Name: Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Vorbereitung akuter Subventrikulärzone-Slices für Calcium-Imaging in postnatalen Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung zellulärer Aktivitätsdynamiken und interzellulärer Kommunikationsmuster in der Neurogenese.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell Zuschuss (AB), Pardee Stiftung (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY) und einer NSF Graduate Research unterstützt Fellowship (BL). Wir danken den Bordey lab Mitglieder für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Das vorliegende Material ist auf der Arbeit teilweise durch den Staat Connecticut unter dem Connecticut Stem Cell Research Grants Program unterstützt werden. Die Inhalte sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Staates Connecticut, Incorporated das Department of Public Health des Staates Connecticut oder CT Innovationen.

Ein. Herstellung von Lösungen, Dissection und Vibratom <ol><li> Die Lösungen müssen in der richtigen Osmolarität und pH-Wert (Tabelle 1) hergestellt werden. Verglichen mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) wird Dissektion Lösung mit niedrigeren Konzentrationen von Natrium und Calcium, und höhere Konzentrationen an Magnesium hergestellt. Dies ist zu Exzitotoxizität Effekte während des Schneidens zu minimieren. </li><li> Beide Dissektion und ACSF Lösungen müssen mit 95% O 2/5% CO 2 durch Einblasen von mindestens 10 min, um den gewünschten pH-Wert von 7,3 zu erreichen. Gesättigt sein </li><li> Bereiten Sie ein Eisbad in einem Tablett. Legen Sie eine Dissektion Platte im Eisbad und füllen mit Dissektion Lösung. Blase die Dissektion Platte. </li><li> Bereiten Sie die Vibratom durch die Schaffung eines Eisbad. Legen Sie das Schneiden Gericht im Eisbad, füllen Sie die Schale mit Dissektion Lösung und Blase. </li><li> Füllen Sie das Slice-Aufnahmekammer mit ACSF und Blase, diese Lösung zu gewährleisten ausreichend belüftet unabhängigvon denen Scheiben angeordnet sind. </li></ol> 2. Removal of Brain Tissue Akute Hirnschnitten tendenziell gesünder mit jüngeren Mäusen. Die postnatale SVZ die zelluläre Architektur in Nagetieren ist reif rund postnatalen Tag (P) 20 1. Deshalb versuchen wir, unseren Experimenten zu Maus Alter von P20-P30 zu begrenzen, aber wir haben erfolgreiche Versuche bei Mäusen so alt wie die 3 Monate durchgeführt. Während der gesamten Handhabung des Gewebes, muss man darauf achten, die mechanischen Bewegungen und Druck auf das Gehirn zu minimieren, halten gekühlten Bedingungen, und setzen die SVZ zur Lösung so schnell wie möglich nach der Tötung. <ol><li> Nach Injektion von Pentobarbital wird die Maus schnell enthauptet. Das Fell wird entfernt und Einschnitte durch die Basis des Schädels hergestellt. Der Kopf wird dann in eine Schale mit Dissektion Lösung gefüllt war. </li><li> Während Stabilisierung des Kopfes mit einer Pinzette, kontinuierliche Schnitte um den Schädel gemacht und manchmal bis zur Mittellinie mit Microscissors. Seien Sie vorsichtig, um den Kontakt mit dem Gewebe zu minimieren. Da der Riechkolben ist das endgültige Ziel der neugeborenen Neuronen aus dem SVZ, muss man darauf achten, bewahren diese Region, vor allem während Knochenentfernung in dieser Gegend. Microscissor Schnitten um den Schädel sollten auf der dorsalen Seite zu sein, um für ein leichtes Entfernen des Schädels zu ermöglichen. </li><li> Entfernen des Schädels über dem Gehirn wird nun aus den Knochen unterhalb des Gehirns getrennt. Wenn Schnitte im vorherigen Schritt richtig gemacht sind, kann dies darüber liegenden Knochen leicht mit einer Pinzette oder einer Pinzette entfernt werden. </li><li> Halten Sie den Kopf mit einer Pinzette, kann man einem Skalpell