Name: Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent In Situ Hybridisierung (FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Erfahren Sie die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Analyse genetischer Transkription in einzelnen Zellen von Plasmodium falciparum. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion mehrerer var-Gene in infizierten Erythrozyten.

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Die Autoren bedanken sich bei Michael Alifrangis und Ulla Abildtrup zur Genotypisierung von Parasiten und Christina Holm für hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde vom Howard Hughes Medical Institute (Zuschuss 55.005.511), The Lundbeck Foundation (R9-A840) und durch die Niels Bohr Foundation finanziert.

Ein. Generation von Frisch gewählte infizierten Erythrozyten Für diesen Test werden die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn unter Verwendung von frisch ausgewählt Kulturen für Oberflächenexpression von PfEMP1 Protein. In diesem speziellen Experiment das 3D7 P. falciparum Linie gewählt wurde mittels spezifischer Antikörper wie zuvor 1 beschrieben. Tag 1 <ol><li> Ernte 200 ul verpackt Blutzellen aus einer P. falciparum Kultur enthaltend 2-5% Spätstadium IE durch Zentrifugation bei 800 × g für 8 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren das Blut Pellet in 2 ml 37 ° C warmes 0,75% Gelatine Lösung in einem 14 ml steriles Röhrchen und lassen für 15-20 min bei 37 ° C, um die nicht-infizierten und Ring-Stadium IE zu sedimentieren lassen. </li><li> Ernten die Late-Stage-IE, dh die obere Phase in ein neues 14 ml Tube und waschen zweimal mit 10 ml 37 ° C warmen RBC-wash Medien. </li><li> Verdünnen Sie 50 ul von spezifischen Anti-PfEMP1-Antikörpern in 2 ml 37 ° C warmen RBC-Waschmedium und Sterilfilter. </li><li> Mischen des gewaschenen Spätstadium IE mit der sterilisierten verdünnten Antiseren in einem 14 ml steriles Röhrchen und Inkubation 30 min bei 37 ° C unter vorsichtigem Rühren. </li><li> Spin-Down bei 800 xg für 8 min bei Raumtemperatur und waschen zweimal mit 10 ml 37 ° C warmen RBC-wash Medien. </li><li> Waschen 50 ul Dynabead Protein Eine Suspension zweimal mit RBC-wash Medien mit einem DynaMaq-15 Magnet. </li><li> Resuspendieren Dynabeads in 300 ul RBC-wash Medien und fügen Sie sie der gewaschenen späten Stadium IE. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C unter vorsichtigem Rühren. </li><li> Übertragen des Rohres mit dem DynaMaq-15-Magnet. Lassen Sie für 1-2 min und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit. </li><li> Resuspendieren Dynabeads in 4-5 ml RBC-wash Medien. Übertragen Sie den Schlauch wieder auf den Magneten und lassen Sie es für 1-2 min, bevor Sie die gesamte Flüssigkeit. Wiederholen Sie den Waschschritt einmal. </li><li> Übertragen Sie die gewaschenen Perlen zu einem 25 cm 2 sterile culture fLASK mit 200 ul frisch verpackt roten Blutkörperchen. Fügen Sie 5-6 ml Albumax Medien in der Kultur. Bewahren Sie über Nacht bei 5% CO 2 bei 37 ° C. </li></ol> Tag 2 <ol start="12"><li> Entfernen Sie die Dynabeads aus der Kultur, wenn der ausgewählte IE hat die frischen roten Blutkörperchen durch die Übertragung all der Kultur auf eine 14 ml steriles Röhrchen reinvaded. Setzen Sie den Schlauch auf den DynaMaq-15 Magneten und lassen für 1-2 min. Dann gießen Sie die gesamte Flüssigkeit zurück zu einer Kulturflasche. </li><li> Kultur für so wenige Zyklen wie möglich, bis einer Parasitämie von 5-10% und Parasiten sind in der ringstage. </li><li> IE sollte durch FACS analysiert werden, um sicherzustellen, dass die richtige Oberfläche Phänotyp, dh Protein Expression von entweder PFD1235w and/orPF11_0008 wurde 1 erhalten. </li></ol> 2. Herstellung von Sonden Die Antisense-RNA-Sonden wurden aus den variablen Regionen der PFD1235w und dem PF11_0008 var erzeugt &lt;/ Em&gt; Gene aus P. falciparum 3D7 genomischer DNA. DNA wurde durch PCR amplifiziert und in den Vektor pSPT18 oder 19 für die Transkription, jeweils gemäß der Beschreibung des Herstellers (Roche). Die Sonden (580 Basenpaare (bp) und 590 bp in der Länge) wurden mit Digoxigenin (DIG) oder Biotin markiert unter Verwendung eines DIG-RNA-Markierungskits oder einer RNA-Markierung Biotin-Mischung sind. Wir bestätigten die Spezifität der Sonden sowohl durch Northern Blot-Analysen und einfacher Bezeichnung FISH-Analyse 1. 