Name: Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Protein-Misfolding-Cyclic-Amplification zur Untersuchung von Prion-Konversion und Artbarrieren in vitro. Diese Methode ermöglicht die Amplifikation von Prion-Stämmen für die Forschung.

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Wir möchten Dr. Vesper Fe Marie Ramos für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde vom National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 und G20RR024001) und dem National Institute for Neurological Disorders and Stroke (2R01 NS052609) unterstützt.

Ein. Vorbereiten der Ausrüstung <ol><li> Verwenden Sie einen Misonix 3000 oder Misonix 4000 Ultraschallgerät (Farmingdale, NY) mit einem Thermo Electron Neslab EX-7 Wasserbad (Newington, NH), um eine konstante Temperatur von 37 ° C zu halten Beschallen die Proben in 200 ul dünnwandigen PCR-Röhrchen Streifen mit gewölbten Deckeln von Thermo Scientific (Waltham, MA) erhalten. </li><li> Ein neues Ultraschallgerät benötigt eine &quot;Pause&quot;-Periode des kontinuierlichen Betriebs 9. Eine zweimonatige Einfahrzeit besteht aus einem 40-sec Beschallung Burst und 10-minütigen Inkubation Zyklen mit der Amplitude eingestellt bis 10. Man sollte Erosion der gesamten Oberfläche des Titan Mikroplatte Horn (Abbildung 1, Teil B) zu beobachten. Das zirkulierende Wasser aussehen wird weiß-trüb durch Erosion des Titan Mikroplatten Horn. Ersetzen Sie diese Wasser täglich. </li><li> Die Verstärkung des PrP Sc wird während der Mikrotiterplatte Horn variieren. Die beste PrP Sc Amplifikationseffizienz kann innerhalb erhalten werdeneinem Radius von 5 cm von der Mitte der Mikrotiterplatte Horn (Siehe Abbildung 1, Panel C). </li><li> Eine Runde PMCA aus 144 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus 5 sec Beschallung und 10 min Inkubation. Dies wird in etwa 24 Stunden pro Runde PMCA ziehen. </li><li> Die Leistungsabgabe des Ultraschallbehandlung, auf die Beschallungsvorrichtung Bedienfeld angezeigt werden, variiert mit der Anzahl der PCR-Röhrchen Die in der Sonicator die Zahnstange und der Temperatur des zirkulierenden Wassers aus dem Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass das Wasser äquilibriert bei 37 ° C und füllen nicht mehr als 30% der Sonicator die Röhrchenständer (Abbildung 1, Panel C). Verbreiten Sie die PCR-Röhrchen durch die Mikroplatten Horn. Mindestens eine Reihe von leeren Raum zwischen PCR-Röhrchen-Streifen und damit nicht mehr als vier Röhren zusammen pro Streifen verbunden (Abbildung 1, Panel C). </li><li> Die Stärke der Ultraschallbehandlung ist entscheidend für eine erfolgreiche Amplifikation Prionenstamm. Während Beschallen, die Amplitude, um eine Ausgangsleistung habenzwischen 155 ~ 170 Watt. In unserem Labor ist die Sendeleistung zu sechs und sieben für die Misonix 3000 und Misonix 4000 bzw. eingestellt. </li><li> Verwenden Sie destilliertes Wasser in das Wasserbad zu vermeiden akkumulieren harten Wasserflecken. Ersetzen Sie diese Wasser wöchentlich. Während der Inkubation und Beschallung Zyklen wird Kondenswasser im Inneren des Mikroplatten-horn Deckel auftreten. Zur Vermeidung von Kondensation, bringen ein kleines Aquarium Heizkissen an die Spitze des Sonicator Gehege, wie in Abbildung 1, Panel A gezeigt </li></ol> 2. Vorbereitung der Proben <ol><li> Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Creighton University Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Ausschusses und entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Vor jedem Gewebe Sammlung, das Tier narkotisiert und muss transkardial perfundiert mit eiskaltem Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit 5 mM EDTA bei pH 7,4, um Blut aus dem Gehirn zu entfernen und verhindern die Inhibierung derPMCA Reaktion durch Blut 7. Sammle tierischen Geweben rasch unter aseptischen Bedingungen und haben engagierte Dissektion Tools für jede Prionenstamm. Nach Dissektion, legen Sie das Gewebe in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, frieren Flash auf Trockeneis, und