Name: Genomic Transformation des Picoeukaryote Ostreococcus tauri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Lernen Sie die genetische Transformation von Ostreococcus tauri durch Elektroporation. Diese Methode ermöglicht stabile transgene Linien für die Pflanzenbiologieforschung.

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SynthSys ein Zentrum für Integrative Systems Biology von BBSRC und EPSRC Auszeichnung D019621 finanziert. EU FP6 Network of Excellence &quot;Marine Genomics&quot; Zuschuss an FYB hat die Entwicklung der genetischen Transformation Methoden finanziert.

1. Vorbereitung der Algenmaterial <ol><li> Ostreococcus Zellen werden in künstlichem Meerwasser (ASW) kultiviert. Meersalz (typischerweise etwa 40 Gramm pro Liter) in entionisiertem Wasser auf einen Salzgehalt von 30 ppt gelöst, wie unter Verwendung eines Salzgehalt Meter. Anreicherungsmedium 11,12, Spurenelemente und Vitamine Metall-Elemente hinzugefügt werden, wie in den Tabellen 1-3 beschrieben. Das Medium wird dann steril filtriert durch ein 0,22 um-Filter. </li><li> Für die Wartung sind die Zellen des Stammes Ostreococcus OTTH95 subkultiviert aseptisch in einer Verdünnung von 1/100 in frischen ASW alle 7 Tage und aufgewachsen unter konstanten Licht in einem Inkubator mit Pflanzenwachstum Moonlight Blue Filter ausgestattet. Die Lichtintensität sollte in der Nähe 20 pmol m -2 s -1 sein und die Temperatur wird bei 20 ° C gehalten Die Zellen müssen nicht ständigem Rühren, aber geschüttelt einmal alle 2 bis 3 Tagen Aggregation zu verhindern. </li><li> Für jede Transformation werden 50 ml der Zellen in einer Zelle erforderlich density von 20-30 x 10 6 ml -1, was erreicht 5-7 Tagen sollte nach Subkultivierung werden. Ungefähre Zelldichte und axeny kann unter Verwendung entweder Durchflusszytometrie oder eines Hämozytometers bei einem Minimum von x40 Vergrößerung werden. </li></ol> 2. Die Elektroporation <ol><li> Planen DNA für die Transformation. Für jede Transformation wird 5 ug der reinen, linearisierte Plasmid-DNA in einer Konzentration von 1 ug / ul in sterilem deionisiertem Wasser erforderlich. Um diese DNA zu erhalten, empfehlen die Autoren unter Verwendung eines Qiagen Midi-Prep-Kit, obwohl auch andere Methoden gleich gut funktionieren könnte. Verdau des Produkts mit einem Enzym, das in der Hauptkette des verwendeten Vektors schneidet, aber nicht in das Transgen oder Selektionsgen. Weiter zu reinigen und konzentrieren die resultierende lineare DNA durch Ethanolfällung, und resuspendieren Sie das Produkt in einem geeigneten Volumen an hochwertigen steriles entionisiertes Wasser. </li><li> Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen mit 5 ug DNA für jede Transformation. Ein control, ohne DNA, die für jede Zelllinie transformiert werden. Bewahren Sie diese Röhrchen auf Eis, zusammen mit einem 2 mm Elektroporationsküvette für jede Transformation. </li><li> Bereiten Sie 2,2 ml pro Resuspensionspuffer Transformation. Auflösen Sorbit zu einer 1 M Lösung in ddH 2 O, fügen Sie 0,1% Pluronsäure F68 und Filter-sterilisiert werden. </li><li> In Pluronsäure F68, bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zu den Zellen, und das Pellet sie für 10 Minuten bei 8000x g bei 10 ° C in einem 50 ml-Röhrchen mit konischem Boden. Sofort die Zellen in 1 ml Resuspensionspuffer durch Auf-und Abpipettieren und Transfer zu einem Mikrozentrifugenröhrchen. Lysat für 10 Minuten bei 8000 xg bei 10 ° C, und arbeitet schnell, wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal waschen. </li><li> Bei einem Cut Spitze, Resuspendieren jedes fertige Pellet in 40 ul Resuspensionspuffer. In 40 ul der resuspendierten Zellen in jedes Röhrchen von linearisierter DNA auf Eis, vorsichtig mischen und Transfer zum Elektroporationsküvette. </li><li> Setzen Sie die Küvette in den electropRede Maschine. Ändern Sie die Einstellungen zu 6 kV cm -1, 600 Ω und 25 uF. Die Zellen zu elektroporieren. </li><li> Inkubieren der Zellen in den electoporated Küvetten bei Raumtemperatur für 10 Minuten, und diese Zeit nutzen, um die Gewebekulturflaschen herzustellen. Beschriften Sie sie und fügen Sie 30 ml frisches ASW zu jedem. Nehmen Sie 1 ml aus jedem Kolben und fügen Sie es sanft auf die entsprechende Küvette. Inkubieren Sie für 2 Minuten und entfernen Sie vorsichtig die ASW, jetzt mit der Kugel von Zellen und langsam und vorsichtig direkt Pipette in die ASW in der Kulturflasche. </li><li> Die Zellen bleiben in der Regel in einer Kugel. Achten Sie darauf, schütteln oder stören die aggregierten Zellen in diesem Moment. Lassen Sie die Zellen in den Inkubator für 1-2 Stunden erholen, dann durch Schütteln der Kolben zu resuspendieren. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen zu resuspendieren und frei keine Klumpen sichtbar sein soll. Lassen Sie die Kulturen sich zu erholen im Inkubator über Nacht. </li></ol> 3. Aufnahme von Zellen auf Platten in halbfesten Medium <ol><li&gt; Am nächsten Tag autoklavieren eine Lösung von 2,1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in ddH 2 O in einer Flasche mit einem Rührstab. Halten Sie bei 65-90 ° C geschmolzen in einem größeren Becherglas mit Wasser auf der Heizung Magnetrührer. Für jede Transformation vorzubereiten 8 Petrischalen (55 mm Durchmesser) und 8 x 15 ml Tuben mit je 9 ml ASW sowie die gewünschte Auswahl. Bei Verwendung Nourseothricin oder G418, verwenden Sie 2 mg / ml. </li><li> Sammeln Sie die transformierten Zellen aus dem Inkubator. Arbeiten in einer sterilen Flowhood, 1 ml kochendem LMP-Agarose auf die 9 ml in einem der Rohre. Schließen Sie den Schlauch, und mischen durch Invertieren. Dann fügen Sie 0,5 ml frisch transformierten Zellen, schnell mischen und in die Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen 7 Röhren und dann gehen Sie zum nächsten Transformation Kolben. </li><li> Lassen Sie die Platten öffnen in der Strömung Haube für eine Stunde, für die Agarose zu setzen. Schließen Sie dann die Platten und übertragen Sie sie auf großen quadratischen Petrischalen, die mit 4 Platten, die jeweils halten wird. Verschließen Sie den quadratischen Platten with Parafilm. Beachten Sie, dass die Platten nicht vollständig eingestellt, und als Ergebnis ist das Gel sehr zerbrechlich. Darauf zu achten, um das Gel zu brechen beim Umgang mit den Platten sein. Legen Sie alle quadratischen Platten im Brutschrank. </li></ol> 4. Die Selektion von transformierten Kolonien <ol><li> Kolonien sollten nach 10 bis 21 Tagen auf den Platten Transformation, nicht aber auf den Mock-Platten verwandelt erscheinen. Zur Aufnahme Kolonien mit einem 200 ul Pipette mit abgeschnittenen Spitzen. Wählen Sie einfach kostenlos Kolonien und saugen Sie die grüne Kolonie. Achten Sie darauf, dass keine Zellen aus benachbarten Kolonien gehören. </li><li> Übertragen der Zellen zu 2 ml der flüssigen Medium, das die Auswahl, in einer 24 Vertiefungen Platte. Bei der Verwendung von Nourseothricin, verwenden Sie 1,75 mg / ml. Mischen Sie durch Auf-und Abpipettieren. Wählen Sie 24-50 Kolonien pro Transformation. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm und Transfer in den Inkubator. </li><li> Nach einer Woche, dann 100 ul jeder gut bis 2 ml frisch ASW mit Auswahl in einer 24 well-Platte und wachsen für eine additional 7 Tage. Hinterbliebener Zelllinien können für weitere Untersuchungen verwendet werden. Stabile Integration in das Genom und Insertion-Nummer sollte mittels PCR und Southern-Blot werden. Genomische DNA kann für diese Zwecke mit einem beliebigen herunterskalierten Standardmethode für Pflanzen-DNA-Extraktion erhalten werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Zellen aufgeteilt 1/100 erreicht eine Dichte von 25 Millionen Zellen pro Milliliter nach wachsender für 7 Tage. Die Elektroporation der Zellen mit den entsprechenden Einstellungen in Folge einer Zeitkonstante zwischen 10 und 14 Millisekunden. Wenn Zellen auf Medium in Kulturflaschen übertragen werden, sollte eine Kugel von Zellen zu bilden. Als nach einer Stunde leicht geschüttelt, sollten die Zellen leicht zu resuspendieren. Die Aufnahme von 1 ml transformierten Zellen in 0,2% LMP-Agar sollten in einem durchgängig, sondern nur halbfestes Gel führen. Kolonien sollten nach 10 bis 21 Tagen erscheinen. Bei der Umwandlung von 5 ug linearisierte DNA unter Verwendung des Protokolls oben, 50-100 Kolonien pro TransformationPlatte wurden in der Regel erwartet, im Vergleich zu keiner auf die negative Kontrolle Platten. ~ 80% der Kolonien wurden gepickt positiv Antibiotikaresistenz in einem flüssigen Medium ausgewählt und in nachfolgenden Studien verwendet. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endkonzentration </td><td> Stammlösung </td><td> Volumen für 1 Liter </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3,63 x 10 -5 m </td><td> 2,68 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> β-Glycerophosphat </td><td> 1 × 10 -5 M </td><td> 2,16 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tris-Base (pH 7,2) </td><td> 1 × 10 -3 M </td><td> 121,1 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> K Spurenmetallösung </td><td></td><td> Tabelle 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> f / 2 Vitamin-Lösung </td><td></td><td> Tabelle 3 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Mittlere Bestandteile für das Wachstum von O. Tauri 11, 12. Make up mit einem Gesamtvolumen von 1 Liter künstlichem Meerwasser zu einem Salzgehalt von 30 ppt, und fügen Sie die oben genannten Komponenten aus Stammlösungen wie angegeben. Filter-Sterilisation des Mediums und den Einsatz innerhalb einer Woche. Die Bestände an allen Verbindungen mit Ausnahme des Vitamin-Lösung können gebündelt bis 6 ml dieser Lösung für jeden Liter Medium hinzuzufügen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endkonzentration </td><td> Stammlösung </td><td> Menge für 1 Liter </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 × 10 -4 M </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 × 10 -5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7 H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22,0 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10,0 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5 H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / l dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spurenmetallösung 11,12. Mit Wasser bis auf insgesamt 1 Liter, in dH 2 O, und Wärme zu lösen. Aliquotieren und einfrieren die Lösung für die Lagerung. Abschließende angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf das Medium, nicht die Spur Metall-Lösung. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endkonzentration </td><td> Stammlösung </td><td> Menge für 1 Liter </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 </td><td> 1 × 10 -10 M </td><td> 1 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Biotin </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0,1 g / l dH 2 O </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> • Thiamin HCl </td><td> 1 × 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. f / 2Vitamin-Lösung 11. Stellen bis zu einem Gesamtbetrag von 1 Liter in dH 2 O, Filter sterilisieren, aliquotieren und einfrieren. Abschließende angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf das Medium, nicht die Vitamin-Lösung. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grafische Übersicht der Transformation Prozedur. Schematische Darstellung des Verfahrens zu gentechnisch verändern Ostreococcus tauri durch Elektroporation. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Abbildung 2. Kultur Wachstum. Zellen sind subkultiviert aseptisch in einer Verdünnung von 1/100 in frischen ASW alle 7 Tage und aufgewachsen unter konstanten Licht in einem Inkubator mit Pflanzenwachstum Moonlight Blue Filter ausgestattet. Die Lichtintensität sollte in der Nähe 20 pmol m -2 s -1 und Temperatur wird bei 20 ° C gehalten Zellen benötigen kein ständiger Bewegung zu sein, aber sind shaken einmal alle 2 bis 3 Tage, um die Aggregation zu verhindern. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Abbildung 3. Colony Formation auf 0,2% LMP-Agarose. Transfer 4 Platten zu einem großen Platz Petrischale und Dichtung mit Parafilm (oben links). Wenn Kolonien gebildet haben, wählen Sie einfach kostenlos (im Idealfall konisch geformten) Kolonien (oben rechts) und saugen sie aus der Platte mit einer Pipette P200. Es sollten keine Kolonien auf der Negativ-Kontrolle (unten rechts) sein.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Cellular Staat und Kultur axeny ist von entscheidender Bedeutung für die Transformation Prozedur. Obwohl die Zellen üblicherweise in Zyklen von 12 Stunden Licht gehalten werden, wurden 12 Stunden Dunkelheit, Transformationseffizienz in Zellen unter diesen Bedingungen angebaut wird unzureichend zu sein. Während der wiederholten Pelletierung / Resuspension Schritte sollten die Zellen immer leicht zu resuspendieren. Wenn Zellen aggregieren, oder ein Schleim-ähnliche Substanz vorhanden ist, ist es besser, das Verfahren wieder von vorne beginnen. In der Regel können ~ 50 Kolonien auf jeder Platte Transformation gerechnet werden, im Vergleich zu keiner auf der Negativ-Kontrolle Platte. Bei geringer Transformationseffizienz sollte Kulturbedingungen variiert werden, um sicherzustellen Zellen sind im optimalen Zustand sein. Variablen, die Transformationseffizienz beeinflussen, gehören Umgebungstemperatur im Labor (sollte in der Nähe 20 ° C sein) und Handling-Geschwindigkeit (Procedure aus Pelletierung Zellen [2.3] der Besserung [2.7] sollte ~ 1 Stunde dauern). Es ist auch wichtig, dass alle Lösungen einRe machte vor jeder Transformation frisch. Für die Aufnahme in Platten, ist die Konzentration der LMP-Agarose von entscheidender Bedeutung. Ostreococcus Zellen nicht in hohen Konzentrationen Agarose wachsen, und in geringen Konzentrationen zu diffundieren. Drei Transformationsvektoren für Ostreococcus wurden bisher 6, veröffentlicht und Vektoren zu erzielenden und veröffentlicht kurz. Die vorhandenen Vektor Pot-Luc 6 ermöglicht die Verwendung eines Promotors der Wahl in Kombination mit einem C-terminalen Glühwürmchen-Luciferase-Tag eine schnellere Auswahl sowie transgene Linie handhabbar Expressionsmuster, während die Potox Vektor 6 trägt die starken induzierbaren Promotor aus der 13 entnommen Ostreococcus hoher Affinität Phosphat Transporter (HAPT)-Gen für die Überexpression des Gens von Interesse. Die Potox-Luc Vektor leitet sich von Potox, das Tragen einer zusätzlichen Marker, der Luciferase für indirekte Wahl der Überexpression Linien verwendet werden können <sbis&gt; 14. Erfolgreiche Selektionsmarker auf diesen Vektoren sind Nourseothricin und G148. Jedoch sind Ostreococcus Zellen gegen viele Antibiotika, und die Konzentrationen von Verbindungen, die für Selektion von transgenen Ostreococcus Zellen höher ist als bei herkömmlichen Modellsystemen (2 mg / ml). Obwohl das Verfahren als ineffizient, stellt die große Anzahl von Zellen und Plasmid-DNA für dieses Verfahren erforderlich keinen signifikanten Hindernis. Eine größere Einschränkung ist, dass jede Zeile erzeugt, die resistent gegen den Selektionsmarker ist es, individuell analysiert werden muss, um zu überprüfen, dass das gesamte Konstrukt in der DNA integriert wird. Wir haben Beispiele, in denen die erfolgreiche Expression des selektierbaren Markers nicht um das Einsetzen des tatsächlichen Gen von Interesse entsprach, beobachtet, dh teilweise Integrationen auftreten können. Offensichtlich zufällige Insertion in das Genom bedeutet auch, dass es keine Kontrolle der Insertionsstelle mit diesen Verfahren und Methoden, basierend auf homologe Rekombination werden derzeit entwickelt. Aber das hier beschriebene Verfahren ist, nach bestem Wissen, derzeit die einzige Methode, um dadurch genetisch veränderten Zellen Ostreococcus generieren. Als Ostreococcus tauri hat erst vor kurzem als ein experimentelles Modell Organismus benutzt wurde, ist den meisten Methoden der Arbeit mit diesen Zellen wahrscheinlich entwickeln und durch die wachsende Forschungsgemeinschaft beteiligt verfeinert werden. Dieses Protokoll soll den Menschen helfen, initiieren Arbeit mit Ostreococcus, aber keineswegs behauptet, alles, was man über genomische Transformation dieser Mikroalge kennen zu beschreiben. Die Autoren vertrauen, dass die Leser in der Lage, dieses Protokoll, um ihre eigenen Bedürfnisse als kleine Unterschiede in Inkubatoren (Lichtverhältnisse oder Qualität) und andere Parameter anzupassen und existieren wird wahrscheinlich in jedem einzelnen Labor optimiert werden, um die gesunde Kulturen dazu benötigte erhalten Protokoll. Nach Bewältigung der hier beschriebenen Techniken,Vektoren können zur lumineszierenden, fluoreszierenden oder anderen markierte Fusionsproteine ​​Leitungen unter der Steuerung einer Reihe von Promotoren zu erzeugen. Dieses aufregende neue experimentelle Plattform wird nützlich sein, zu untersuchen, wie komplizierte biochemische Probleme in einem Eukaryonten mit reduzierter Komplexität, in denen pharmakologische Ansätze hoch 3 sind erleichtert, gelöst werden.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Mittlere Bestandteile </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td colspan="2" > Katalog-Nummer </td><td> Lieferant </td></tr><tr><td> Instant Ocean Meersalz </td><td colspan="3"> von <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> oder <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glycerin-2-phosphat Dinatriumsalz Hydrat </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Reinstwasser Tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> • Na 2 EDTA · 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7 H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5 H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 (Cyanocobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotin </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> • Thiamin HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomycin </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Verbrauchsmaterialien