3. Thin Smear und Fixierung der Parasiten Vor In-Situ-Hybridisierung Tag 1 Alle Schritte werden in einer RNase-freien Umgebung durchgeführt wird und alle Reagenzien sind RNase-frei oder mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) oder RNase Zap (Invitrogen) vorbehandelt. Die Objektträger und Deckgläser sollten mit Alkohol gereinigt werden, um restliche Fertigung Fett zu entfernen. Es ist wichtig, um das Protokoll ohne Pause zwischen den Schritten durchzuführenUm das Risiko einer Kontamination zu minimieren Nuklease. <ol><li> Machen Sie eine dünne Blutausstrich von der Norm Streumethode 3. Mit der 100x Öl Objektiv des Mikroskops, zählen die IE und berechnen den Anteil der IE in der Kultur. Prüfen, ob die Parasitenstadien in ungefährer Synchronität sind, in dem Ring und der frühen Stadien der Trophozoiten IE Zyklus. Dies sind die pre-Replikation, uni-nukleieren Stufen exprimieren var-mRNA und geeignet für einzelne Zelle FISH Transkriptionsassays dieses Typs. </li><li> Übertragen 50 ul des Parasiten Kultur bei einer Parasitämie von 5-10%, einem 1,5 ml RNase-freies Eppendorfröhrchen. Säule für 1 min bei 2.000 rpm bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die Medien und 50 ul PBS pH 7,2 in DEPC-behandeltem Wasser. Man schüttelt das Rohr vorsichtig. Wiederholen Sie den Zentrifugalsedimentation Schritt zweimal, um die Zellen frei von Medien und Zelltrümmer zu waschen. </li><li> Machen Sie vier gute Qualität dünne Abstriche. Für jeden Abstrich machen ein Abstrich aufein Durchmesser von 11 mm sowie einer 4 gut Rutsche, dh vier Glasobjektträger insgesamt in einem RNase-free Haube (ein kritischer Schritt). Welle gleitet kurz in die Luft zu trocknen. Make drei zusätzliche Folien für Negativkontrollen-one Rutsche für einzelne Sonde Färbung für jede andere irrelevant Gen durch Verwendung einer spezifischen Sonde, ein weiterer Schieber für RNase-Behandlung und einer dritten Folie mit IE nicht Expression des Gens von Interesse. Lassen Sie die Folien auf der Bank für 10-20 min trocknen. </li><li> Befestigen Sie die dünnen Schichten durch Zugabe von 60 ul der Fixierung Lösung mit 4% Paraformaldehyd und 5% Eisessig in die Vertiefungen. Lassen Sie für 10 Minuten auf der Bank bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen der Objektträger in 2x SSPE-Puffer für 5 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Entfernen Sie kurz die überschüssige Flüssigkeit durch Berühren die Brunnen, welche die Zellen vorsichtig mit einem Papiertuch. </li><li> Bedecken Sie die Folien mit 0,01% Pepsin in 0,01 M HCl für 2 min bei 37 ° C (ein äußerst wichtiger Schritt). Waschen der Objektträger in 2x SSPE, 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Verdünnt das RNase-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml. Bedecken Sie die negative Kontrolle Abstriche mit 60 ul der RNase-Lösung. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C und dann waschen Sie die Folien in 2x SSPE für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fahren Sie direkt mit der Hybridisierung. </li></ol> 4. Hybridisierung von RNA-Sonden auf Fixed Slides Tag 1 <ol><li> Bereiten Sie die Hybridisierung Kammer, wie ThermoStar 100 HC4 oder eine leere Pipettenspitzen-Kasten in einem sauberen Ofen geschoben, durch Bespritzen mit RNase Zap und Abwischen mit einem Papiertuch reinigen. Füllen der Kanäle der Hybridisierungskammer oder dem Boden der Schachtel mit DEPC-behandeltem Wasser, um sicherzustellen, daß die Schieber nicht austrocknet während der Hybridisierung. Schließen Sie die Kammer und Vorwärmung auf 48 ° C. </li><li> Verdünnt den Sonden in der Hybridisierungslösung bis zu einer Endkonzentration von 12 ng / ul. Denaturieren die Sonde Lösung bei 65 ° C für 5 min in einem Heizblock. Sofort auf Eis kühlen. </li><li> Kurz an der Luft trocknen die Folien nach der 2x SSPE waschen. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit rund um den Brunnen mit einem Papiertuch. </li><li> Öffnen Sie die Hybridisierung Kammer und legen Sie die Folien in der Kammer. Anwendung einer oder beide Sonden in einem Gesamtvolumen von 60 ul pro Vertiefung. Sorgfältig decken die Flüssigkeitstropfen mit einem RNase-free Deckglas mit einer sterilen Pinzette. </li><li> Schließen Sie die Kammer und hybridisieren die Folien bei 48 ° C für mindestens 16 Stunden über Nacht. </li></ol> 5. Antikörper Konjugation und Fluoreszenz Amplification Tag 2 Die folgenden Schritte werden auf der TSA Plus-Fluoreszenz Palette System von Perkin Elmer basiert. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. <ol><li> Waschen Sie die Slides 3 mal in TNT-Puffer für 5 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Blockieren Sie den Brunnen in 150 ul TNB-Puffer für 30 min. </li><li> Verdünnt das HRP-konjugiertem α-DIG Antikörpers in TNB-Puffer in einem Verhältnis von 1:100 und das HRP-konjugiertem α-Biotin-Antikörper in TNB-Puffer, in einem Verhältnis von 1:500. Entfernen Sie überschüssiges TNB-Puffer von den Dias mit einem Papiertuch. Bei der Erfassung zwei Transkripte gleichzeitig können beide Antikörper auf einmal zu gehen. Tragen Sie eine Gesamtmenge von 100 ul des Antikörper-TNB-Lösung pro Well und vorsichtig mit einem Deckglas abdecken. Inkubieren Sie die Objektträger für 2 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig. Waschen der Objektträger in TNT-Puffer 3-mal für 5 min. </li><li> Verdünnt das FITC-Fluorophor in der Tyramid Amplifikationsreagens in einem Verhältnis von 1:500 und anzuwenden 100 ul der Lösung in jede Vertiefung. Bedecken Sie die Wells mit Deckgläsern und inkubieren für 12 min. </li><li> Entfernen Sie den Deckel rutscht sorgfältig waschen und die Folien 3 mal für 5 min in TNT-Puffer durch vorsichtiges Schütteln. </li><li> Verdünnt das Cyan3-Fluorophors in der Tyramid Amplifikationsreagens in einem Verhältnis von 1:500. Fügen Sie 100 ul proauch dieser Lösung. Bedecken Sie die Wells mit Deckgläsern und inkubieren für 12 min. </li><li> Entfernen Sie den Deckel rutscht vorsichtig und dann spülen Sie die Folien schnell durch Eintauchen in TNT-Puffer. </li><li> Waschen Sie die Slides 3 mal mit TNT-Puffer für 5 min. </li><li> Eintauchen der Objektträger schnell in DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen. Montieren Sie die Folien mit Anti-Fade Reagenz DAPI. Verschließen Sie die Ecken der Deckgläser mit Nagellack. </li><li> Die Folien sind nun bereit für die Mikroskopie. Halten Sie die Folien mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C abgedeckt, wenn das Experiment abgeschlossen am nächsten Tag ist. Eine vollständige Abdichtung der Seiten der Folien kann werden 24 Stunden nach dem Aufbringen des Anti-Fade-Reagens durchgeführt wird. Dadurch können die Folien für abgebildet werden bis zu einer Woche nachdem das Protokoll abgeschlossen ist. </li></ol> 6. Visualisierung der hybridisierten Sonden <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop. Ein Standard Immunfluoreszenzmikroskop ist sufficient für diese Art von Experiment, aber wenn Sie Zugang zu einem konfokalen Mikroskop haben, können Sie dieses auch verwenden, für 3D-Bilder oder Videos von Ihrem gefärbten Zellen zu erhalten. Lassen Mikroskop zum Aufwärmen für 15-30 min. Schalten Sie den Computer und die Software. </li><li> Prüfen Sie die Qualität der Färbung auf der Immunfluoreszenzmikroskop. Wählen Sie einen Ort mit ein paar Parasiten. </li><li> Passen Sie die Verstärkung jedes Laser manuell. Passen Sie die Pixel zu 4-6 m -1 s -1 und die Schritte zu 512 x 512 Pixel wohnen. </li><li> Nehmen Sie ein Testbild mit Frame Lambda. Stellen Sie die Laserverstärkung. </li><li> Nehmen Sie ein Minimum von 20 gute Bilder von fluoreszierenden Einzelzellen. Mindestens 2-5 Bilder eines Feldes mit 5-20 Parasiten notwendig sind, um eine faire Überblick über den Prozentsatz an positiven Parasiten erhalten. </li></ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
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<li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

FISH-Analyse RNA im Gegensatz zu Verfahren, wie Northern Blot und RT-PCR, erlaubt die Diskriminierung von spezifischen mRNA-Transkripte in der einzelnen Zelle. Dies macht es möglich, zwischen transkriptionell aktiven und inaktiven Zellen zu unterscheiden, in diesem Beispiel, P. parasitischen Protozoen falciparum in menschlichen roten Blutzellen. Solche whole-cell Beobachtungen sind oft notwendig und kann zu entwirren wichtige und neuartige transkriptionellen Mustern ein. <p class="jove_c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338.826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax Medien: RPMI 1640 Glutamin-Lösung </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml Glutamin-Lösung </td></tr><tr><td> Albumax