speichern Sie sie bei -80 ° C bis zur Homogenisierung. </li><li> Um die PMCA Substrat (PrP C) herzustellen, homogenisieren eine nicht infizierte Hamsterhirn (UN BH) zu einer 10% Gewicht / Volumen (w / v) Lösung mit eiskaltem Kovertierungspuffers (siehe Teil 3) mit einem Tenbroeck Gewebe Mahlwerk. Während Homogenisieren, darauf achten, nicht die Luft im Inneren der Mühle zu erhalten zu vermeiden übermäßige Schaumbildung der Lösung. Klären der Lösung durch Zentrifugieren bei 500 xg für 30 sec und Aliquot des Überstandes in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Um die PMCA Saatgut (PrP Sc)-Lösung herzustellen, ein infektiöses Material homogenisieren (Gehirn, Milz, Lymphknoten, Geweben oder anderen kontaminierten Bodens) zu einer 10% w / v Lösung mit eiskaltem water und aliquoten die Lösung in 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol> 3. Vorbereiten Conversion Buffer <ol><li> Wiegen 0,5093 g Triton X-100 in einem 50 ml Messkolben (Ergebnis ist eine 1% Endkonzentration an Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland). </li><li> Fügen Sie eine komplette Protease Inhibitor Tablette (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland). </li><li> Hinzufügen 0,0931 g EDTA (diese wird in einem 5 mM Endkonzentration von EDTA führen) (Mallinckrodt Baker Inc.; Phillipsburg, NJ). </li><li> Den pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH. </li><li> Lautstärke auf 50 ml mit Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (Mediatech Inc.; Manassas, VA). </li><li> Filtern der Lösung durch einen 0,45 um Nitrocellulosemembran mit einer Vakuumfiltervorrichtung. Die Umwandlung Puffer bei 4 ° C für nicht mehr als einen Monat gelagert werden. </li></ol> 4. Verstärkung des Prion-Stämme mit PMCA <ol><li>Verdünnt das PMCA Saatgut in den PMCA Substrat in einem Verhältnis von 1:20 (dh Mischung 5 ul der PMCA Saatgut und 95 ul der PMCA Substrat) in einer PCR-Röhrchen. Entfernen und speichern 15 ul Aliquots bei -80 ° C für unsonicated Kontrolle; dies unsonicated Steuerung wird verwendet, um die PrP Sc Verstärkung durch Proteinase K (PK) Verdauung durch Western Blot (WB) Analyse folgt quantifizieren. Eine zusätzliche Kontrolle unsonicated könnte durch Platzieren eines zweiten 15 ul Aliquots bei 37 ° C für die Dauer der PMCA Reaktion erzeugt werden. Ein Minimum von drei Wiederholungen wird für statistische Zwecke benötigten. </li><li> Gegenstand der Rest der Probe (70 ul) mit einer Runde der PMCA wie auf Abbildung 1 dargestellt, Panel A Schütteln Röhrchen alle 5 Stunden, um eine Wasserkondensation auf dem gewölbten Deckel des PCR-Röhrchen zu vermeiden. </li><li> Die Probe Rohren sollten ausgegliedert werden und sanft gevortext (dabei darauf achten, dass die Lösung nicht in den gewölbter Deckel gehen) vor dem Öffnen nach jedem Verfahren, um sicherzustellen, homogeneity und vermeiden mögliche Kontamination. </li><li> Für die serielle PMCA (sPMCA) der kurzen Inkubationszeit Stämme (dh HY TME, HaCWD oder 263K), wird der beschallten Material bei einem Verhältnis von 1:20, indem 5 ul der beschallten Probe von Runde eins in 95 ml frisches infizierten Hirnhomogenat (Abbildung 2, Panel B). </li><li> Für sPMCA der langen Inkubationszeit Stämmen (dh DY TME, 139h, 22CH, 22Ah oder ME7H), verdünnt das beschallten Materials in einem Verhältnis von 1:1 durch Transferieren 50 ul der beschallten Probe aus der ersten Runde in 50 ml frisches nichtinfizierten Hirnhomogenat (Abbildung 2, Panel B). </li><li> Entfernen Sie die zwei 15 ul Aliquots aus dem zuvor verdünnt beschallten Gemisch (aus den Schritten 4,4 bzw. 4,5) und speichern einer von ihnen bei -80 ° C und die andere bei 37 ° C (unsonicated Control-Lösungen für PMCA Runde zwei). Unterziehen die Überreste einer PMCA Runde zwei. </li><li> Dieser Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden. In unserem Labor haben wirbis zu fünfzehn PMCA Runden durchgeführt haben, mit den Dehnungs-Eigenschaften bleiben unverändert. </li><li> PK verdauen die Proben. Für eine typische WB