, und Tiffany Hippo, Labortechnikerin in meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Richten Sie zunächst das Wasserbad und das Mikrotom gemäß den Standardverfahren für die Paraffinmikrotomie ein. Als nächstes beschriften Sie positiv geladene Objektträger mit der Fallnummer, der Bauchspeicheldrüseregion und der Objektträgernummer.
Wenn alles vorbereitet ist, legen Sie den Paraffinblock mit dem Kassettenetikett auf der linken Seite in das Mikrotomfutter. Nach normalen Mikrotomieverfahren schneiden Sie den Block, bis das Gewebe gleichmäßig freigelegt ist. Sobald das Gewebe gleichmäßig auftrifft, erzeugen Sie ein Band aus seriellen Abschnitten mit einer Dicke von etwa vier Mikrometern.
Es werden drei bis sechs Abschnitte benötigt, abhängig von der Anzahl der erforderlichen Erstflecken. Trennen Sie als Nächstes die Abschnitte des Menübands. Nehmen Sie jeden Abschnitt der Reihe nach auf und platzieren Sie ihn auf einer Folie.
Notieren Sie die Abschnittsnummer mit einem Bleistift. Wenn ein Abschnitt unbrauchbar ist, überspringen Sie diese Nummer und fahren Sie mit der Nummerierung der Abschnitte in der genauen Reihenfolge fort. Achten Sie darauf, dass der Schlitten die gleiche Ausrichtung wie in der Kassette beibehält, wobei das Folienetikett nach links ausgerichtet ist.
Legen Sie anschließend die Objektträger in ein Objektträgergestell und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Versiegeln Sie die Oberfläche des Paraffinblocks bei Raumtemperatur wieder mit einer dünnen Schicht Paraffin, um das Gewebe zu konservieren und bei Raumtemperatur oder minus 20 Grad Celsius zu archivieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das nächste Beispiel.
Es ist wichtig, die Nummerierung für serielle Abschnitte auf jeder Ebene beizubehalten, wie oben bei der Färbung von h und e zu sehen ist. Legen Sie den ersten Objektträger aus jedem Block in ein Objektträgergestell und platzieren Sie das Gestell dann in das erste Fach des Autostainers. Wählen Sie das Standard-HE-Programm und starten Sie den Färbevorgang.
Wenn die Färbung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Objektträger aus dem Autofärber und legen Sie sie in die Haube, um sie auf den Deckel zu schieben. Legen Sie auf jede Folie ein Deckglas mit Standardtechniken. Beschriften Sie die Objektträger abschließend mit einem bedruckten Etikett und lassen Sie sie in der Haube gründlich trocknen.
Beginnen Sie mit der Einrichtung des Autostainers und bereiten Sie alle erforderlichen Reagenzien vor. Wählen Sie das Daco-Programm für Doppelflecken. Geben Sie die Anzahl der Objektträger und die Behandlung ein, die jeder erhalten wird.
Laden Sie alle Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers in den Autostainer. Bereiten Sie als Nächstes TBST und Citrat, Puffer, Antikörper und andere Reagenzien vor, die für das Verfahren erforderlich sind. Trennen Sie die Objektträger, indem Sie sie fünf Minuten lang in Xylol legen.
Lassen Sie die Objektträger nicht austrocknen, da dies zu übermäßiger Hintergrund- und Porenfleckbildung führt, während die Objektträger depa sind. Gießen Sie Citratpuffer in einen Dampfgarer, um ihn vor Gebrauch vorzuheizen. Als nächstes unterziehen Sie die Depa-Objektträger einer Reihe von Ethanol-Waschungen.
Spülen Sie die Objektträger ein letztes Mal in entionisiertem Wasser ab. Geben Sie die Objektträger in den vorgeheizten Citratpuffer und lassen Sie sie 30 Minuten dämpfen. Nach dieser Zeit stellen Sie die Objektträger sofort in ein Wasserbad mit Raumtemperatur, bis sie vollständig abgekühlt sind.
Übertragen Sie die Objektträger nach dem Abkühlen in die Dayco Auto Stainer-Racks und achten Sie darauf, die richtige Reihenfolge beizubehalten. Führen Sie abschließend das Doppelfärbeprogramm aus, das zuvor geladen wurde, wenn das Doppelfärbeprogramm abgeschlossen ist. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Autostainer und lassen Sie sie mindestens eine Stunde trocknen, bevor Sie sie dehydrieren.