sauber zu entfernen mehrere Stücke von Hirngewebe vor Slicing, wie die folgenden. Ein koronalen Schnitt kann auf der Ebene der Lambda erfolgen. Sagittalen Schnitte auf beiden Seiten des Gehirns lateral der SVZ erfolgen. Eine konservative Schätzung würde ~ 2,5 mm von der Mittellinie liegen. Falls gewünscht, kann das Gehirn auch hier hemisected werden. Diese Kürzungen werden sowohl facilitate Befestigung des Gewebes und damit die SVZ mehr schnell erreicht werden beim Gehirn schneiden. Es ist wichtig, sich zu erinnern, die minimale Menge von mechanischen Kräften auf das Gehirn (zB nicht Schieben oder Ziehen) auszuüben. </li></ol> 3. Akute Hirnschnitt Vorbereitung <ol><li> Um für die weiteren Schritte vorzubereiten, sicherzustellen, dass die Super-Klebstoff verwendet werden, um das Gewebe zu montieren frei von Verstopfungen und bereit für die Vibratom Platte anzuwenden. Es ist wichtig, möglichst schnell gehen, ohne Schädigung des Gehirns. </li><li> Das Hirngewebe kann dann von unten, die das Gewebe trennt sich von den darunter liegenden Knochen gleichzeitig trennt Nerven geschöpft werden. </li><li> Das Gewebe wird fertig verklebt auf einer Platte und auf dem Vibratom. Aufgrund der rostral-kaudale Anatomie des SVZ, haben wir uns darauf sagittale Schichten, wie es die wandernden Weg der Neuroblasten, die Gliazellen Scheide und das Gefäßsystem, die weitgehend in diese Richtung ausgerichtet sind konserviert konzentriert. Man kann entweder mount das Gewebe an der Mittellinie oder auf der flachen Oberfläche, indem sie sagittalen Schnitte quer zur SVZ erstellt. Ein optionaler Schritt ist, eine 3% Agarose Block hinter dem Gewebe zu platzieren, um als Anschlag zu der Klinge dienen als die Scheiben abgehen. Wir bevorzugt Cyanoacrylat-Basis Superkleber verwendet. </li><li> Spülen Sie die Klinge mit Ethanol zur Beseitigung von Ölen und spülen mit destilliertem Wasser. Zeigen die Klinge am Klingenhalter. Montieren Sie den Messerhalter der Vibratom. </li><li> Passen Vibratom Einstellungen, um Gewebe in einer Dicke von 250 bis 350 um pro Scheibe geschnitten. Es ist wichtig, um den Vorgang mit hochfrequenten Schwingungen und mit geringer Geschwindigkeit. </li><li> Abschnitt progressiv durch das Gewebe. Das Aussehen der Riechkolben ist ein guter Indikator dafür, dass ein in der Nähe des SVZ in sagittaler Scheiben als die meisten seitlichen Scheiben weder Region enthalten wird, ist. Weitere Sehenswürdigkeiten zu suchen sind die Herzkammer und die Verdickung des Corpus callosum, unter dem die SVZ befindet. Die SVZ erscheint in mehreren seitlichen Sagit erstental Scheiben schneiden. Das RMS wird im medialen sagittalen Schnitte zeigen. </li><li> Entfernen Sie Scheiben mit der SVZ mit einem Kunststoff-Pasteurpipette mit der Spitze abgeschnitten. Übertragen auf die Scheibe Aufnahmeraum. Wir erhalten oft mehr Scheiben als wir in einem Werk Tag nutzen können. Allerdings werden Scheiben von der Menge der Zellen, die das SVZ variieren. Es ist manchmal notwendig, um durch mehrere Scheiben schauen, um ein für die Bildgebung gewünschte zu finden. </li></ol> 4. Vorbereitung Mikroskop und Farbstoffe Die Scheiben müssen eine Stunde Inkubationszeit in ACSF von der Dissektion und Schneiden erholen. Mehrere Schritte können während dieser Scheibe Erholungsphase durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung von Pipetten für Calcium Farbstoff und / oder Drug Application <ol class="lalpha"><li> Glaspipetten benötigen, um eine Spitze von 2-3 um Durchmesser und einer Spitze Länge (~ 2 mm) und Winkel (~ 16 ° für den Pipettenhalter), die Kontakt mit dem verhindert Perfusionskammer haben und erlaubt eine Platzierungdas Ziel. </li><li> Man kann in der Regel bereiten 6-8 Druck Pipetten für jeden Tag der