Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Kalziumaktivität von Zellen in der postnatalen subventrikulären Zone abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst vorsichtig Hirngewebe von einer postnatalen Maus entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, lebende akute Hirnschnitte zu machen, die die subventrikuläre Zone enthalten.

Als nächstes werden die Gehirnschnitte mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff beladen. Der letzte Schritt besteht darin, die Aktivität mit einem konfokalen Zeitraffermikroskop abzubilden. Letztendlich wird die Zeitrafferbildgebung der Kalziumaktivität in ventrikulären Zonenzellen verwendet, um die Dynamik der interzellulären Aktivität zu zeigen und Kommunikationsmuster zwischen verschiedenen Zelltypen und dem Gefäßsystem aufzudecken.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neurogenese zu beantworten, z. B. wie verschiedene Zelltypen miteinander kommunizieren und wie Zellen das Gefäßsystem beeinflussen können, nachdem ein P 20 bis P 30 Mausjunges geopfert und geköpft wurde. Legen Sie den Kopf gemäß den institutionell anerkannten Richtlinien in ein Tablettfeld mit Präparierlösung. Stabilisieren Sie den Kopf mit einer Pinzette und verwenden Sie eine Mikroschere, um kontinuierliche Schnitte um den Schädel und die Mittellinie zu machen.

Stellen Sie sicher, dass der Riechkolben am Gehirn befestigt bleibt und nicht beschädigt wird. Machen Sie Schnitte auf der Rückenseite und entfernen Sie dann mit einer Pinzette den darüber liegenden Schädel aus dem Gehirn. Halten Sie dann den Kopf immer noch mit einer Pinzette fest und verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einen koronalen Schnitt in Höhe von Lambda zu machen.

Verwenden Sie dieselbe Rasierklinge, um sagittale Schnitte auf beiden Seiten des Gehirns zu machen, etwa zwei bis drei Millimeter lateral der Mittellinie. Schaufeln Sie dann mit der Klinge unter das Gehirn und entfernen Sie es vollständig aus dem Schädel. Der Eingriff bis zu diesem Punkt sollte in weniger als drei Minuten durchgeführt sein.

Gib einen Klecks Sekundenkleber auf Cyanacrylatbasis auf die Platte des Vibrams. Nehmen Sie dann das Hirngewebe auf und montieren Sie es auf eine der flachen Seiten, die durch den lateralen sagittalen Schnitt entstehen. Die Montage eines Agaroseblocks zur Stabilisierung des Gewebes während des Schneidens ist optional.

Spülen Sie die Vibram-Klinge mit Ethanol ab, um Öle zu entfernen, und spülen Sie sie dann mit destilliertem Wasser ab. Setzen Sie die Klinge in den Klingenhalter ein und montieren Sie den Klingenhalter auf den Vibrator. Stellen Sie den Vibrator so ein, dass Gewebescheiben bei hochfrequenten Vibrationen und niedriger Geschwindigkeit auf eine Dicke von 250 bis 350 Mikrometern geschnitten werden.

Das Erscheinungsbild des Riechkolbens ist ein guter Indikator dafür, dass sich die sagittalen Abschnitte der subventrikulären Zone nähern. Das Aussehen der Ventrikel und die Verdickung des Corpus callosum sind ebenfalls gute Indikatoren für das spätere Auftreten der subventrikulären Zone. Sobald die subventrikuläre Zone erreicht ist, verwenden Sie eine Plastikpipette mit abgeschnittener Spitze, um jede Scheibe zu entfernen und in eine Scheibenhaltekammer zu übertragen.

Mit einem Liquor. Die Slices erfordern eine Stunde Inkubation in A CSF. In dieser Zeit können Pipetten, Farbstoff und Mikroskop für die nachfolgenden Bildgebungsschritte vorbereitet werden.

Um die Pipetten vorzubereiten, ziehen Sie sechs bis acht Glaspipetten so, dass jede eine Spitzenlänge von etwa zwei Millimetern und einen Durchmesser von zwei bis drei Mikrometern hat. Zusätzlich ist der Pipettenhalter in einem Winkel von ca. 16 Grad voreingestellt, so dass die Pipette montiert werden kann, ohne die Perfusionskammer zu berühren oder die Platzierung des Objektivs zu beeinträchtigen. Zur Herstellung des Calciumfarbstoffs werden 4,6 Mikroliter onic F1 27, 20%ige Lösung in DMSO zu einem 50 Mikrogramm Aliquot von Grippe oh vier hinzugefügt.

Um schließlich die Peristaltikpumpe vorzubereiten, deren Verwendung dazu beiträgt, die Bilddrift zu minimieren, führen Sie einen Liquor durch die Perfusionsleitungen und stellen Sie sicher, dass die Leitungen blasenfrei sind. Positionieren Sie nun die Vakuumspitze so, dass die Lösung aus der Perfusionskammer abgesaugt wird. Dieses Bild zeigt den Aufbau des Perfusionssystems.