Medien: Gentamycinsulfat Albumax-Lösung </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml Gentamicinsulfat 50 ml Albumax-Lösung </td></tr><tr><td> Albumax-Lösung: Hypoxanthine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g Hypoxanthine </td></tr><tr><td> Albumax-Lösung: AlbuMAX II </td><td> Ichnvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-Lösung: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 Liter RPMI 1640 Auflösen mit Magneten an max. 50 ° C. Filtern sterilisieren und bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Resin zu Formamid entionisieren. </td></tr><tr><td> Anti-Biotin Ziege pAb Peroxidase Konjugat </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Dig-Antikörper </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fade Reagenz mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Die Montage media hat für 24 h vor dem Versiegeln die Folie vollständig zu heilen. </td></tr><tr><td> Biotin RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Kamera digital </td><td> Nikon digitale Anblick DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Menzel-glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> Kulturflasche 25 cm 2 Nunclon Oberfläche </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32.490-100ml </td><td> 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized Wasser. Schreibe einen Rührstab und rühren für 12 Stunden. Autoklaven für 30 min. </td></tr><tr><td> Digitalkamera </td><td> Nikon digitale Anblick DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads Protein A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Magnet </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formamid bioultra 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47.671-1l-F </td><td> Deionisiertes Formamid: 5 g Ionenaustauscherharz pro 100 ml Formamid. Stir 30 min. Anschließend wird durch Whatman-Papier. </td></tr><tr><td> . Gelatine 0 75% ige Lösung: Gelatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g Gelatine in 500 ml RPMI 1640. Wärme auf 56 ° C zu lösen. Filtern sterilisieren, wenn 56 ° C. Lagerung bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> . Gelatine 0 75% ige Lösung: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g Gelatine in 500 ml RPMI 1640. Wärme auf 56 ° C zu lösen. Filtern sterilisieren, wenn 56 ° C. Lagerung bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Glutamin-Lösung: L-Glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L Glutamin in 500 ml 0,9% NaCl. Auflösen, Filter sterilize und bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Glutamin-Lösung: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L Glutamin in 500 ml 0,9% NaCl. Auflösen, filtern sterilisieren und bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Hybridisierungslösung: Formamid Bio Ultra 99% SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47.671-1l-F </td><td> Insgesamt 20 ml, halten gefroren bei -20 ° C in Aliquots 10 ml entionisiertem Formamid </td></tr><tr><td> Hybridisierungslösung: Denhardts 50x Konzentrat </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20 × SSC </td></tr><tr><td> Hybridisierungslösung: Hefe tRNARoche Blockierungsreagenz </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt 250 ul 20 mg pro ml Hefe tRNA </td></tr><tr><td><sTrong&gt; Hybridisierungslösung: Lachs-Sperma-DNA </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31.149-106GF </td><td> 0.4g Roche Blockierungsreagenz 1 ml von 10 mg pro ml Lachssperma-DNA (Critical: denaturieren Lachs spermDNA bei 96 ° C für 5 min vor Zugabe zu der Hybridisierungslösung) </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Kann durch Hybridisierung Backofen und RNase-frei Hybridisierung Kammern mit DEPC-Wasser aufgefüllt ersetzt werden. </td></tr><tr><td> Immersionsöl UV transparent fluoreszenzfrei </td><td> Sigma </td><td> 10.976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Immunfluoreszenz oder Konfokalmikroskop </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nagellack </td><td> Erhältlich in der Apotheke </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionisiertem H 2 O </td><td></td><td></td><td> Ajust pH auf 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA in 80 ml PBS / DEPC. Wärme auf 65 ° C, bis die PFA auflöst. 