Experimente. </li></ol></li><li> Calcium Farbstoffzubereitung <ol class="lalpha"><li> Bei der Herstellung der Arbeitslösung (4-5 uM durch Bad, 250 uM durch Druck-Anwendung), ist es am besten, um die minimale Menge an DMSO, um Zellen aussetzen. Dies kann durch hochkonzentrierte Bestände erreicht werden kann. Zum Beispiel für Fluo-4, ist ein Rohr, enthaltend 50 g pro Tag verwendet wird. Man kann eine 10 mM Vorratslösung dieses Aliquot durch Zugabe von 4,6 ul Pluronic F-127 20% ige Lösung in DMSO machen. </li></ol></li><li> Vorbereitung Mikroskop-Setup (Abbildung 2). <ol class="lalpha"><li> Verwendung einer peristaltischen Pumpe für einen Lösungsfluß half Bilddrift minimieren. Führen Sie die Schlauchpumpe vor, damit ACSF durch die Perfusion verlaufen und sicherzustellen, dass es blasenfrei ist. </li><li> Röhren-Einlass auf der Perfusionskammer und sicherzustellen, dass keine Leckagen. </li><li> Positionieren Sie den Vakuum-Spitze ensure, dass die Lösung, die ausgewählt ist aus der Perfusionskammer abgesaugt. Sicherzustellen, dass er auf einem adäquaten Niveau ist so, dass das Ziel die richtige Arbeitshöhe Abstand eingetaucht wird, aber nicht so hoch, so daß Lösung kann über die Kammer gelangt. Ein niedriges Niveau der Lösung minimiert auch Flow Verzerrungen. Eine ständige Streben können auch durch das Hören für Stabilität überprüft werden. </li></ol></li></ol> 5. Dye Loading Dieses Verfahren ist im Detail in einer anderen Manuskript 2 beschrieben. Bitte siehe Abbildungen darin. <ol><li> Bath Ladefarbstoff <ol class="lalpha"><li> Machen Sie eine 1-2 ml Arbeitslösung des Farbstoffes. Für Fluo-4 AM, ist eine Konzentration von 4-5 uM ausreichend für die Kennzeichnung SVZ Neuroblasten. </li><li> Scheiben werden zunächst für eine 35 mm Kulturschale mit einem Siebeinsatz, das bereits mit ACSF gefüllt übertragen. Ersetzen Sie die Lösung unter Verwendung eines 3 ml Kunststoff-Pipette vorsichtig entfernen ACSF, während gleichzeitige Zugabe des calcium Farbstoff funktionierende Lösung. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 30-60 min in einer 5% CO 2-Gas-kontrollierten Umgebung. </li><li> Legen Sie die Scheibe wieder in den ACSF gefüllte Vorratskammer abzuwaschen Farbstoff, keine Zellen eingegeben hat. Alternativ kann man sie direkt auf den Mikroskop Perfusionskammer, auf dem ACSF wird. Diese Wäsche beträgt 30-45 min. </li><li> Übertragen Sie das Slice der Perfusionskammer. </li></ol></li><li> Druckbeaufschlagung von Farbstoff <ol class="lalpha"><li> Übertragen der Scheibe von der Haltekammer zum Perfusionskammer am Mikroskop Setup. </li><li> Füllen Sie ein Glas Pipette mit eine funktionierende Lösung, die 250 uM und auf den Mikromanipulator ist. </li><li> Senken Sie die Pipette in die Region von Interesse. Die Pipette kann derart platziert werden, dass die Spitze entweder mehrere Mikrometer über der Scheibenoberfläche oder vergraben mehrere Mikrometer unterhalb der Scheibenoberfläche, aber entfernt von der aufgenommenen Region. Der Winkel der Pipette nicht Affect das Laden Effizienz. Bei der Abbildung unterhalb der Scheibenoberfläche, finden wir, dass die Platzierung der Pipettenspitze unterhalb der Bildebene wird von uns gewünschten Bildbereich besser kennzeichnen. </li><li> Wenn der Druck der Farbstoff Anwendung, stellen Sie den Picospritzer so dass es &lt;3 psi ist. Wir haben nicht das Volumen der Farbstoffdiffusion geschätzt, weil diese unterliegt Schwankungen der Pipettenspitze Durchmesser, angelegten Druck, und der Dichte des Gewebes, wo der Farbstoff injiziert. Wir wenden einfach, bis wir unsere gewünschte Beladung zu erreichen, wie mit dem Auge beurteilt. Minimieren Beschädigung der Scheibe während der Applikation, insbesondere, wenn die Spitze unterhalb der