In Ovo Electroporations von HH Stage 10 Hühnerembryonen

Das Küken ist ein gutes Modellsystem, da die Embryonen sehr leicht manipulierbar sind und ihre Größe es auch viel einfacher macht, mit ihnen zu arbeiten als mit anderen Embryonen. Küken-Elektroporationsexperimente ermöglichen auch das Screening einer großen Anzahl von Genen in kurzer Zeit. Hallo, ich bin Marissa Blank.

Ich bin Doktorandin im Labor von Kathy Millon in der Abteilung für Humangenetik an der University of Chicago. Heute werde ich mit Ihnen darüber sprechen, wie man die Elektroporation von Küken und Eizellen durchführt, und wir werden Elektro-Hamburger und Hamilton-Hühnerembryonen im Stadium 10 sein, was etwa zwei Tage der Embryonalentwicklung beim Küken entspricht. Das Verfahren wird routinemäßig in unserem Labor durchgeführt, und normalerweise untersuchen wir die Auswirkungen von Genen im Rückenmark, weil wir an Genen interessiert sind, die an der Entwicklung des zentralen Nervensystems beteiligt sind.

Die Technik, die ich Ihnen heute in der Ovo-Elektroporation zeigen werde, umfasst also mehrere Schritte. Der erste Schritt besteht darin, das Ei zu fenstern. Der zweite Schritt besteht darin, DNA in das Lumen des Neuralrohrs zu injizieren.

Und der dritte Schritt besteht darin, die DNA mithilfe eines elektrischen Feldes in eine Seite des Neuralrohrs zu drücken. Und dann zeige ich dir, wie du die Eier verschließt und wir legen sie wieder in den Brutkasten. Okay, bevor es losgeht, möchte ich Ihnen ein wenig über den richtigen Umgang mit Eiern erzählen.

Die Eier werden also von einem Hühnerzüchter gekauft und kommen befruchtet. Da diese Eizellen Embryonen enthalten, solltest du vorsichtig sein, wie du mit ihnen umgehst. Vor der Inkubation sollten die Eier also bei 13 Grad gehalten werden.

Zu diesem Zweck verwenden wir einen kleinen Weinkühler, und wenn Sie dann bereit sind, die Eier zu bebrüten, sollten sie Raumtemperatur erreichen, bevor sie tatsächlich in den Brutkasten kommen. Und sobald sie in den Inkubator gelegt werden, sollte der Inkubator bei hundert Grad Fahrenheit gehalten werden, was etwa 57 Grad Celsius entspricht. Es ist auch wichtig, dass der Inkubator befeuchtet ist. Feuchtigkeit ist sehr wichtig für die richtige Entwicklung des Embryos.

Das erste, was Sie tun, um diese Eier für die Elektroporation vorzubereiten, ist, sie zu fenstern. Und der erste Schritt in diesem Prozess besteht darin, ein wenig von dem Albumin aus dem Ei zu entfernen. Also klebe ich ein kleines Stück Klebeband auf das Ende des Eies, und ich nehme eine Nadel mit großem Durchmesser und stiche ein Loch in das Ende, und dann werde ich sehr vorsichtig sein und die Nadel nach unten zum Boden des Eies zeigen, um den Embryo oder das Eigelb nicht zu stören.

Und ich werde die Spritze verwenden, um etwa fünf Milliliter Albumin zu entfernen. Ich werde das Ei dann wieder verschließen, indem ich einfach ein weiteres Stück Klebeband anwende. Und für die Elektroporation ist Klebeband ein gutes Klebeband, da es ungiftig ist.

Der nächste Schritt besteht darin, ein weiteres Stück Klebeband über das Ei zu legen, an dem das Fenster hergestellt wird. Es ist wichtig, die Eier während des Ausbrütens auf der Seite zu halten, da der Embryo an die Spitze des Eigelbs schwimmt. Und in dieser Eizelle, die auf der Seite gehalten wurde, befindet sich der Embryo tatsächlich genau hier.

Ich habe die Oberseite des Eies markiert, bevor ich sie in den Inkubator lege, damit ich weiß, wo der Embryo sein wird, bevor ich das Ei aufschneide. Jetzt mache ich mit einer gebogenen Schere ein kleines Loch und schneide dann ein Fenster aus. Sie möchten ein Fenster so klein wie möglich zuschneiden, damit Sie arbeiten können, und Sie können es später bei Bedarf immer noch vergrößern.

Jetzt, da wir das Ei abgeschirmt haben, sind wir bereit, mit der eigentlichen Injektion und Elektroporation fortzufahren. Und dafür gehen wir zum Mikroskop über. Um den Embryo sichtbar zu machen, werde ich also etwas Tusche unter den Embryo injizieren.

