Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf ¹⁵ N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Proteine zu identifizieren, die spezifisch mit einem bestimmten Zielprotein in Zellextrakten interagieren, die lösliche Proteine und Membranproteine enthalten. Erstens, erreichen Sie eine vollständige metabolische Markierung von Chlamydomonas-Zellen mit Stickstoff 14 und Stickstoff 15 und erzeugen Sie Zelllysate, die ein TP enthalten und fehlen. Ein optionaler Vernetzungsschritt hilft, transiente Protein-Protein-Wechselwirkungen zu stabilisieren. Als nächstes werden die Zelllysate in Fraktionen, angereicherte unlösliche Proteine und Membranproteine getrennt, aus denen das Zielprotein, seine spezifischen Interaktionspartner, besteht.

Ein Kontrollprotein und kontaminierende Proteine werden immunpräzipitiert und angedeutet. Mischen Sie nun die immunpräzipitierten Proteine und verdauen und analysieren Sie sie dreifach mit Tandem-LCMS. Die Ergebnisse unterschieden zwischen wahren und falschen Interaktionspartnern, indem sie unterschiedliche Stickstoff-, 14-, Stickstoff-15-Peptid-Verhältnisse für Proteine, die spezifisch mit dem Zielprotein interagieren, und gleichen Stickstoff zeigten.

14 Stickstoff-15-Peptid-Verhältnisse für das Zielprotein, das Kontrollprotein und kontaminierende Proteine. Das Verfahren der Wahl zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen besteht darin, das Protein der Wahl direkt mit seiner Wechselwirkung zu immunpräzipitieren. Partner aus Zellextrakten, bei denen beide in ihrer nativen Bestätigung und Konzentration vorliegen.

Dabei werden aber auch kontaminierende Proteine ausgefällt, vor allem weil sie mit den verwendeten Antikörpern interagieren, da moderne Massenspektrometer extrem empfindlich sind. Sie werden auch die kontaminierenden Proteine eindeutig identifizieren, so dass es unmöglich ist, Fehler von echten Interaktionspartnern zu unterscheiden. Dieses Problem wird durch die hier gezeigte Technik überwunden, die auf 15 N metabolischer Markierung, Immunpräzipitationsaffinitätsmodulation, hier vermittelt durch den A-TP-Zustand und quantitative Massenspektrometrie basiert.

Die Technik wird von Stefan SCH Malinger gezeigt, der als Doktorand in meinem Labor arbeitet. Nach der Markierung der Zellen für 10 Generationen übertragen Sie jeweils zwei Aliquots von Stickstoff 14 und Stickstoff 15 markierten Chlamydomonas-Zellen in 4G SA-Röhrchen, ernten sie durch Zentrifugation Resus, suspendieren Sie die Pellets in zwei Millilitern eiskaltem Lysepuffer und um die Suspensionen in 15 Milliliter Falcon-Röhrchen zu übertragen, sammeln Sie die restlichen Zellen mit jeweils einem weiteren Milliliter Lysepuffer zu jedem Eloqua. Geben Sie 50 Mikroliter 25 x Proteaseinhibitor und 12,5 Mikroliter eines molaren Magnesiumchlorid-Ultraschallprobens viermal 20 Sekunden auf Eis für die vollständige Zell-ISIS mit 22. Pausen dazwischen zum Abkühlen.

Bereiten Sie vier Sechs-Milliliter-Saccharosekissen in dünnwandigen Röhrchen SW 41 TI vor. Legen Sie vorsichtig das gesamte Volumen der Zelllysate auf die Saccharosekissen. Gleichgewicht mit Lyse, Puffer und Zentrifuge, um lösliche Proteinkomplexe von Membranen zu trennen.

Übertragen Sie die löslichen Proteinkomplexe von der Spitze des Gradienten in vier 15-Milliliter-Falkenröhrchen. Achten Sie darauf, dass Sie keine Teile des Saccharosekissens übertragen. Geben Sie dann zu jeder Probe 10 % Triton X 100 bis zu einer Endkonzentration von 0,5 %, mischen Sie vorsichtig und fügen Sie Lysepuffer bis zu einem Gesamtvolumen von sieben Millilitern hinzu.

Für SDS-Seiten und Immunblutanalysen. Legen Sie 70 Mikroliter jedes löslichen Zellextrakts in ein frisches konisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 70 Mikroliter von zwei XSDS-Probenpuffern hinzu. Entsorgen Sie anschließend die Saccharosekissen aus den dünnwandigen Röhrchen SW 41 TI und fügen Sie jedem Pellet drei Milliliter Lysepuffer hinzu.