Scheibenoberfläche angeordnet ist. Bewerben Sie sich für 1-2 min. Manchmal wiederholten Anwendungen notwendig sind je nach Kennzeichnung als mit dem Auge beurteilt. Aus diesem Konzentration und Anwendungsdauer, finden wir, dass Oberflächen Anwendung der Farbstoff bevorzugt beschriftet Neuroblasten, während unter der Oberfläche Anwendung bevorzugt beschriftet Astrozyten. Allerdings wird&gt; 3 min Anwendung bei 500 uM auch benennen Neuroblastenunabhängig davon, ob die Spitze oberhalb oder unterhalb der Scheibenoberfläche (JC Platel, unveröffentlichte Beobachtung). Lassen Sie für Wasch-und Slice-Recovery für 30-45 min. </li></ol></li></ol> 6. Konfokalen Imaging von Calcium Activity <ol><li> Finden Sie die Region von Interesse zunächst mit einer geringeren Leistung Ziel wie 4x oder 10x. Platz in der Mitte des Feldes vor dem Wechsel zu einer höheren Macht Ziel. An diesem Punkt kann ein allgemeiner slice Gesundheit mit der Feststellung, das Aussehen der SVZ-Zellen unter Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) zu beurteilen. Gesunde Zellen erscheinen rund und plump. Darüber hinaus werden gesunde Zellen anzuzeigen schwachen Fluo-4 Belastung wie zu keiner Belastung bei allen oder helle Fluoreszenz (eine sterbende Zelle) angenommen. </li><li> Senken Sie das Wasser-Immersions-Objektiv auf die Region von Interesse, welche nun farbstoffbeladenen. Entweder ein 40x oder 60x Ziel war für unsere Bedürfnisse ausreichend, obwohl 40x bietet ein breiteres Sichtfeld und ermöglicht eine größere Pipette Zugang. Bei der Abbildung unterhalb derOberfläche, wir gehen oft mindestens 15 &amp;mgr; m unterhalb der Scheibe Oberfläche, wo die 3-dimensionale Architektur und Zell Gesundheit besser erhalten bleiben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Perfusion und Vakuum werden angemessen funktioniert. </li><li> Richten Sie das Mikroskop, so dass Zeitraffer-Auflösung und räumliche Auflösung gewünschten Raten eingestellt sind. Für die konfokale Mikroskopie, müssen diese Faktoren als Erhöhung Zeitauflösung ausgeglichen werden gewöhnlich zu einem Verlust an räumlicher Auflösung aufgrund der Scanbewegung Natur des Systems. Für Calcium Aktivität haben wir einen Rahmen etwa jede zweite mit einem 512x512 Bildpunkten abgebildet. Wenn mehrere Kanäle separat erworben notwendig sind, wird sich dies auch auf Abtastraten. Stellen Dauer der Film (2-10 min). </li><li> Initiieren laufen. Wenn die Durchführung pharmakologischer Studien, auf Antagonisten oder nicht-desensibilisierenden Agonisten waschen für mindestens 5-10 min, und dann noch einen Film von 5-10 min. Agonisten, die Rezeptoren desensibilisieren kann akut können angewendet werden, wie beispielsweise durch Verwendung einer prEssure Pipette durch einen Mikromanipulator gesteuert. </li></ol> 7. Calcium Analyse Analyse folgt Standardverfahren, dass wir in pervious Veröffentlichungen beschrieben 2-4. F 0 (dh Baseline) und F sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten über alle Regionen von Interesse (ROI) und in jedem ROI gemessen. Eine Änderung in der Fluoreszenz wurde als ein Ca 2 + Erhöhung sein, wenn es&gt; 15% war F / F 0 erhöhen. Intrazellulärer Ca 2 + Veränderungen wurden anhand Calsignal 5. 