Das ist eigentlich etwas, was wir in unserem Labor nicht regelmäßig tun. Sobald Sie diese Experimente durchgeführt haben, werden Sie tatsächlich in der Lage sein, den Embryo wahrscheinlich ohne Kontrast zu sehen, aber er ist ein bisschen schwer zu sehen. Wenn sich die Tinte unter dem Embryo ausbreitet, sollten Sie also in der Lage sein, das Neuralrohr ziemlich deutlich zu sehen.

Das Neuralrohr ist also diese hellere Region in der Mitte des Embryos und so wie der Embryo ausgerichtet ist, zeigt der Kopf derzeit oben von mir weg nach oben. Diese Stufe wird auch als Hammerkopfstufe bezeichnet. Das merkt man wahrscheinlich daran, dass der Embryo tatsächlich aussieht, als hätte er einen Hammerkopf.

Wenn ich also injiziere, drehe ich den Embryo in der Regel so, dass der Kopf zu mir zeigt. Und wenn ich den Embryo injiziere, ziele ich auf die Region ab, die direkt unter der Stelle liegt, an der sich der Kopf ausdehnt. Also werde ich mich konzentrieren, ich werde meine Nadel genau hierher zeigen und in diesem Stadium injizieren.

Sie können hier auch sehen, wie sich Somiten an den Seiten des Neuralrohrs bilden. Okay, also noch einmal, der Kopf, und das ist das Neuralrohr, das zum Rückenmark wird. Jetzt haben wir also unseren Embryo fertig.

Wir werden die Injektionen tatsächlich durchführen. Und so sind die Werkzeuge, die Sie für die Injektionen benötigen, zunächst Glaskapillaren. Wir haben diese Glaskapillaren und ein Kapillarzug zieht sie in eine Glasnadel.

Dann nehmen wir diese Glasnadel. Und um die richtige Öffnung für die Injektion zu erhalten, müssen wir die Spitze von der Nadel abbrechen. Dies kann entweder unter dem Mikroskop oder nur mit dem Auge erfolgen.

Und so benutze ich normalerweise einfach eine Standardzange mit der Nummer fünf und breche dann die Spitze von der Kapillare ab. Es ist möglich, dass die Spitze zu weit hinten oder zu hoch abgebrochen wird und die Blende nicht die richtige Größe hat. Wenn Sie die Öffnung zu groß machen, können Sie das erkennen, denn wenn Sie versuchen, Flüssigkeit in die Kapillare zu ziehen, gibt es keinen Widerstand.

Ob die Öffnung die richtige Größe hat, erkennt man also in der Regel an dem Widerstand, den man beim Einziehen von Deckelflüssigkeit in die Kapillare bekommt. Das andere Gerät, das wir verwenden, ist eine Mundpipette. Die Mundpipette besteht also aus drei Teilen.

Es gibt ein Mundstück, ein Stück Latex oder Tai auf dem Schlauch, etwas Flexibles und dann den Teil, der die Kapillare tatsächlich hält. Und so nimmst du einfach die Nadel und steckst sie in die Gummidichtung, um sie zu halten. Man muss also auch mit diesen Glasnadeln vorsichtig sein, denn sie sind sehr scharf, und wenn man sich selbst sticht, bricht man ein Stück Glas ab und hinterlässt es unter der Haut, und das tut irgendwie weh.

Ich finde also, dass das beste Röhrchen, um Ihre Plasma-DNA mit schnellem grünem Farbstoff zu halten, ein kleines PCR-Röhrchen ist. Also werde ich jetzt gleich etwas Farbe in die Kapillare aufsaugen. Okay. Und wenn du das tust, achte darauf, dass du die Unterseite der Nadel nicht mit der Unterseite der Tube berührst, da du sie sonst zerbrichst und von vorne beginnen musst.

Okay, jetzt ist die Nadel geladen. Wir sind bereit zu spritzen. Also habe ich den Embryo jetzt unter dem Zielfernrohr so ausgerichtet, dass der Kopf zu mir zeigt.

Und ich nehme die Glasnadel, die den schnellen grünen Farbstoff sowie die DNA enthält, und verwende einen flachen Winkel. Stecken Sie die Spitze in das Neuralrohr, in das Lumen des Neuralrohrs. Und Sie müssen aufpassen, dass Sie nicht durch die andere Seite gehen, denn dann wird der Farbstoff unter den Embryo injiziert.

Also habe ich jetzt den Embryo unter dem Mikroskop so ausgerichtet, dass der Kopf zu mir zeigt. Ich werde meine Nadel nehmen, die mit schnellem grünem Farbstoff und DNA gefüllt ist, und einen flachen Winkel verwenden. Ich werde das Neuralrohr punktieren, damit ich das Lumen des Neuralrohrs füllen kann.

Und wenn Sie das tun, müssen Sie darauf achten, nicht zu weit zu gehen und durch die andere Seite des Neuralrohrs zu drücken, denn dann injizieren Sie Ihre DNA unter den Embryo. Sie können jetzt sehen, dass das Neuralrohr ein wenig mit diesem schnellen grünen Farbstoff gefüllt ist, wenn er tatsächlich unter dem Embryo ausgetreten ist. Im Idealfall möchten Sie nicht, dass das passiert.

