Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Charakterisierung menschlicher Pankreasösen mittels Hämatin- und Eosinfärbung und Immunhistochemie. Dies wird erreicht, indem serielle Schnitte aus einer Pankreasprobe erstellt werden, die in einen Paraffinblock eingebettet ist. Die Abschnitte werden dann in ihrer ursprünglichen Ausrichtung auf Folien platziert.

Ein Teil der Objektträger wird mit Hämatin und Eoin gefärbt, während die restlichen Objektträger immunhistochemisch gefärbt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die gefärbten Objektträger zu scannen und nach Fällen zu ordnen. Letztendlich können diese Bilder in eine Online-Pathologiedatenbank hochgeladen werden, wo sie von anderen Forschern auf diesem Gebiet eingesehen werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Objektträger in Reihe gefärbt werden, wobei ihre ursprüngliche Ausrichtung beibehalten wird.

Linda Snyder, Histotechnologin, Emily Montgomery, Biowissenschaftlerin, und Tiffany Hippo, Labortechnikerin in meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Richten Sie zunächst das Wasserbad und das Mikrotom gemäß den Standardverfahren für die Paraffinmikrotomie ein. Als nächstes beschriften Sie positiv geladene Objektträger mit der Fallnummer, der Bauchspeicheldrüseregion und der Objektträgernummer.

Wenn alles vorbereitet ist, legen Sie den Paraffinblock mit dem Kassettenetikett auf der linken Seite in das Mikrotomfutter. Nach normalen Mikrotomieverfahren schneiden Sie den Block, bis das Gewebe gleichmäßig freigelegt ist. Sobald das Gewebe gleichmäßig auftrifft, erzeugen Sie ein Band aus seriellen Abschnitten mit einer Dicke von etwa vier Mikrometern.

Es werden drei bis sechs Abschnitte benötigt, abhängig von der Anzahl der erforderlichen Erstflecken. Trennen Sie als Nächstes die Abschnitte des Menübands. Nehmen Sie jeden Abschnitt der Reihe nach auf und platzieren Sie ihn auf einer Folie.

Notieren Sie die Abschnittsnummer mit einem Bleistift. Wenn ein Abschnitt unbrauchbar ist, überspringen Sie diese Nummer und fahren Sie mit der Nummerierung der Abschnitte in der genauen Reihenfolge fort. Achten Sie darauf, dass der Schlitten die gleiche Ausrichtung wie in der Kassette beibehält, wobei das Folienetikett nach links ausgerichtet ist.

Legen Sie anschließend die Objektträger in ein Objektträgergestell und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Versiegeln Sie die Oberfläche des Paraffinblocks bei Raumtemperatur wieder mit einer dünnen Schicht Paraffin, um das Gewebe zu konservieren und bei Raumtemperatur oder minus 20 Grad Celsius zu archivieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das nächste Beispiel.

Es ist wichtig, die Nummerierung für serielle Abschnitte auf jeder Ebene beizubehalten, wie oben bei der Färbung von h und e zu sehen ist. Legen Sie den ersten Objektträger aus jedem Block in ein Objektträgergestell und platzieren Sie das Gestell dann in das erste Fach des Autostainers. Wählen Sie das Standard-HE-Programm und starten Sie den Färbevorgang.

Wenn die Färbung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Objektträger aus dem Autofärber und legen Sie sie in die Haube, um sie auf den Deckel zu schieben. Legen Sie auf jede Folie ein Deckglas mit Standardtechniken. Beschriften Sie die Objektträger abschließend mit einem bedruckten Etikett und lassen Sie sie in der Haube gründlich trocknen.

Beginnen Sie mit der Einrichtung des Autostainers und bereiten Sie alle erforderlichen Reagenzien vor. Wählen Sie das Daco-Programm für Doppelflecken. Geben Sie die Anzahl der Objektträger und die Behandlung ein, die jeder erhalten wird.

Laden Sie alle Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers in den Autostainer. Bereiten Sie als Nächstes TBST und Citrat, Puffer, Antikörper und andere Reagenzien vor, die für das Verfahren erforderlich sind. Trennen Sie die Objektträger, indem Sie sie fünf Minuten lang in Xylol legen.

Lassen Sie die Objektträger nicht austrocknen, da dies zu übermäßiger Hintergrund- und Porenfleckbildung führt, während die Objektträger depa sind. Gießen Sie Citratpuffer in einen Dampfgarer, um ihn vor Gebrauch vorzuheizen. Als nächstes unterziehen Sie die Depa-Objektträger einer Reihe von Ethanol-Waschungen.

Spülen Sie die Objektträger ein letztes Mal in entionisiertem Wasser ab. Geben Sie die Objektträger in den vorgeheizten Citratpuffer und lassen Sie sie 30 Minuten dämpfen. Nach dieser Zeit stellen Sie die Objektträger sofort in ein Wasserbad mit Raumtemperatur, bis sie vollständig abgekühlt sind.

Übertragen Sie die Objektträger nach dem Abkühlen in die Dayco Auto Stainer-Racks und achten Sie darauf, die richtige Reihenfolge beizubehalten. Führen Sie abschließend das Doppelfärbeprogramm aus, das zuvor geladen wurde, wenn das Doppelfärbeprogramm abgeschlossen ist. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Autostainer und lassen Sie sie mindestens eine Stunde trocknen, bevor Sie sie dehydrieren.

Um die Dehydrierung fortzusetzen, übertragen Sie sie eine Minute lang auf 80%Ethanol. Fahren Sie mit dem Dörren der Objektträger fort, indem Sie sie in 95 % Ethanol und dann in 100 % Finish einweichen. Zum Schluss tauchen Sie die Objektträger ein und halten Sie sie eine Minute lang in Xylol.

Montieren Sie die Objektträger sofort mit Deckgläsern mit Zytodichtung Um den Vorgang abzuschließen. Drucken Sie Etiketten mit den Fallinformationen, einschließlich der Organ- und Blocknummer, der Art des Flecks und des Datums. Platzieren Sie ein Etikett auf jedem Objektträger, um die Fleckenobjektträger zu scannen.

Legen Sie sie auf ein Scannerfach und befolgen Sie die Standardverfahren. Archivieren Sie die Fleckenobjektträger bei Raumtemperatur und alle verbleibenden ungefärbten Objektträger bei minus 20 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Ordnen Sie abschließend die gefärbten Bilder nach Spender und gesehenem Gewebetyp.

Hier sehen Sie ein Beispiel für die Insulinfärbung von KI 67 plus sowohl bei niedriger als auch bei hoher Vergrößerung. Bilder der gefärbten Pankreasschnitte werden an eine Online-Pathologiedatenbank übermittelt, wodurch eine virtuelle Biobank entsteht. Mit dieser Datenbank können Forscher schnell auf Informationen zugreifen, die für die Forschung und Typ-1-Diabetes benötigt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochwertige Objektträger aus der menschlichen Bauchspeicheldrüse vorbereitet und färbt.