Um die Dehydrierung fortzusetzen, übertragen Sie sie eine Minute lang auf 80%Ethanol. Fahren Sie mit dem Dörren der Objektträger fort, indem Sie sie in 95 % Ethanol und dann in 100 % Finish einweichen. Zum Schluss tauchen Sie die Objektträger ein und halten Sie sie eine Minute lang in Xylol.
Montieren Sie die Objektträger sofort mit Deckgläsern mit Zytodichtung Um den Vorgang abzuschließen. Drucken Sie Etiketten mit den Fallinformationen, einschließlich der Organ- und Blocknummer, der Art des Flecks und des Datums. Platzieren Sie ein Etikett auf jedem Objektträger, um die Fleckenobjektträger zu scannen.
Legen Sie sie auf ein Scannerfach und befolgen Sie die Standardverfahren. Archivieren Sie die Fleckenobjektträger bei Raumtemperatur und alle verbleibenden ungefärbten Objektträger bei minus 20 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Ordnen Sie abschließend die gefärbten Bilder nach Spender und gesehenem Gewebetyp.
Hier sehen Sie ein Beispiel für die Insulinfärbung von KI 67 plus sowohl bei niedriger als auch bei hoher Vergrößerung. Bilder der gefärbten Pankreasschnitte werden an eine Online-Pathologiedatenbank übermittelt, wodurch eine virtuelle Biobank entsteht. Mit dieser Datenbank können Forscher schnell auf Informationen zugreifen, die für die Forschung und Typ-1-Diabetes benötigt werden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochwertige Objektträger aus der menschlichen Bauchspeicheldrüse vorbereitet und färbt.
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Übersicht
Dieses Video zeigt Verfahren zur Charakterisierung menschlicher Pankreasinseln mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und Immunhistochemie (IHC). Die Methode ermöglicht die Beurteilung der endokrinen Zusammensetzung der Inseln, der Zellreplikation sowie von entzündlichen Infiltraten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Endokrinologie
- Histologie
Hintergrund
- Menschliche Pankreasinseln spielen eine entscheidende Rolle im Glukosestoffwechsel.
- Die Charakterisierung der Inselzusammensetzung ist entscheidend für das Verständnis von Diabetes.
- H&E- und IHC-Färbungen sind Standardverfahren für die Gewebeanalyse.
- Die Beibehaltung der ursprünglichen Orientierung der Schnitte ist entscheidend für eine genaue Beurteilung.
Zweck der Studie
- Charakterisierung menschlicher pankreatischer Inseln.
- Bestimmung der endokrinen Zusammensetzung der Inseln.
- Beurteilung der Zellreplikation und entzündlichen Reaktionen.
Verwendete Methoden
- Erstellung serieller Schnitte aus paraffin-eingebetteten Pankreasproben.
- Färbung der Schnitte mit H&E und IHC.
- Durchsicht gefärbter Objektträger zur Analyse.
- Sortierung der Bilder nach Fällen für den Upload in die Datenbank.
Hauptergebnisse
- Nachweis von Insulin, Glucagon und Pankreas-Polypeptid in den Inseln.
- Beurteilung der Zellreplikation mittels Ki67-Färbung.
- Beurteilung inflammatorischer Infiltrate durch H&E- und CD3-Färbung.
- Erfolgreiche Lokalisation des Uncinatus-Areals mittels immunhistochemischer Färbung (IHC).
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht eine umfassende Charakterisierung der Pankreasinseln.