Geben Sie einen Milliliter 10%tritton x 100 zu einer Endkonzentration von 2%Nachdem Sie jedes Pellet durch Ultraschall aufgelöst haben, geben Sie Lysepuffer auf ein Gesamtvolumen von fünf Millilitern und zentrifugieren Sie. Ernten Sie wie zuvor die oberen Fraktionen der Membranproteinkomplexe in 15-Milliliter-Falkenröhrchen. Lysepuffer mit 2%tritton X 100 bis zu einem Endvolumen von sieben Millilitern zugeben.

Verwenden Sie 70 Mikroliter dieser Proben für SDS-Seiten- und Immunblutanalysen. Zuerst wird das Antikörper-gekoppelte Protein äquilibriert. Ein Sero-Kügelchen mit zwei Waschungen von vier Millilitern Lysepuffer verdünnen auf acht Milliliter und aliquotieren.

Ein Milliliter der Suspension zu jedem der acht 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen, die lösliche oder Membranproteinkomplexe aus einer TP-gefüllten und einer TP-abgereicherten Stickstoff-14- und Stickstoff-15-markierten Zellen enthalten, inkubieren zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einer Röhrchenwalze, um Proteinkomplexe auszufällen, und pelletieren die Kügelchen durch Zentrifugation, Entsorgen Sie die Überstände und lassen Sie ein kleines Volumen Flüssigkeit auf den Kügelchen, um eine Kontamination durch Proteine zu verhindern, die an den Kunststoffwänden haften. Übertragen Sie die Proben in frische konische 1,5-Milliliter-Röhrchen, um alle verbleibenden Kügelchen in den Falkenröhrchen zu sammeln. Geben Sie weitere 0,8 Milliliter Lysepuffer mit 0,1 % Tritton zu jedem Wirbel, zentrifugieren Sie vorsichtig und übertragen Sie den Puffer mit den Restkügelchen auf die Einor-Röhrchen Nach mehreren Waschschritten zentrifugieren Sie die Proben 15 Sekunden lang bei 16, 100 mal G und vier Grad Celsius.

Entfernen Sie zuerst die Probenüberstände mit einer normalen Pipette. Entfernen Sie dann den restlichen Überstand vollständig mit der 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze. Zu jeder Probe werden 100 Mikroliter frisch zubereiteter Elutionspuffer hinzugefügt und in einem Thermomischer bei 800 U/min inkubiert, die Proben 15 Sekunden lang bei 16, 100 G und 25 Grad Celsius zentrifugiert.

Übertragen Sie nun jeden Überstand mit einer sauberen 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze in ein frisches Röhrchen. Geben Sie außerdem 50 Mikroliter Elutionspuffer wie bei den vorherigen Proben in den Beads-Prozess und poolen Sie die jeweiligen Elate. Denken Sie daran, 30 Mikroliter aller Proben-EITs für SDS-Seiten- und Immunblutanalysen zu reservieren.

Kombinieren Sie nun die entgangenen Ausfällungen aus plus und minus A TP, behandeltem Stickstoff 14 und Stickstoff 15, markierten löslichen Proteinen und Membranproteinen. Führen Sie dann eine Reduktionsalkylierung und einen anfänglichen Harnstoffaufschluss durch, wie im begleitenden Manuskript beschrieben. Fahren Sie mit einer Triptychon-Zusammenfassung auf einem Rotationsrad für mindestens 16 Stunden fort.

Bei 37 Grad Celsius. Pelletieren Sie die Tripsin-Kügelchen mit einer fünfminütigen Zentrifugation bei 16, 100 g und vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Überstände in frische zwei Milliliter Einorröhrchen.

Waschen Sie die alten Tuben mit 50 Mikrolitern 20 millimolaren Ammoniumbicarbonat, 0,5% Essigsäure und befeuchten Sie sie mit den ersten Überständen. Um selbstgemachte C 18 Spitzen zum Entsalzen der Proben vorzubereiten, schneiden Sie mit einer Spritzennadel zwei Scheiben aus emcor C 18 Material aus und stecken Sie diese in eine 200 Mikroliter Pipettenspitze. Stanzen Sie dann Löcher in die Deckel von vier Zwei-Milliliter-Einor-Röhrchen und setzen Sie die Spitzen ein, konditionieren Sie die Spitzen der Stufe C 18 mit 50 Mikrolitern Lösung B, zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 800 G und 25 Grad Celsius.