20 ml PBS, dass die Lösung abkühlen. Den pH-Wert auf 7,4. Filtern. Store in Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd 4% / Acid Essigsäure 5% </td><td></td><td></td><td> 950 ul Paraformaldehyd + 50 ul Essigsäure </td></tr><tr><td> Pepsin </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Peroxidase-konjugiertes anti-Biotin </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-wash Medien: RPMI 1640 Glutamin-Lösung </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640-Lösung 5 ml Glutamin </td></tr><tr><td> RBC-wash Medien: Gentamycin-Sulfat </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml Gentamicinsulfat </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Machen Sie eine 10 mg / ml Stammlösung. </td></tr><tr><td> RNase freies 1,5 ml Tube </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Gleitet 4 Vertiefungen 11mm </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3-Citrat x H 2 O (88 g / l) auf pH 7,0 einstellen mit 1M HCl </td></tr><tr><td> SSC 20x: Natriumcitrat Dihydrat </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3-Citrat x H 2 O (88 g / l) auf pH 7,0 einstellen mit 1M HCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA-Pulver </td><td></td><td></td><td> 9,4 g EDTA-Pulver Fügen DEPC Wasser, pH-Einstellung 7,4. Autospaltete für 20 min </td></tr><tr><td> TNB-Puffer: TNT-Puffer </td><td></td><td></td><td> 10 ml TNT-Puffer </td></tr><tr><td> TNB-Puffer: Blockierungsreagenz </td><td></td><td></td><td> 0.05g Blockierungsreagenz Um das Blockierungsreagenz aufzulösen, erhitzen der Lösung auf 60 ° C für eine Stunde unter Rühren. Lagerung bei -20 ° C. (Abgeleitet von der Firma Perkin Elmer TSA-Protokoll.) </td></tr><tr><td> TNT-Puffer: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1 M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT-Puffer: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT Puffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml PH-Wert auf 7,5 bei Raumtemperatur. (Abgeleitet von der Firma Perkin Elmer TSA-Protokoll.) </td></tr><tr><td> TSA sowie Cyanine3 / Fluorescein-System </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Lesen Sie das Protokoll aus der TSA Plus-Fluoreszenz Palette Systems sorgfältig durch, bevor das Experiment. </td></tr><tr><td> Tubes 14 ml sterile </td><td> Almeco - CM LAB Aps </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von einzel-zell-gene transkription durch rna-fluorescent<em&gt; in situ</em&gt; hybridisierung (fish)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhäsion von Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten (IE) für die menschliche endotheliale Rezeptoren bei Malaria-Infektionen durch Expression PfEMP1 Protein-Varianten durch die Gene kodiert var vermittelt. Die haploiden P. falciparum Genoms beherbergt etwa 60 verschiedene Gene var von denen nur eine geglaubt hat, die pro Zelle zu einem Zeitpunkt während des Blut Stadium der Infektion transkribiert. Wie solche gegenseitig ausschließenden Regulierung der Gentranskription var erreicht ist unklar, da die Identifizierung einzelner Gene oder var Untergruppen von var Gene mit verschiedenen Rezeptoren und die Folge der unterschiedlichen Bindung auf das klinische Ergebnis von P. zugeordneten falciparum-Infektionen. Vor kurzem hat die gegenseitig ausschließende Transkription Paradigma in Zweifel durch Transkription Assays auf Basis einzelner P. aufgerufen falciparum transcript Identifikation in einzelnen infektiert erythrozytären Zellen unter Verwendung von RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von var Gentranskription durch den Parasiten im einzelnen Kerne von P. falciparum IE 1. Wir beschreiben hier ein ausführliches Protokoll zur Durchführung des RNA-FISH-Methodik zur Analyse von var Gentranskription in Einzel-Kerne von P. falciparum infiziert menschliche Erythrozyten. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von Digoxigenin-Basis und Biotin-markierte Antisense-RNA-Sonden unter Verwendung der Fluoreszenz-Plus-TSA Palette System 2 (Perkin Elmer), mikroskopische Analysen und frisch ausgewählt P. falciparum IE. Die in situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, um Transkription und Regulation einer Vielzahl von Genen in den verschiedenen Phasen des P. ausgedrückt überwachen falciparum Lebenszyklus und ist anpassungsfähig an andere Malaria-Parasiten Arten und anderen Organismen und Zelltypen.

Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der wichtigsten Schritte und der Zeitdauer der RNA FISH Methodik. Eine Reihe von repräsentativen Bildern von gut und schlecht erhaltenen gefärbten mRNA FISH-Experimente mit einzelnen P. falciparum IE sind in Abbildung 2 gezeigt. Diese intrazellulären Protozoen hat einen kleinen (1-1.5 Mikrometer Durchmesser) Kern, blau gefärbt mit DAPI wird. Vierundzwanzig Stunden nach Erythrozyten Invasion im P. falciparum</e...

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) auf mRNA-Transkripte in den einzelnen Zellen zu identifizieren ermöglicht die Analyse von polygenen Tätigkeit wie die gleichzeitige Transkription von mehr als einem Mitglied der<em&gt; Var</em&gt; Multigenfamilie in<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Infizierten Erythrozyten<sup&gt; 1</sup&gt;. Die Technik ist anpassbar und kann bei verschiedenen Arten von Genen, Zellen und Organismen verwendet werden.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Die Adhäsion von mit Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten (IE) an menschlichen endothelialen Rezeptoren während Malaria-Infektionen wird durch die Expression von PfEMP1-Proteinvarianten vermittelt, die durch die var-Gene kodiert werden. Das haploide P. falciparum-Genom enthält etwa 60 verschiedene var-Gene, von denen bisher angenommen wurde, dass während der Blutstufe der Infektion pro Zelle jeweils nur eines transkribiert wird. Es ist unklar, wie eine solche gegenseitig ausschließende Regulation der var-Gen-Transkription erreicht wird, ebenso wie die Identifizierung einzelner var-Gene oder Untergruppen von var-Genen, die mit verschiedenen Rezeptoren assoziiert sind, und die Auswirkungen einer differenziellen Bindung auf den klinischen Verlauf von P. falciparum-Infektionen. Kürzlich wurde das Paradigma der gegenseitig ausschließenden Transkription durch Transkriptionsanalysen in Frage gestellt, die auf der Identifizierung einzelner P. falciparum-Transkripte in einzelnen infizierten erythrozytären Zellen mittels RNA-fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (FISH) zur Analyse der var-Gen-Transkription durch den Parasiten in einzelnen Kernen von P. falciparum IE basieren. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung der RNA-FISH-Methodik für die Analyse der var-Gen-Transkription in Einzelkernen von mit P. falciparum infizierten menschlichen Erythrozyten. Die Methode basiert auf der Verwendung von Digoxigenin- und Biotin-markierten Antisense-RNA-Sonden unter Verwendung des TSA Plus Fluorescence Palette System (Perkin Elmer), mikroskopischen Analysen und frisch selektierten P. falciparum IE. Die In-situ-Hybridisierungsmethode kann zur Überwachung der Transkription und Regulation einer Vielzahl von Genen verwendet werden, die während der verschiedenen Stadien des P. falciparum-Lebenszyklus exprimiert werden, und ist auf andere Malaria-Parasitenspezies sowie andere Organismen und Zelltypen übertragbar.