mischen 5 ul PK 80 ug / ml bis 5 ul Probe (diese Lösung wird eine endgültige PK Konzentration von 40 ug / ml haben) und bei 37 ° C für eine Stunde. Fügen Sie 10 ul Gelladepuffer. Kochen Sie diese Lösung für 10 min. Lassen Sie die Lösung abkühlen und laden 10 ul in das Gel. </li><li> Um den Erfolg der Amplifikation zu berechnen führen eine Analyse an den WB PK-verdauten Proben, um die Menge der verstärkten PrP Sc durch Vergleich, um entweder zu schätzen, die unsonicated Steuerelementen 20,21 Abbildung 2, Tafel C oder bekannte Mengen von PK-unverdaute rekombinante PrP. </li></ol> 5. Vermeiden Kreuzkontamination Critical müssen Maßnahmen ergriffen werden, um Kreuzkontaminationen und das Auftreten von Fehlalarmen durch de novo Bildung von Protease beständige Produkte zu minimieren. </p&gt; <ol><li> Verwenden Sie einen dedizierten Satz Dissektion Tools (zB Zangen, Pinzetten, Scheren) für die Probenentnahme für jeden Prionenstamm. </li><li> Vor Homogenisieren infizierten Gehirnen als PMCA Substrat verwendet werden, wischen Sie die Pipetten mit 1% Bleichmittel. Weichen Sie das Ultraschallgerät die PCR-Röhrchen Rack, Gewebe Homogenisatoren und PCR-Röhrchen Lagerregale mit 1% Bleichmittel für 10 min und anschließend gründlich mit destilliertem Wasser. </li><li> Decken Sie die Arbeitsfläche mit einem frischen Versi-Dry Lab Soaker jedes Mal eine neue Probe homogenisiert werden, ist eine neue PMCA Experiment vorbereitet zu sein, oder wenn Aliquotierung zwischen sPMCA Runden. </li><li> Verwenden Sie neue Handschuhe jedes Mal neue Proben behandelt (vor allem beim Übertragen Aliquots zwischen sPMCA Runden) werden. </li><li> Verwenden Sie kurze Beschallung Bursts für jeden PMCA Zyklus. Cycles of 5 sec Beschallung mit 10 min Inkubation kombiniert ist ausreichend, um Prionen ohne dass de novo PrP Sc 1,20,21,23,24 verstärken. Wie andere Labors haben gezeigt, Erhöhung derBeschallungszeit, die Erhöhung der Beschallung Amplitude und Erweiterung der Anzahl der PMCA-Zyklen erhöht die Wahrscheinlichkeit für die de novo PrP Sc Bildung 2. </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+properties+of+the+prion+protein+from+two+strains+of+the+transmissible+mink+encephalopathy+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent.</a> J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+PrP+properties+suggest+the+molecular+basis+of+strain+variation+in+transmissible+mink+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy.</a> J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+biologically+distinct+strains+of+transmissible+mink+encephalopathy+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters.</a> J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).</li>
<li>Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134, 757-768 (2008).</li>
<li>Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+propagation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cell-free propagation of prion strains.</a> EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).</li>
<li>Caughey, B., Raymond, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrapie-associated+form+of+PrP+is+made+from+a+cell+surface+precursor+that+is+both+protease-+and+phospholipase-sensitive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive.</a> J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).</li>
<li>Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+native+prions+from+minimal+components+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation of native prions from minimal components in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+different+scrapie+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Competition between different scrapie agents in mice.</a> Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).</li>
<li>Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+prions+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious prions in urine.</a> FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).</li>