Als nächstes äquilibrieren Sie die Spitzen der Stufe C 18 mit 100 Mikrolitern Lösung, einer Zentrifuge für drei Minuten bei 800 G und 25 Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Äquilibrierungsschritt noch einmal. Anschließend werden 100 Mikroliter der Probenüberstände aus den Triptychonaufschlüssen auf die Spitzenzentrifuge der Stufe C 18 geladen, die drei Minuten lang bei 800 g und 25 Grad Celsius zentrifugiert wird.

Wiederholen Sie das Laden der Säule, um die Probenüberstände vollständig aufzutragen. Nach dem Waschen der Spitzen der Stufe C 18 eluieren Sie die tryptischen Peptide in ein frisches 1,5-Milliliter-Einorröhrchen mit 50 Mikrolitern Lösung B-Zentrifuge für drei Minuten bei 800 g und 25 Grad Celsius. Wiederholen Sie den elucianischen Schritt einmal und trocknen Sie die Peptide dann bis zur Fertigstellung in einer Geschwindigkeit VAC reus.

Die getrockneten Peptide werden in 20 Mikrolitern Lösung A suspendiert und mindestens eine Stunde lang auf Eis inkubiert, unterbrochen von zwei 15-minütigen Inkubationen in einer Ultraschallbadzentrifuge für 20 Minuten bei 16, 100 mal G und vier Grad Celsius und Senna auf nano C-M-S-M-S HSP 70 aufgetragen. Es ist bekannt, dass Hitzeschockproteine mit spezifischen cos-Chaperonen und Substraten interagieren: Nur in Abwesenheit eines TP in diesen Stickstoff-14-markierten Zellextrakten sind hs, P, 70, B und CGE eins fast ausschließlich an die lösliche Fraktion lokalisiert, unabhängig vom A-TP-Zustand. Im Gegensatz dazu ist CF one beta sowohl an die lösliche als auch an die membranangereicherte Fraktion lokalisiert.

Da die Beschallung einen Teil von CF one beta von der Membran A TP Synthes abschert, dient sie als Belastungskontrolle für beide Fraktionen. Ähnliche Mengen von H HSP 70 B wurden mit den Anti-HSP 70 B-Antikörpern aus Stickstoff 14 und Stickstoff 15 markierten löslichen Extrakten unabhängig vom A TP-Zustand ausgefällt. Im Gegensatz dazu wurden geringe Konzentrationen des HS P 70 B-Proteins, das aus Membranfraktionen ausgefällt wurde, mit etwas größeren Mengen, die aus TP-abgereicherten Membranfraktionen stammten, im Vergleich zu TP-gefüllten Fraktionen als erwartete Affinität von CGE E eins zu hs.

P 70 B ist kontextabhängig. Kein CGE wurde mit HS P 70 B.In einer TP-gefüllten löslichen oder Membranfraktion co-präzipitiert. Die Mengen an CGE-1-Protein, die mit HS P 70 B aus einer TP-abgereicherten, löslichen Fraktion und einer TP-abgereicherten Membranfraktion ausgefällt werden, korrelieren quantitativ mit der Menge an gefälltem HSP 70 B. Die Wechselwirkung von CGE 1 mit HS P 70 B nur im Zustand A DP wird auch bei der Analyse mittels Massenspektrometrie beobachtet.

In diesem Versuch wurden Ausfällungen für Gemische aus Stickstoff hergestellt: 14 markierte Extrakte, denen ein TP fehlte, und Stickstoff, 15 markierte Extrakte, die A TP enthielten. Während die schwere und die leicht markierte Form des HS P 70 B-Peptids bei gleichen Intensitäten nachgewiesen wurden, wurde nur die leicht markierte Form des CGE-Peptids ein Peptid aus den A TP-depletierten Extrakten nachgewiesen. Die gleichen Peptide aus dem Anti-HS P 70 D DB-Präzipitat, das aus Mischungen von reziprok markierten löslichen Zellextrakten gewonnen wurde, sind hier dargestellt. Dementsprechend wurde nur die schwer markierte Form des CGE one Peptids in einem TP depletierten Extrakten sowie sowohl die leicht als auch schwer markierten HSP 70 B Peptide nachgewiesen.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie einen guten Eindruck davon haben, wie man ein Fällungsexperiment mit Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse durchführt. Vergessen Sie nicht, dass Verunreinigungen mit menschlichem Protein, insbesondere Keratin, Ihre Prophy-Messungen im Massenspektrometer stören und daher Sicherheitsvorkehrungen wie Handschuhe, saubere Umgebung und LCMS-Bereiche bei der Durchführung dieses Verfahrens von entscheidender Bedeutung sind.