Sie möchten nur das Neuralrohr gefüllt haben, aber Sie sollten in der Lage sein, das Neuralrohr vom Kopf bis hinunter zum Schwanz zu füllen. Jetzt, da wir die DNA tatsächlich in das Neuralrohr injiziert haben, sind wir bereit, die Elektroporation selbst durchzuführen. Und der Elektroporationsapparat ist das, was hier direkt neben mir steht.

Es besteht also aus mehreren Teilen. Der erste Teil sind die Platinelektroden. Sie werden in einem Elektrodenhalter gehalten, der von einem Mikromanipulator gehalten wird, mit dem die Elektroden angehoben und abgesenkt werden können, während sie ihre richtige Position beibehalten

Die Elektroden werden an Kabeln befestigt, und die Kabel sind an einem Impulsgenerator befestigt. Und der Impulsgenerator wird verwendet, um kurze elektrische Impulse zwischen den Elektroden zu erzeugen, um die DNA tatsächlich in eine Seite des Neuralrohrs zu zwingen. Wenn wir den Embryo pulsieren, verwenden wir in der Regel einen 25-Volt-Impuls.

Wir machen fünf Impulse, die 50 Millisekunden dauern, und das über einen Zeitraum von fünf Sekunden. Es sind also nur fünf kurze Stromimpulse. Jetzt haben wir also die Elektroden im Mikrom-Manipulator direkt über dem Embryo positioniert.

Ich werde die Elektroden vorsichtig auf den Embryo absenken, so dass sie parallel zum Neuralrohr verlaufen. Dann werde ich ein wenig Medium auftragen, um die Leitfähigkeit der Elektrizität zu verbessern. Und dann tatsächlich den Embryo Rio pulsieren.

Sie können sehen, dass sich auf der Elektrode Blasen bilden. Das ist ein gutes Zeichen, das darauf hinweist, dass die Elektrodenperson tatsächlich gearbeitet hat und Sie die Verbindung hergestellt haben, die Sie herstellen mussten. Und jetzt ziehe ich nur noch sanft die Elektroden aus dem Embryo nach oben, und jetzt ist der Embryo bereit, versiegelt zu werden.

Jetzt habe ich dir gezeigt, wie du das Ei mit Elektro vorführen kannst. Der letzte Schritt ist auch sehr wichtig, nämlich das Ei wieder zu verschließen, damit es sich weiter entwickeln kann. Wie ich bereits erwähnt habe, ist die Feuchtigkeit sehr wichtig für die weitere Entwicklung des Embryos.

Und so müssen Sie sicher sein, dass Sie den Embryo richtig versiegelt haben. Um dies zu tun, nimmst du einfach ein weiteres Stück Klebeband, legst es über das Loch, aber achte sehr darauf, dass du das Stück Klebeband an den Rändern vollständig versiegelt hast, damit du keine Feuchtigkeit im Ei verlierst. Und dann muss das Ei nur noch in den Brutkasten gesteckt werden und sich bis zu dem Stadium entwickeln, in dem Sie es analysieren möchten.

Abschließend habe ich Ihnen heute gezeigt, wie man Hamburger- und Hamilton-Hühnerembryonen im Stadium 10 isst, und insbesondere, wie man das Neuralrohr dieser Embryonen isst. Die kritischen Aspekte des Protokolls, die ich Ihnen gerade gezeigt habe, bestehen darin, den Embryo zunächst zu fenstern, ohne ihn zu beschädigen. Zweitens, die DNA wieder in das Neuralrohr zu injizieren, ohne den Embryo zu beschädigen.

Und drittens die richtige Platzierung der Elektroden, die entscheidend ist, um die DNA während des Elektroporationsschritts tatsächlich dorthin zu bringen, wo Sie sie haben möchten. Zum Schluss möchte ich Sie noch daran erinnern, dass es wichtig ist, das Ei richtig zu verschließen, bevor Sie es wieder in den Brutkasten legen. Wenn wir DNA essen, verwenden wir ein Plasmid, das einen GFP-Reporter hat, und wir verwenden diesen GF-Reporter im Allgemeinen als Indikator für die Expression unseres interessierenden Gens.

Nach der Elektroporation können Sie in der Regel innerhalb von sechs bis 12 Stunden mit einer GFP-Expression rechnen. Dies bedeutet jedoch nicht unbedingt, dass Ihr Protein von Interesse auf dem optimalen Niveau exprimiert wurde. Wenn Sie also diese Experimente durchführen, sollten Sie die Embryonen zwischen einem und zwei Tagen nach der Elektroporation analysieren, um das optimale Expressionsniveau zu erhalten.

Viel Glück bei Ihren Experimenten und vielen Dank fürs Zuschauen.