8. Repräsentative Ergebnisse Wir waren in der Lage, um eine selektive Beladung von SVZ Zellen in Abhängigkeit von den Farbstoff Belastungsprotokolle oben beschrieben und anderswo 2-4,6 erhalten. Bath Belastung oder Druck-Anwendung auf dem Scheibenoberfläche Fluo-4 AM (4-5 oder 250 uM, jeweils) Etiketten meist Neuroblasten. Während der Druck-Anwendung laden können neurobdauert schneller als Badbelastung in einer einzigen Scheibe, ermöglicht Badbelastung die gleichzeitige Laden von mehreren Scheiben. Wir bestätigen die Identität von markierten Zellen als Neuroblasten durch (1), ob sie Zugverhalten 4,7, (2) ihre Morphologie, (3) eine negative Färbung des Sulforhodamin 101, eine Astrozyten-spezifischen Farbstoff 3 oder (4) eine positive Färbung mit Display DCX-DsRed Ausdruck (JC Platel, unveröffentlichte Beobachtung). Neuroblasten schnell migrieren (durchschnittlich 60 um / h) bei physiologischen Temperaturen 4,7-9, aber ihre Bewegung kann leicht beobachtet werden, selbst bei Raumtemperatur. Die Bewegung der Neuroblasten nicht stellen ein Problem in Bezug auf Platzierung regions-of-interest (ROI) von Calcium-Aktivitäten zu verfolgen, da unsere Filme sind in der Regel von kurzer Dauer. Doch während lange Wartezeiten, wie zum Beispiel während Arzneimittellösung Austausch, müssen die Ermittler vorsichtig sein, um ROIs in Kontroll-und Behandlungsgruppen Zeiträume entsprechen. Es ist nicht ungewöhnlich für Neuroblasten in das oder aus dem i migrieren<html> Maging Feld oder Brennebene. Pressure Anwendung von Fluo-4 AM (250 uM) tief in die Scheibe und für begrenzte Dauer (&lt;2 min) bevorzugt beschriftet SVZ Astrozyten 2. Astrocyten Etikettierung durch positive Markierung mit Sulforhodamin 101 und ihre Morphologie verifiziert worden, insbesondere durch das Vorhandensein von Vorsprüngen und endfeet auf Blutgefäße, die neu 3 beschrieben haben. Mit diesen Methoden haben wir spontane Aktivität sowohl in der SVZ Neuroblast und Astrozyten Population (Abbildung 1) beobachtet. Die Aktivität in Astrozyten nimmt oft die Form von Wellen, die Blutgefäß 3 eingreifen. Darüber hinaus mit Calcium-Imaging als Assay wurde die Anwendung von pharmakologischen Agonisten offenbart oder bestätigt Expression von GABA A-Rezeptoren auf Neuroblasten und Astrozyten 6, Rezeptoren AMPA und NMDA auf Neuroblasten 4. Figures 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Propagierung von Calcium Aktivität in Astrozyten. (A) Repräsentative gemittelt Bild aus einer Zeitraffer-Aufnahme von Kalzium Aktivität. Astrozyten im SVZ wurden mit Druck Anwendung von Fluo-4 geladen Uhr in die Scheibe tief. Filme wurden bei 0,75 s Zeit-Schritten erworben. Regions of Interest (ROI) über Zellen, die eine Tätigkeit gelegt. (B) von Spuren platziert ROIs über Zellen, die aus dem Film in (A) dargestellt. Spuren wurden mit einem gleitenden Durchschnitt und normalisierte gefiltert. Die vertikale Skala repräsentiert 2 x &amp;Dgr; F / F 0, wobei F die Signalintensität und F 0 der mittlere Ausgangswert-Signal und AF = FF 0. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bild des Perfusionssystem. Ein Ende der Röhre wird in 95% O 2/5% CO 2-Gas-p untergetauchterfused Lösung. Die Lösung wird dann durch das Rohr und der Badkammer durch eine peristaltische Pumpe (nicht dargestellt) perfundiert. Das andere Ende ist in die Lösung Einlass der Badkammer montiert auf einer Plattform eingefügt. Die Absaugspitze wird dann zu der Lösung Auslass der Kammer angeschlossen und auf einer Ebene zur Lösung Höhe zu bestimmen. Aus der Steckdose, ist die Absaugspitze mit der Vakuumleitung, welche die Lösung ansaugt aus der Kammer in einen Abfallbehälter verbunden ist. Die Perfusion wird aus dem Mikroskoptisch für visuelle Klarheit dargestellt.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Calcium Bildgebung SVZ Zellen verwendet wurde, um Muster in spontaner Aktivität in Neuroblasten 10, Rezeptorkanals Expression in beiden Neuroblasten und Astrozyten und 4,6,8 astrozytären Calciumwellen 3 studieren. Da Zellen in der SVZ entweder unreif sind oder glialen Eigenschaften, sie nicht feuern Aktionspotentiale 11,12, was bedeutet, dass Millisekunde Veränderungen in Spannungspotential indikativ Aktivität in reifen Netzen nicht anwendbar ist in dieser Region. Daher erfass...