- Die Beibehaltung der ursprünglichen Objektträgerorientierung verbessert die Genauigkeit der Analyse.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Pankreasfunktion in Gesundheit und Krankheit bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Standardisierte histopathologische Arbeitsabläufe für humane Pankreasinseln ermöglichen eine reproduzierbare Charakterisierung endokriner Zellen und unterstützen die Validierung von Zielstrukturen in der Diabetesforschung. Durch die Erhaltung der Orientierung serieller Schnitte und die Erstellung digitalisierter Ganzpräparataufnahmen erleichtert die Methode den datenbasierten Austausch zwischen Fachdisziplinen sowie das Biobanking zur mechanistischen Absicherung von Inselzell-gerichteten Therapien. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, indem er quantifizierbare, räumlich aufgelöste Daten zur Inselzusammensetzung, -replikation und immunzellulären Infiltraten bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch rigorose histopathologische Untersuchungen und Immunlokalisation von Insel-Endokrinelementen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominderung durch Charakterisierung der Inselmorphologie, -größe, -dichte und der Zusammensetzung endokriner Zellen mittels H&E- und IHC-Färbungen.
- Prädiktiver Wert: Hilft bei der Portfolio-Priorisierung durch Bewertung der Inselreplikation und apoptotischer Zellen mittels Ki67 und anderer Proliferationsmarker.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem die menschliche Bauchspeicheldrüse durch standardisierte Aufarbeitung in definierte Regionen (Kopf, Körper, Schwanz) und Querschnitte unterteilt wird.
- Operationaler Wert: Trägt zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei, indem Unterteilungen numerisch und alphabetisch entsprechend ihrer Größe gekennzeichnet werden, um eine vollständige Analyse der Querschnitte zu ermöglichen.
- Plattform-Wert: Unterstreicht die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings und Skalierbarkeit durch digitalisierte Ganzpräparatbilder, die in einer Online-Pathologiedatenbank organisiert sind und über 200 Forschern zugänglich gemacht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Diskutiert die Krankheitsrelevanz, indem Inseln auf Entzündungen, Fibrose, Amyloid und T-Zell-Infiltrate mittels H&E- und CD3-Färbung untersucht werden.
- Operationaler Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch die Beurteilung sowohl endokriner als auch exokriner Kompartimente, einschließlich duktulärer Pathologie und Neoplasie.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Konzentriert sich auf die prädiktive Entlastung von Risiken durch die Charakterisierung intraduktaler Pankreasneoplasien und deren Beziehung zum Duktussystem.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung, indem sie Serienschnitte, standardisierte Färbungen und das digitale Biobanking von menschlichem Pankreasgewebe ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Histopathologie und Immunlokalisierung von Pankreasinseln und endokrinen Zellen.
- Screening: Stellt die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays sicher, indem die ursprüngliche Objektträgerorientierung während der seriellen Schnittführung und Reihenfärbung beibehalten wird.
- Analytik: Betont quantitative Messungen der Inselarea, Inselanzahl, Zusammensetzung endokriner Zellen, Zellreplikation und T-Zell-Infiltrate mittels H&E- und IHC-Färbung, um den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen zu ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem Inselamyloid, Fibrose und entzündliche Infiltrate bewertet werden, die für die Pathogenese des Typ-1-Diabetes relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert die Methode als wiederverwendbare Kapazität durch eine Online-Pathologiedatenbank, die einen schnellen Datenaustausch sowie die Auswahl von Blöcken für paraffin- oder gefrorene Serienschnitte ermöglicht.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Uneindeutigkeit bezüglich der endokrinen Zusammensetzung der Inseln und ihrer immunologischen Wechselwirkungen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von seriellen Schnitten, Färbungen und der digitalen Archivierung von Objektträgern.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen durch frühzeitige Identifizierung von Insel-Pathologien und Replikationsstatus.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Förderentscheidungen basierend auf quantifizierbarer Insel-Morphologie, Dichte und endokrinen Zellphänotypen.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in Histotechnologie, Immunhistochemie und digitalen Pathologie-Workflows.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Mikrotom, Automatenfärbegerät, Objektträgerscanner und Zugang zu einer Online-Pathologie-Datenbank.
- Standardisierungsanforderungen über mehrere Teams hinweg hinsichtlich der Objektträgerbeschriftung, Schnittnummerierung und Aufrechterhaltung der Orientierung zwischen Histologie- und Bildgebungsteams.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, insbesondere zur Anwendung standardisierter regionaler Aufarbeitung (Kopf, Körper, Schwanz) auf nichtmenschliche Pankreasorgane.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Gewebevariabilität von Organ spendenden Spendern und die Notwendigkeit einer optimierten Antikörper-Validierung für multiplex Immunhistochemie-Färbungen.