Die Lösung sollte sich auf einer ausreichenden Höhe befinden, um das Objektiv im richtigen Arbeitsabstand einzutauchen, aber nicht so hoch, dass die Lösung über die Seiten der Kammer hinausläuft. Achten Sie auf Stetigkeit, um ein konstantes Bestreben zu überprüfen, Ladefarbe über die Badmethode aufzutragen. Stellen Sie zunächst ein bis zwei Milliliter der vier bis fünf mikromolaren Farbstoff-Arbeitslösung her, indem Sie die Stammlösung verdünnen.

In A CSF die Scheiben in eine 35 Millimeter große Kulturschale mit Netzboden geben, die mit A CSF gefüllt ist. Verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Transferpipette aus Kunststoff, um das A CSF vorsichtig zu entfernen, während Sie gleichzeitig die Calciumfarbstoff-Arbeitslösung hinzufügen. Dann bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten in einer mit 5 % Kohlendioxid kontrollierten Umgebung inkubieren.

Legen Sie die Scheibe nach der Inkubation wieder in die mit A CSF gefüllte Haltekammer, um Farbstoffe zu entfernen, die nicht in die Zellen gelangt sind. Nach 30 Minuten in A CSF wird die Scheibe in die Perfusionskammer gebracht, wo der Farbstoff unter Druck aufgetragen wird. Übertragen Sie eine Scheibe aus der Haltekammer in die Perfusionskammer auf dem Mikroskop.

Füllen Sie dann die Glaspipette mit 250 mikromolaren Farbstoff-Arbeitslösung auf. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze frei von Blasen ist und auf den Mikromanipulator aufgesetzt wird. Senken Sie nun die Pipette auf den interessierenden Bereich ab.

Die Pipette kann so platziert werden, dass sich die Spitze mehrere Mikrometer über der geschnittenen Oberfläche befindet, oder mehrere Mikrometer unter der Oberfläche, aber außerhalb des aufgezeichneten Bereichs. Stellen Sie die Pico-Schorle so ein, dass sie weniger als drei Pfund pro Quadratzoll liefert, und tragen Sie die Farbe ein bis zwei Minuten lang auf. Wiederholte Anwendungen können je nach Etikettierung, wie sie mit dem Auge beurteilt wird, erforderlich sein.

Wenn dieses Protokoll auf die Oberfläche der Scheibe aufgetragen wird, markiert es bevorzugt Neuroblasten, wenn es unter der Oberfläche angewendet wird, diese Technik markiert bevorzugt Astrozyten, aber wenn es länger als drei Minuten bei einer Konzentration von 500 angewendet wird, wird mikromolare Neuroblast markiert. Unabhängig von der Position der Pipettenspitze lassen Sie die Scheibe 30 bis 45 Minuten lang in A CSF waschen und erholen. Lokalisieren Sie den interessierenden Bereich mit einem Objektiv mit geringerer Leistung, wechseln Sie dann zu einem Wasserimmersionsobjektiv mit höherer Leistung und beurteilen Sie den Zustand der Zellen im interessierenden Bereich.

Unter einem differentiellen Interferenzkontrast erscheinen gesunde Zellen rund und prall und zeigen eine schwache Grippe-Oh-Vier-Belastung. Nachdem Sie überprüft haben, dass die Perfusion und das Vakuum ordnungsgemäß funktionieren, stellen Sie die Zeitrafferauflösung und die räumliche Auflösung auf die gewünschten Raten ein. In diesem Fall wird etwa jede Sekunde ein Frame mit einer Auflösung von fünf 12 x fünf 12 Pixeln abgebildet

Nachdem Sie die Dauer von zwei bis 10 Minuten eingestellt haben, starten Sie den Lauf. Pharmakologische Wirkstoffe werden fünf bis 10 Minuten lang abgewaschen und dann weitere fünf bis 10 Minuten ausgewaschen. Dieses repräsentative gemittelte Bild aus einer Zeitrafferaufnahme der Kalziumaktivität wurde nach Astrozyten in der subventrikulären Zone aufgenommen.

Waren mit Druck belastet. Anwendung von Grippe oh 4:00 Uhr tief in die Scheibe. Filme wurden bei 0,5 erworben.

In zweiten Zeitschritten werden die interessierenden Regionen über Zellen gelegt, die Aktivität zeigen. Hier sind die Spuren aus den nummerierten Bereichen von Interesse, die zuvor gezeigt wurden. Die Kurven wurden mit einem gleitenden Durchschnitt gefiltert und normalisiert.

Die vertikale Skala stellt das Zweifache von Delta F über F Null dar, wobei F die Signalintensität und F Null das durchschnittliche Basissignal und Delta F gleich F minus F Null ist. Einmal gemeistert. Diese Technik kann in vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.