<table border="1"><tbody><tr><td> Solute </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Dissection (mM) </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Dissection: 42 mM ACSF: 126 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Dissection: 4,33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Dissection: 1,33 mM ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Chemical Liste und Rezepte der Dissektion Lösung und ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [Header] </td></tr><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold oder 3M </td><td> Surehold 3G Super Glue oder 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Dissection Tools </td><td> Roboz oder Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 AM Calcium-sensitiven Farbstoffes </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-01.00 Calcium-sensitiven Farbstoffes </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 20% ige Lösung in DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Aufrechte Konfokalmikroskop </td><td> Olymp </td><td> FV300 oder FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> Wasser-Immersions-Objektive </td><td> Olymp </td><td> LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulatoren </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> Druckregler &lt;/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 PSI während der Anwendung </td></tr><tr><td> Pipette puller </td><td> Sutter oder Narshige </td><td> Sutter P-97 oder Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Glaspipetten </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> ID: 1,10, OD: 1,50 </td></tr><tr><td> Schlauchpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modell 720 </td><td> Fließgeschwindigkeit: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Chamber Bad </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 GLP </td><td> Low-Profil ermöglicht eine objektive Abstand </td></tr><tr><td> Rohr </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Materialien / Geräte Liste.

vorbereitung der akuten subventrikulärzone slices für calcium imaging

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Die subventrikulären Zone (SVZ) ist einer der beiden neurogenen Zonen in der postnatalen Gehirn. Die SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen mit astrozytären Funktionen (genannt SVZ Astrozyten), Neuroblasten und mittleren Vorläuferzellen. Neuroblasten in der SVZ geboren tangential migrieren eine große Entfernung zum Riechkolben, wo sie differenzieren sich in Interneuronen. Interzelluläre Signalisierung durch Adhäsionsmoleküle und diffusionsfähigen Signale spielen wichtige Rollen bei steuernden Neurogenese. Viele dieser Signale auslösen interzellulären Kalzium-Aktivität, die Informationen innerhalb und zwischen Zellen überträgt. Calcium-Aktivität ist deshalb reflektierenden der Aktivität von extrazellulären Signalen und ist eine optimale Möglichkeit, funktionelle interzellulären Signalisierung zwischen SVZ Zellen zu verstehen. Calcium-Aktivität wurde in vielen anderen Regionen und Zelltypen, einschließlich reife Astrozyten und Neuronen untersucht worden. Allerdings ist die traditionelle Methode, um load-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff (dh Badbelastung) war nicht beim Laden alle SVZ Zelltypen effizient. Tatsächlich schließt die Zelldichte in der SVZ Farbstoffdiffusion innerhalb des Gewebes. Darüber hinaus wird die Vorbereitung sagittalen Schnitten bessere Erhaltung der dreidimensionalen Anordnung SVZ Zellen, insbesondere der Strom der Neuroblast Migration auf dem rostralen-kaudalen Achse. Hier beschreiben wir Methoden, um Sagittalschnitten mit der SVZ, die Belastung der SVZ-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff und den Erwerb von Kalzium Aktivität mit Zeitraffer-Filme erstellen. Wir verwendeten Fluo-4 AM Farbstoff zum Laden SVZ Astrozyten unter Druck Anwendung innerhalb des Gewebes. Calcium-Aktivität wurde mit einem konfokalen Mikroskop ermöglicht eine genaue Auflösung zur Unterscheidung von einzelnen Zellen. Unser Ansatz ist auf andere Zonen einschließlich neurogener der erwachsenen hippocampalen subgranularen Zone und embryonalen neurogenen Zonen. Darüber hinaus können andere Arten von Farbstoffenunter Verwendung des beschriebenen Verfahrens werden.

Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

Die subventrikuläre Zone (SVZ) ist eine der zwei neurogenen Zonen im postnatalen Gehirn. Die SVZ enthält dicht gepackte Zellen, darunter neurale ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kalziumaktivität von Zellen in der postnatalen Subventrikularzone abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst vorsichtig das Gehirngewebe einer postnatalen Maus entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, lebende akute Gehirnschnitte herzustellen, die die Subventrikularzone enthalten. Anschließend werden die Gehirnschnitte mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff beladen. Der letzte Schritt besteht darin, die Aktivität mittels einer zeitraffenden konfokalen Mikroskopie abzubilden. Letztendlich dient die zeitraffende Aufnahme der Kalziumaktivität in Zellen der Ventrikelzone dazu, die dynamischen Vorgänge zwischen Zellen zu zeigen und Kommunikationsmuster zwischen verschiedenen Zelltypen sowie der Gefäßversorgung aufzudecken.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurogenese zu beantworten, beispielsweise wie verschiedene Zelltypen miteinander kommunizieren und wie Zellen die Gefäßversorgung beeinflussen können. Nach Tötung und Enthauptung eines P20 bis P30 jungen Mäuses gemäß institutionell genehmigten Richtlinien den Kopf in eine Schale mit Dissektionslösung legen. Den Kopf mit einer Pinzette fixieren und mit

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

Spontane Aktivitäten zu entwickeln neuronalen Netzen kann mit Hilfe AM-Ester Formen von Calcium-sensitiven Indikator Farbstoffe werden. Änderungen der intrazellulären Calcium, was darauf hinweist neuronale Aktivierung, werden als vorübergehende Veränderungen in Indikator Fluoreszenz mit ein-oder Zwei-Photonen-Imaging nachgewiesen werden. Dieses Protokoll kann für eine Reihe von entwicklungs-abhängige neuronale Netze angepasst...

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

In diesem Protokoll, aktualisieren wir die jüngsten Fortschritte in der Bildgebung...

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Dieses Video demonstriert ein Protokoll für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung und die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung in Hippocampus-Schnitten des Gehirns. Diese Methode ermöglicht es, die Dynamik lokaler Ca2+-Transienten (CaTs) in Dendriten verschiedener neuronaler Typen in akuten Hirnschnitten zu untersuchen.

Etablierung einer Ganzzellkonfiguration für die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung von Hirnschnitten

Es werden Verfahren beschrieben, um gleichzeitige Aufzeichnungen des Membranpotentials oder -stroms und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration durchzuführen. Neuronen des suprachiasmatischen Kerns werden mit dem Kalziumindikator Bis-Fura-2 unter Verwendung einer Patch-Clamp-Elektrode in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration gefüllt.

Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns

Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Erfahren Sie die Vorbereitung akuter Subventrikulärzone-Slices für Calcium-Imaging in postnatalen Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung zellulärer Aktivitätsdynamiken und interzellulärer Kommunikationsmuster in der Neurogenese.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

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