Mein Name ist Elena Rand und ich arbeite am Zentrum für Medizinische Pathologie der Universität Kopenhagen in Dänemark. Hier arbeiten etwa 60 Personen aus verschiedenen Teilen der Welt mit Malaria. Unsere Gruppe beschäftigt sich mit Plasmodium-Foci, Parasiten.Sie sind die aggressivsten Erreger, die bei Menschen die Malariaerkrankung verursachen. Foci-Zellen exprimieren Oberflächenproteine mit verschiedenen Funktionen, wie beispielsweise die Adhäsion an Wirtszellen. Die größte Gruppe der Adhäsionsproteine sind die sogenannten *Plasmodium falciparum*-Erythrozytenmembranproteine vom Typ eins, kurz PfEMP1.Es gibt mindestens 60 Varianten, von denen bisher angenommen wurde, dass zu einem gegebenen Zeitpunkt während des Blutstadiums der Infektion jeweils nur eine in der Zelle transkribiert wird. An unserer Abteilung gehen wir davon aus, dass in den Parasiten gleichzeitig mehr als ein Protein transkribiert werden kann. Eine Methode, um eine solche Aktivität nachzuweisen, ist die mRNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH).Hier stellen wir eine maßgeschneiderte Methode zur Detektion von mRNA-Transkripten zweier verschiedener Gene im einzelnen Nukleoid von mit odum FCI infizierten Erythrozyten vor. Die Methode erfordert zwei Tage zur Durchführung. Am ersten Tag erfolgt die Herstellung von RNA-Sonden, deren Zugabe zu den fixierten Parasiten auf Objektträgern und die Hybridisierung über Nacht.Der zweite Tag umfasst die Antikörperkonzentration, die Fluor-Verstärkung und die Visualisierung der gefärbten Parasiten im konfokalen Mikroskop. Um einen Überblick über das Experiment zu geben, wird ein Flussdiagramm der Operationen zusammen mit den kritischen Reagenzien und Materialien gezeigt, die im Experiment verwendet wurden. RNAs zap dig Markierungskit Biotin, RNA-Markierungsmix, Paraformaldehyd, essigsäure (glacial), Pepin Anti-dig-Antikörper, Anti-Biotin-Antikörper, TSA PL Plus-Fluoreszenzfarbsystem, DPI-RNAs, freie Mikroröhrchen, ETH-Ethanol, abgewischte Objektträger, autoklavierte Deckgläser, sterile Geräte wie Scheren und Pinzetten, ein Kopplungsglasgefäß.Die infizierten Erythrozyten müssen durch fortlaufende Beobachtung überprüft werden, um sicherzustellen, dass sie sich im richtigen Entwicklungsstadium befinden, d. h. die VAR-transkribierenden Ringstadien synchron und in gutem Zustand sind. Es ist entscheidend, den exakten Entwicklungsstadium des Lebenszyklus auszuwählen, in dem die Transkription stattfindet.Da einzelne RNA-Arten zeitlich gestaffelt, spezifisch transkribiert und rasch abgebaut werden, sollten die Zellen vorsichtig gewaschen werden, bevor hochwertige, dünne Blutpräparate auf sauberen Objektträgern angefertigt werden. Eine gleichmäßige monolayerartige Schicht infizierter roter Blutkörperchen auf dem Objektträger wird dann 10 Minuten lang in einer Lösung aus 4 % Paraformaldehyd und 5 % Essigsäure fixiert. Anschließend werden die Objektträger zweimal mit PBS gewaschen und die Flüssigkeit vorsichtig mit einem Tuch von den Objektträgern entfernt. Danach werden die Zellen mit einer vorgewärmten 10-Millimolar-Salzsäurelösung permeabilisiert, bevor das Pepsi hinzugefügt wird.Inkubieren Sie dies vor der Hybridisierung zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Die Sonden werden fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius denaturiert, schnell auf Eis abgekühlt und anschließend den Zellen zugegeben, die nun auf dem Objektträger fixiert sind. Legen Sie ein Deckglas auf die Zellen und entfernen Sie Luftblasen mit einer kleinen Pipettenspitze. Befeuchten Sie die Hybridisierungskammer, indem Sie Tropfen doppelt destilliertes Wasser am Rand der Kammer hinzufügen, damit die Objektträger in der Kammer feucht bleiben.Während des Hybridisierungsverfahrens werden die Objektträger in die Kammer gegeben und über Nacht bei 48 Grad Celsius hybridisiert. Nach 16 bis 17 Stunden Hybridisierung werden die Objektträger vorsichtig aus der Hybridisierungskammer entfernt. Ab diesem Schritt besteht keine absolute Notwendigkeit mehr für eine RNase-freie Umgebung.Waschen Sie die Objektträger in einem Glasbehälter mit TNT-Puffer, wobei sichergestellt werden muss, dass die Deckgläser sich von dem Objektträger lösen. Wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal, anschließend blockieren Sie sie für eine halbe Stunde im TNB-Puffer. Geben Sie die mit HRP konjugierten Anti-Dig- oder Anti-Biotin-markierten Antikörper zu den Zellen. Beide Arten markierter Antikörper können gleichzeitig hinzugefügt werden. Wenn das Experiment darauf abzielt, zwei mRNA-Transkripte in den Zellen nachzuweisen, sollten die Antikörper vorverdünnt werden. In TNB-Puffer eine bis zwei Stunden inkubieren, dreimal