für die Kultivierung </td></tr><tr><td colspan="2"> Artikel </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Lieferant </td></tr><tr><td colspan="2"> Zellkulturflasche T25 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Zellkulturflasche T75 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Zellkulturflasche T175 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle Top Filter, 1L, komplett </td><td> 99950T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle Top Filter, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle Top Filter, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle Top Filter, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Salzgehalt Meter für Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Chemikalien für die Transformation </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> KatalogAnzahl </td><td> Lieferant </td></tr><tr><td> D-Sorbit </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 Lösung </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNAT </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Verbrauchsmaterial für Transformation </td></tr><tr><td> Artikel </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Lieferant </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche T25 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche T75 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche T175 Federung Cultures mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner Zentrifugenröhrchen 50ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser Küvetten, 0,2 cm Abstand, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petrischale runden PS 3 VENTS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Petrischale mit vier quadratischen Öffnungen sterile Polystyrol durch Bestrahlung klar 120mm </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Moonlight Blaulichtfilter </td><td> 183 </td><td> Lee Lighting </td></tr></tbody></table>

genomic transformation des picoeukaryote<em&gt; ostreococcus tauri</em

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Häufige Probleme behindert schnelle Fortschritte in Plant Sciences zählen Zell-, Gewebe und ganzen Organismus Komplexität und vor allem das hohe Niveau der genomischen Redundanz beeinflussen einfache Genetik in höheren Pflanzen. Das erfindungsgemäße Modellorganismus Ostreococcus tauri ist die kleinste frei lebenden eukaryotischen bisher bekannten und besitzt einen stark reduzierten Genomgröße und zelluläre Komplexität 1,2, durch die Anwesenheit von nur einer der Organellen (Mitochondrien, Chloroplasten, Golgi) pro manifestiert Zelle, und ein Genom, das nur ~ 8000 Gene. Weiterhin stellt die Kombination von unicellularity und einfache Kultur eine Plattform zugänglich chemische Ansätze. Vor kurzem hat Ostreococcus erfolgreich eingesetzt, um grundlegende Mechanismen der zirkadianen Zeitmessung 3-6 studieren. Die Ergebnisse dieser Modell-Organismus haben nicht nur Plant Science beeinflusst, sondern auch Säugetierbiologie 7. Dieses Beispiel macht deutlich, wie schnell ein Experimentieren ineinfache Eukaryoten aus der grünen Linie kann die Forschung in komplexeren Organismen beschleunigen durch die Erzeugung überprüfbare Hypothesen mit Methoden technisch möglich nur in diesem Zusammenhang von geringerer Komplexität. Wissen eines Genoms und die Möglichkeit, Gene zu verändern sind unverzichtbare Werkzeuge in jedem Modell Arten. Genomic 1, Transkriptom 8, 9 und Proteom-Daten für diese Spezies ist frei verfügbar, während die zuvor berichteten Methoden zu 6,10 genetisch verändern Ostreococcus zu wenige Labors weltweit bekannt sind. In diesem Artikel, um die experimentellen Verfahren, genetisch transformierbar diese neuartigen Modell Organismus mit einer Überexpression Konstrukt mittels Elektroporation werden im Detail beschrieben, sowie das Verfahren der Aufnahme von transformierten Zellen in geringen Prozentsatz Agarose die Selektion transformierter Linien von einem bestimmten einzigen transformierten Zelle. Nach der erfolgreichen Anwendung der OstreocoCCUs zu circadianen Forschung, kann wachsendes Interesse an Ostreococcus aus verschiedenen Forschungsbereichen innerhalb und außerhalb der Botanik einschließlich biotechnologischen Bereichen zu erwarten. Forscher aus einem breiten Spektrum von biologischen und medizinischen Wissenschaften, die auf biochemischen Wege konservierte arbeiten kann prüfen, forscht in Ostreococcus, frei von genomischer und organismischen Komplexität des größeren Modells Arten.