<li>Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high+fidelity+prion+amplification+within+and+across+prion+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers.</a> PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Herausforderungen der Verstärkung infektiöse Prion-Proteine ​​sind die langen Inkubationszeit und die Kosten der In-vivo-Experimente. Die PMCA Technik ist ein kostengünstiges Mittel, um infektiöse Prion-Agenten zu verstärken. Mehreren Laboratorien haben die Fähigkeit, genau zu amplifizieren PMCA Prionenstämme in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24 bestätigt. Prion-Erkrankungen können zwischen verschiedenen Arten übertragen werden. Bessen und Marsh haben effektiv Hamster mi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz / Equipment </td><td> Hersteller </td><td> Cat. Anzahl </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeck Tissue Grinder </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab EX-7 Wasserbad </td><td> Thermo Electron </td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> 0,2 ml PCR Tube Strips </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td> Komplette Protease Inhibitor </td><td> Roche </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> JT Baker </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Mallinckrodt Baker Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Versi-Dry Lab Soakers </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> Repti Therm Heater </td><td> Zoo Med Laboratories, Inc. </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

proteinfehlfaltungen cyclic amplification von prionen

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prionen sind infektiöse Agenzien, die unweigerlich tödlichen übertragbaren spongiformen Enzephalopathie (TSE) verursachen bei Menschen und Tieren 9,18. Das Prionprotein hat zwei verschiedene Isoformen, die nicht-infektiösen Host-codierte Protein (PrP C) und das infektiöse Protein (PrP Sc), eine abnormal gefaltete Isoform von PrP C 8. Eine der Herausforderungen bei der Arbeit mit Prion-Agenten ist die lange Inkubationszeit vor der Entwicklung von klinischen Anzeichen nach Host Inokulation 13. Das traditionell langen und teuren Tier-Bioassay Studien beauftragt. Darüber hinaus werden die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von PrP Sc schlecht charakterisiert durch ihre ungewöhnliche Konformation und Aggregation Staaten. PrP Sc kann Saatgut die Umwandlung von PrP C zu PrP Sc in vitro 14. PMCA ist ein in vitro-Technik, nimmt advantage dieser Fähigkeit mit Ultraschallbehandlung und Inkubation Zyklen, große Mengen an PrP Sc zu erzeugen, mit einer beschleunigten Rate von einer Anlage mit überschüssigen Mengen an PrP C und winzige Mengen des PrP Sc Saatgut 19. Diese Technik hat sich als wirksam rekapitulieren die Art und Stamm von PrP Sc Spezifität Umwandlung von PrP C zu Prionenstamm Interferenz emulieren, und mit sehr geringen Mengen von PrP Sc aus infizierten Geweben, Fluiden, und Umweltproben 6,7,16 amplifizieren, 23. Dieses Papier Details der PMCA Protokoll, einschließlich Empfehlungen zur Minimierung Kontamination Erzeugung konsistente Ergebnisse und Quantifizierung dieser Ergebnisse. Wir diskutieren auch mehrere PMCA Anwendungen, einschließlich der Erzeugung und Charakterisierung von Prion-Stämme, Prionenstamm Störungen, und der Nachweis von Prionen in der Umwelt.

Proteinfehlfaltung zyklischen Amplifikation (PMCA) wird verwendet, um PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24 zu amplifizieren. Eine erfolgreiche Amplifikation PrP Sc ist durch einen Anstieg der Bandenintensität auf Western Blots des PK-Prionprotein (Migration zwischen 19 und 30 kDa für Hamster abstammenden Prionenstämme), wie in 3 gezeigt ist. Die Zunahme seiner Bandenintensität nach PMCA zeigt Verstärkung des PK-resistente PrP Sc Material...

Proteinfehlfaltung zyklischen Amplifikation (PMCA) ist ein in vitro-Assay zur Untersuchung von Prionen Umwandlung und Dehnung und Artgrenzen. Es kann auch als ein Prion-Nachweis-Assay verwendet werden.

Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen

Prionen sind infektiöse Agenzien, die die unweigerlich tödliche transmissible spongiforme Enzephalopathie (TSE) bei Tieren und Menschen verursachen9,18. Das Prion-Protein ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hamsteradaptierte Prionenstämme vom Typ PreOn erfolgreich in vitro zu amplifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein nicht infiziertes Hamstergehirn als Substrat homogenisiert und anschließend das infizierte Gewebe als Impfstoff (Seed) vorbereitet wird. Im zweiten Schritt werden Substrat und Seed in PCR-Röhrchen gemischt und anschließend mittels Sonifikation und Inkubationszyklen eine zyklische Verstärkung der Proteinfehlfaltung, auch PMCA (Protein Misfolding Cyclic Amplification), durchgeführt. Anschließend wird das amplifizierte Material mit frischem Substrat verdünnt und in vitro seriell amplifiziert, woraufhin die PMCA durchgeführt wird. Schließlich werden die Proben mit Proteinase K digeriert und anschließend mittels Western Blot analysiert. Letztendlich kann die Zunahme der Bandenintensität im Western Blot zur Bestimmung der in vitro-Amplifikation des Prion-Stamms genutzt werden.Mit dieser Methode lassen sich wichtige Fragen im PreOn-Bereich beantworten, beispielsweise, welche wichtigen Cofaktoren an der PreOn-Amplifikation beteiligt sind. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit kleinen, aber wichtigen technischen Details sowie damit, eine Kreuzkontamination der Proben zu vermeiden. Vor der Homogenisierung die Pipetten mit 1 % Bleiche abwischen, das Ultraschall-Behandlungs-PCR-Röhrchen-Gestell, die Gewebepulverisierer und die PCR-Röhrchen-Aufbewahrungsgefäße ebenfalls mit Bleiche sättigen.Nach 10 Minuten jedes Gerät gründlich mit destilliertem Wasser spülen und anschließend den Arbeitsbereich mit einem frischen Verly dry lab Soaker abdecken. Anschließend ein 10-buric-Gewebehomogenisiergerät und frisch zubereiteten eiskalten Konvertierungspuffer verwenden, um ein nicht infiziertes Hamstergehirn zu einer 10 % Gewicht pro Volumen-Lösung zu homogenisieren. Für die Verwendung als PMCA-Substratlösung das Homogenat in 15-Milliliter-Konischflaschen geben und die homogenisierte Lösung durch Zentrifugation bei 500 × g für 30 Sekunden klären.Danach unter sorgfältiger Vermeidung des großen Pellet-Aliquots das resultierende Überstandsvolumen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Zum Herstellen der PMCA-Saatlösung das geerntete infektiöse Material wie gerade gezeigt zu einer 10 %igen (Gewicht pro Volumen) Lösung homogenisieren, jedoch mit Dulbeccos phosphathaltigem Puffer (DPBS) anstelle von Umwandlungspuffer, und anschließend die Lösung in 0,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen abfüllen. Bevor mit der Amplifikationsprozedur begonnen wird, den Arbeitsbereich mit einem frischen, zuvor trockenen Labortuch abdecken; den PMCA-Substratansatz in einen 200-Mikroliter-Dünwwand-PCR-Röhrchenstreifen geben und die PMCA-Saat im Verhältnis 1 zu 20 darin verdünnen; insgesamt vier Replikate in rot markierten Röhrchen ansetzen.Platzieren Sie zwei Replikate einer 15 µL-Aliquotenprobe jeder Probe in blau gekennzeichnete PCR-Röhrchen, die als ungesättigte Kontrolle bei minus 80 °C verwendet werden. Geben Sie zwei zusätzliche Replikate einer 15 µL-Aliquotenprobe jeder Probe in PCR-Röhrchen, die als zusätzliche ungesättigte Kontrolle bei 37 °C gelagert werden. Anschließend werden die ungesättigten Kontrollen bei minus 80 °C in einen Gefrierschrank bei minus 80 °C gestellt und die anderen ungesättigten Kontrollen für die Dauer der PMCA-Reaktion in einen Inkubator bei 37 °C gegeben.Beginnen Sie nun die erste PMCA-Amplifikationsrunde, indem Sie den PCR-Röhrchenstreifen, der jeweils die verbleibenden 70 Mikroliter jeder Probe enthält, in einen Ultraschallgeber einsetzen, der an ein Umlaufwasserbad angeschlossen ist, das auf einer konstanten Temperatur von 37 Grad Celsius gehalten wird. Ein PCR-Röhrchen, das nur PMCA-Substrat enthält, kann als Mock-Kontrolle hinzugefügt werden, um auf Kreuzkontaminationen zu prüfen. Füllen Sie nicht mehr als 30 % des Röhrchenbereichs des Ultraschallgeräts, indem Sie die PCR-Röhrchen gleichmäßig über das Mikroplattenhorn verteilen. Halten Sie mindestens eine Reihe mit leerem Zwischenraum zwischen