mit TNT-Puffer waschen und dann einem der gewaschenen Zellen einen Fluorochrom, verdünntes FSE oder Cyan, hinzufügen.Drei Lösungen müssen frisch hergestellt werden. Ab diesem Schritt ist es wichtig, die Objektträger nicht direkt starkem Licht auszusetzen. Inkubieren Sie die Glasobjektträger 10 bis 15 Minuten mit dem Fluorochrom.Wenn zwei mRNA-Transkripte nach der ersten Inkubation detektiert werden sollen, spülen Sie den ersten Farbstoff aus und geben Sie den zweiten hinzu. Führen Sie eine abschließende Wäsche in TNT-Puffer durch. Tauchen Sie die Objektträger vor dem Lufttrocknen in doppelt destilliertes Wasser ein.Fügen Sie den Dappy hinzu und legen Sie einen Deckgläser auf die Objektträger. Entfernen Sie eventuelle Luftblasen und versiegeln Sie die Ränder des Deckgläschens mit schnell trocknendem Nagellack. Hier sehen wir einen einzelnen infizierten Erythrozyten, der einen Parasiten enthält.Das Blau zeigt die DNS des Parasiten, und das Grün stellt die mRNA eines transkribierten Gens dar. In der anderen Aufnahme repräsentiert die rote Farbe die mRNA eines weiteren Gens, und in der dritten Aufnahme ist die Doppelfärbung beider Gen-Transkripte sichtbar. Die Bilder zeigen außerdem, dass die angehefteten mRNAs mit der kerngebundenen DNS überlagert sind und nicht generell darüber oder daneben liegen.In 99 % der infizierten Erythrozyten können wir die mRNA von zwei Genen nachweisen, die transkribiert werden. Ein wichtiger Aspekt dieses Experiments besteht darin, zu überprüfen, dass die Sonden nicht an andere Gene binden. In diesem Bild haben wir die infizierten Erythrozyten mit beiden Sonden inkubiert, aber nur eine Sonde erkennt ein exprimiertes IE. Die anderen Gene werden hier nicht transkribiert.Diese Situation ist bei diesen anderen Bildern der sichtbaren infizierten Erythrozyten umgekehrt. Die Plasmodium falciparum-Parasiten weisen im Allgemeinen gut erhaltene Membranen auf, mit klar definierter Färbung sowohl von DNA als auch von RNA. Falls die Zellen aus irgendeinem Grund von schlechter Qualität sind, wird auch die Färbung schlecht ausfallen.Wie in diesem Bild gezeigt, erscheinen die DNA und die RNA diffus, trüb und relativ undefiniert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode leicht auf andere blutübertragene Parasiten angewendet werden kann. Unsere Transkriptionsdaten wurden zudem durch Experimente bestätigt, bei denen die translatierten Proteine aus den analysierten mRNAs mithilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen wurden, die gegen die auf der Oberfläche exprimierten PfEMP1-Proteine infizierter Zellen gerichtet sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Durch die Kombination von Methoden zur RNA whole...

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Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt den Nachweis von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung innerhalb der Zellen. Wir beschreiben ein Protokoll für den kombinierten, gleichzeitigen Nachweis von RNA und DNA mit Hilfe von FISH, die verwendet werden können, um X-Chromosom Inaktivierung in embryonalen Maus-Stammzellen zu untersuchen.

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Trophoblasten-Riesenzellen (TGCs) spielen eine Schlüsselrolle in der Plazenta, um eine gesunde Schwangerschaft zu gewährleisten. Wir stellen ein Protokoll zur Beurteilung des transkriptionellen Status von Genen in TGCs durch naszierende fluoreszierende in situ-Hybridisierung an Kryostatenschnitten von postimplantierten Embryonen oder Kurzzeitkulturen von embryonalen Tag-7-Ektoplazentären Zapfen vor.

Transkriptions-Analyse von RNA Nascent FISH<em&gt; In Vivo</em&gt; Trophoblast-Riesenzellen oder<em&gt; In Vitro</em&gt; Kurzfristige Kulturen von Ectoplacental Cone Explantate

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

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Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

Die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine Methode zur genauen Quantifizierung der Konzentrationen und Lokalisierung spezifischer RNAs auf Einzelzellebene. Hier berichten wir über unsere validierten Laborprotokolle für die Nasstischverarbeitung, Bildgebung und Bildanalyse zur Einzelzellquantifizierung spezifischer RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

Erfahren Sie die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Analyse genetischer Transkription in einzelnen Zellen von Plasmodium falciparum. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion mehrerer var-Gene in infizierten Erythrozyten.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent

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