Dieser Artikel beschreibt die genetische Transformation der einzelligen Alge<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Durch Elektroporation. Diese eukaryotischen Organismus ist ein gutes Modell-Plattform für höhere Pflanzen, possesing stark reduziert genomischen und zellulären Komplexität und wobei sich gut für die sowohl Zellkultur und Biochemie.

Genomic Transformation des Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Häufige Probleme, die einen schnellen Fortschritt in den Pflanzenwissenschaften behindern, umfassen die Komplexität auf zellulärer, geweblicher und organismischer Ebene sowie insbesondere den hohen Grad an genomischer ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, stabile transgene Linien des neuartigen Modellorganismus, Austria Occus Tori, einer marinen piko-eukaryotischen Algenart, zu erzeugen und auszuwählen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellpellets aus 50 Milliliter dichter ALG-Kultur pro Transformation gewonnen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit linearisierter DNA zu mischen und anschließend die Elektroporation durchzuführen.Nachdem die transformierten Zellen in frischem Medium verdünnt und über Nacht inkubiert wurden, 0,2 % Low-Melting-Point-Agarose und ein Selektionsmittel hinzufügen und die Mischung in kleine Petrischalen gießen. Im letzten Schritt werden die Kolonien, die nach zwei bis dreiwöchiger Inkubation unter konstantem blauen Licht entstanden sind, isoliert. Abschließend erfolgt die Selektion in flüssigem Medium sowie anschließende molekularbiologische Analysen wie PCR und Southern Blot, um die erfolgreiche Integration des Konstrukts in das Genom der erzeugten transgenen Linien nachzuweisen.Der Hauptvorteil der Verwendung dieses Organismus im Vergleich zu etablierten Modellorganismen wie Arabidopsis besteht darin, die genomische Komplexität erheblich zu verringern, wodurch die Untersuchung regulatorischer Netzwerke in einem Hintergrund mit praktisch keiner genetischen Redundanz ermöglicht wird. Obwohl wir in meinem Labor Osteo occus zur Erforschung der pflanzlichen circadianen Uhr verwendet haben, kann er auch zur Untersuchung vieler anderer komplexer zellulärer Netzwerke eingesetzt werden. Die Implikationen dieser Technik reichen daher weit über den Bereich der Pflanzenbiologie hinaus.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da, obwohl die einzelnen Schritte recht einfach erscheinen, die sachgemäße Handhabung der Zellen und ein effizienter Arbeitsablauf für ein gutes Ergebnis unerlässlich sind. Teile dieses Verfahrens werden von Culin Kish, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus einem Labor, demonstriert. Austria Occus-Zellen werden in künstlichem Meerwasser oder aSW angezüchtet, um eine aSW-Lösung herzustellen, die 40 Gramm pro Liter enthält.Meersalz in entionisiertem Wasser auf eine Salinität von 30 Teilen pro Tausend oder PPT einstellen, gemessen mit einem Salinitätsmessgerät. Fügen Sie anschließend Anreicherung, mittlere Spurenelemente und Vitamine hinzu und filtrieren Sie die Lösung anschließend steril durch einen 0,22-Mikron-Filter. Große Zellen von Austria cocus-Stamm O TT H 95 werden in einem SW unter konstantem Licht kultiviert. In einem Pflanzenwachstumsinkubator, der mit einem Mondlicht-blauen Filter ausgestattet ist, sollte die Lichtintensität bei etwa 20 Mikromol pro Quadratmeter pro Sekunde liegen, und die Temperatur auf 20 Grad Celsius gehalten werden. Die Zellen benötigen keine ständige Rührgabe, werden aber alle zwei bis drei Tage einmal geschüttelt, um Aggregation zu verhindern.Zur Erhaltungszucht werden die Zellen alle sieben Tage aseptisch in frischem a SW im Verdünnungsverhältnis 1:100 untergeimpft. Jede Transformation erfordert 50 Milliliter Zellen mit einer Zelldichte von 20 bis 30 