den PCR-Röhrchenstreifen frei und verbinden Sie nicht mehr als vier Röhrchen pro Streifen miteinander.Die Amplifikation von P-R-P-S-C variiert innerhalb des Mikroplattenhorns. Die beste Amplifikationseffizienz für P-R-P-S-C wird innerhalb eines Radius von fünf Zentimetern vom Zentrum des Mikroplattenhorns erzielt. Eine Runde PMCA besteht aus 144 Zyklen mit jeweils fünf Sekunden Sonikation und zehn Minuten Inkubation pro Zyklus, was pro Runde PMCA etwa 24 Stunden dauert; dabei sollte die Amplitude so eingestellt werden, dass eine Leistungsabgabe zwischen 155 und 170 Watt erreicht wird.Platzieren Sie eine Aquarium-Heizmatte auf dem Ultraschalldeckel, um Kondenswasserbildung zu vermeiden, die zu einer Kreuzkontamination der Proben führen könnte. Schütteln Sie die Röhrchen alle fünf Stunden, um Kondenswasserbildung auf den gewölbten Verschlüssen der PCR-Röhrchen nach Abschluss der Runde zu vermeiden. Entfernen Sie den Röhrchenstreifen vom Gerät und zentrifugieren Sie die Proben kurz.Danach die Röhrchen vorsichtig vortexen, wobei die Lösung vom Deckel ferngehalten werden sollte, um Kontaminationen beim Öffnen der Röhrchen so gering wie möglich zu halten. Den Rand nicht berühren und den Deckel auf ein sauberes Kim-Tuch legen. Danach für die serielle PMCA der PreOn-Stammprobe fünf Mikroliter der sonifizierten Probe in 95 Mikroliter frisches PMCA-Substrat übertragen.Verwenden Sie für jede Probe neue Handschuhe. Entnehmen Sie anschließend zwei 15-Mikroliter-Aliquote aus jeder sonifizierten Probe und lagern Sie ein Aliquot bei minus 80 Grad Celsius und das andere bei 37 Grad Celsius. Für die nicht gesättigten Kontrolllösungen der zweiten PMCA-Runde unterziehen Sie die Reste einer zweiten PMCA-Runde, wie gerade gezeigt.Dieser Schritt kann beliebig oft wiederholt werden. Zur Überprüfung einer Kreuzkontamination kann ein PCR-Gefäß mit PMCA-Substrat allein vom nicht infizierten Gehirn eingeschlossen werden, nachdem die Proben die gewünschte Anzahl an Runden durchlaufen haben. Mischen Sie fünf Mikroliter 18 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K mit fünf Mikrolitern der sonifizierten Probe, der Minus-80-Grad-Celsius-Kontrolle und der 37-Grad-Celsius-Kontrolle in separaten PCR-Gefäßen und inkubieren Sie die Proben zur Verdauung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Gegeben Sie anschließend 10 µL Gelauftragspuffer zur digerierten Probe hinzu und erhitzen Sie die Lösung 10 Minuten lang zum Kochen. Nach dem Abkühlen geben Sie 10 µL der Probe-Gelauftragspuffer-Mischung auf ein Western-Block-Gel. Um die Menge des amplifizierten P-R-P-S-C zu bestimmen, vergleichen Sie die Menge der Proteinase-K-verdauten Probe im Westernblot entweder mit den undigierten Kontrollen oder mit bekannten Mengen an Proteinase.K undigitiertes rekombinantes Protein. P-R-P-C-P-M-C-A wird verwendet, um P-R-P-S-C in vitro zu amplifizieren. Eine erfolgreiche Amplifikation des beim Hamster adaptierten Prionproteins, Hamster-CWD und schlafkrankheitsähnliches TME, ist in dieser Western-BLO-Analyse sichtbar. Der Vergleich der Bandenintensitäten vor und nach der PMCA-Proteinase-K-Digestion von P-R-P-S-C, gefolgt von der Western-BLO-Analyse, zeigt eine obere, mittlere und untere Bande, die den ungefalteten, monoglykosylierten und diglykosylierten Prionproteinen entsprechen. Einige Prionstämme können anhand ihrer elektrophoretischen Mobilität unterschieden werden.Beispielsweise besteht ein Unterschied von zwei Kilodalton in der Wanderung zwischen den Hamster-CWD- und dem schläfrigen TME-Prionstrang. Diese hochgradig zuverlässige Verstärkung zeigt sich in einer ähnlichen elektrophoretischen Wanderung des PMCA-verstärkten Prionstrangs aus Hamster-CWD im Vergleich zum entsprechenden Hamster-CWD-Ausgangsmaterial sowie des schläfrigen TME-Strangs im Vergleich zu dessen schläfrigem TME-Ausgangsmaterial. Falls keine Kreuzkontamination oder de-novo-Bildung von P-R-P-S-C auftritt, sollten die Western-Blot-Analysen der OFM-Kontrollproben aus der PMCA nach Proteinase-K-Digestion klar bleiben.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jedes Gerät vor der Verwendung mit einer neuen Probe gründlich zu reinigen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.

protein-misfolding-cyclic-amplification-of-prions

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