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Diese Dichte sollte fünf bis sieben Tage nach der Unterimpfung erreicht sein.Die ungefähre Zelldichte und die Anzahl der Zellen kann auf einem Hämozytometer mit einer Vergrößerung von mindestens 40× geschätzt werden. Bevorzugt wird die Bestimmung mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Ein Beispiel gesunder im Vergleich zu ungefundenen Kulturen wird hier gezeigt.Jedes bioparametrische Diagramm zeigt den Seitenstreulichtsignal (SSC) auf der y-Achse gegenüber der roten Fluoreszenz pro Zelle oder FL drei auf der x-Achse. FL drei steht für die rote Chlorophyll-Fluoreszenz, und SSC ist ein Hinweis auf die relative Zellgröße. Gesunde Zellen liegen im Austria Occus-Fenster, während sterbende Zellen oder verunreinigende Bakterien außerhalb dieses Fensters liegen.Im Idealfall sollten mehr als 99 % der Zellen im Austria Occus-Fenster liegen. Für eine effiziente genetische Transformation werden pro Transformation fünf Mikrogramm reinen linearisierten Plasmids benötigt, wobei die DNA-Konzentration ein Mikrogramm pro Mikroliter betragen sollte. In sterilem entionisiertem Wasser wurde das Plasmid durch ein Enzym linearisiert, das im Vektorgerüst schneidet, jedoch weder im Transgen noch im Selektionsgen.Stellen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit DNA zusammen mit einem zwei Millimeter breiten Elektroporationskäfig für jede Transformation auf Eis. Für jede zu transformierende Zelllinie ist eine Kontrolle ohne DNA erforderlich. Überführen Sie für jede Transformation 50 Milliliter Zellen in ein Röhrchen mit konischem Boden, geben Sie 0,1 % Pluronic Säure F 68 hinzu und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 8.000 ×g bei 10 Grad Celsius.Um die Zellen zu pelletieren, verwerfen Sie sofort den Überstand und geben Sie ein Milliliter Resus-Suspensionspuffer zu den Zellen hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, überführen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 8.000 × g bei 10 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen nach der zweiten Zentrifugation schnell erneut. Schneiden Sie eine P-200-Spitze ab, um jedes Pellet in 40 µL Resus-Suspension zu resuspendieren. Geben Sie 40 µL der resuspendierten Zellen zu jedem Röhrchen mit linearisierter DNA auf Eis. Vorsichtig mischen und auf das Elektroporationsgefäß übertragen.Geben Sie das Vete in die Elektroporationsmaschine. Stellen Sie die Einstellungen auf sechs Kilovolt pro reziproke Sensor, 600 Ohm und 25 Mikrotage ein. Elektrooperieren Sie die Zellen nach der Elektroporation.Inkubieren Sie die Zellen in den Küvetten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. In dieser Zeit beschriften Sie die Zellkulturflaschen und geben jeweils 30 Milliliter frisches a SW in jede Flasche. Entnehmen Sie aus jeder Flasche ein Milliliter a SW und geben Sie es vorsichtig dem entsprechenden Vete hinzu; inkubieren Sie zwei Minuten lang.Als Nächstes entfernen Sie vorsichtig ein SW, das nun das Zellklümpchen enthält, und pipettieren Sie langsam und behutsam direkt in ein neues SW. In der Kulturschale verbleiben die Zellen typischerweise als großes Zellklümpchen. Achten Sie darauf, die aggregierten Zellen zu diesem Zeitpunkt nicht zu schütteln oder zu stören. Lassen Sie die Zellen im Brutschrank eine bis zwei Stunden lang regenerieren.Schließlich die Zellen durch manuelles Schwenken der Kolben resuspendieren. Zu diesem Zeitpunkt sollten sich die Zellen frei resuspendieren lassen, und es dürfen keine Klumpen sichtbar sein. Die Kulturen über Nacht im Inkubator regenerieren lassen. Am Tag nach der Elektroporation eine Lösung von 2,1 % Low-Melting-Point-Agarose in doppelt destilliertem Wasser in einer Flasche mit Rührfisch autoklavieren.Im moltenen Zustand bei 65 bis 90 Grad Celsius in einem größeren Becher halten, der sich in Wasser auf einem heizbaren magnetischen Rührer befindet. Bereiten Sie für jede Transformation acht 50-Millimeter-Petri-Schalen und acht 50-Milliliter-Röhrchen vor, die jeweils neun Milliliter eines SW-Plus enthalten. Die erforderliche Selektion.Sammeln Sie die transformierten Zellen aus dem Inkubator. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, die transformierten Zellen in Gele mit niedrigem Agaroseanteil einzubringen, ohne die Integrität der Zellen durch zu starke Erwärmung zu beschädigen. Daher ist es wichtig, die nächsten Schritte des Verfahrens schnell und effizient in einer sterilen Flusshaube durchzuführen.Geben Sie ein Milliliter nahezu siedenden Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt zu den neun Millilitern eines SW hinzu. Verschließen Sie in einem der Röhrchen das Röhrchen und mischen Sie durch mehrmaliges Umstülpen. Fügen Sie anschließend 0,5 Milliliter frisch transformierter Zellen hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen schnell wieder und mischen Sie durch Umstülpen, bevor Sie den Inhalt in die Petrischale gießen.Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den verbleibenden sieben Reaktionsgefäßen und fahren Sie dann mit dem nächsten Transformationskolben fort. Lassen Sie die Schalen eine Stunde lang im Flussgehäuse geöffnet, damit das Gel erstarrt. Anschließend decken Sie die Schalen ab und bringen sie vorsichtig in große rechteckige Petrischalen, von denen jede vier runde Schalen aufnimmt.Da die Schalen nicht vollständig ausgehärtet waren, ist das Gel sehr empfindlich. Vorsicht ist geboten, um das Gel beim Umgang mit den Schalen nicht zu beschädigen. Versiegeln Sie die quadratischen Schalen mit Paraform und stellen Sie sie in den Inkubator.Sobald Kolonien sichtbar werden, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette mit abgeschnittenen Spitzen. Um Kolonien in einer sterilen Haube aufzunehmen, wählen Sie einfach freistehende Kolonien aus und saugen Sie eine grüne Kolonie auf. Achten Sie darauf, keine Zellen benachbarter Kolonien mit aufzunehmen.Überführen Sie die Zellen in zwei Milliliter flüssiges Medium, das den Selektionsmarker enthält. In einer 24-Loch-Platte durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Nach der Auswahl von 24 oder 48 Kolonien pro Transformation die Platten mit Parafilm verschließen und in den Inkubator bringen.Nach einer Woche überführen Sie 100 Mikroliter aus jedem Well in zwei Milliliter frisches a SW mit Selektion. In einer 24-Well-Platte weitere sieben Tage lang kultivieren. Die überlebenden Zelllinien können anschließend für weitere Untersuchungen verwendet werden, wenn fünf Mikrogramm linearisierte DNA transformiert wird.Mithilfe dieses Protokolls sollten 20 bis 60 Kolonien pro Transformationsplatte nach zwei bis drei Wochen sichtbar werden. Etwa 80 % der ausgewählten Kolonien wiesen eine positive Selektion durch Antibiotikaresistenz in flüssigem Medium auf und wurden in nachfolgenden Studien verwendet, nachdem dieses Verfahren angewandt wurde.Andere Methoden wie die PCR oder die Southern-Blot-Analyse können anschließend durchgeführt werden, um die Anzahl und Lage der Insertion des Trench-Gens nach dessen Entwicklung zu überprüfen. Diese Technik ermöglichte es Forschenden auf den Gebieten der Circadianen Rhythmen und der Zellzyklusforschung, die komplexen Bestandteile und Verhaltensweisen ihrer jeweiligen Systeme in diesem neuen Modellorganismus, Austria Caucus, zu verstehen. Tori, nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man transgene Austria-Caucus-Linien erzeugt.

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Research

Forschung

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Genomic Transformation des Picoeukaryote

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