Name: Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf 15 N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Erfahren Sie die QUICK-Methode zur Identifizierung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen mit 15N-metabolischer Markierung, Immunpräzipitation und quantitativer Massenspektrometrie.

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Wir danken Olivier Vallon für den Antiserum gegen CF1β. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (Systems Biology Initiative FORSYS, Projekt GoFORSYS) unterstützt.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine Vernetzung Schritt zur Erfassung transienter Protein-Protein-Interaktionen (QUICK-X), und eine Steuereinheit Niederschläge für ungleiche Niederschläge Wirkungsgrade 6 normalisieren: Wir haben vor kurzem zwei Verbesserungen an der QUICK Ansatz eingeführt. Hier haben wir ein Protokoll, das zwei weitere Verbesserungen der QUICK präsentieren: Zunächst ersetzen wir SILAC 5 für 15 N metabolische Markierung. Die Vorteile sind, dass 15 N metabolische Markierung viel billiger als SILAC ist, wenn 15 N als einfache anorganische Salz versehen ist. Weiterhin mit 15 N metabolische Markierung QUICK können Organismen prototrophen für alle Aminosäuren angewendet werden, wie die meisten Pflanzen, Pilzen und Bakterien. Und schließlich ist Arginin-zu-Prolin Interkonversion inhärent SILAC 5,6 kein Problem für die Quantifizierung von 15 N markierten Peptiden. Beispiele für geeignete Instrumente für die quantitative Auswertung von 15 N Proteomik-Daten sind MSQUANT 12 oder IOMIQS 13. Zweitens stellen wir Affinität Modulation als Mittel zur gezielten Verringerung der Menge an Proteinen Interagieren mit einer gegebenen Zielproteins in einer Probe gegenüber einem anderen. Die Vorteile dieser Vorgehensweise sind, dass sie den Bau von Knockdown-Mutanten, die für einige Modellsysteme sind schwer zu erzeugen oder gar nicht bei wesentlichen Zielproteine ​​erzeugt werden umgeht. Ferner vermeidet sie Fehlinterpretationen durch differentielle Proteinexpression eventuell auftretende als Antwort der Zelle auf Klopfen Niederhalter ein Zielprotein verursacht: wenn andere Proteine ​​herabreguliert sind so gut und mit dem Antiserum für die Immunpräzipitation eingesetzt kreuzreagieren, würden sie interpretiert werden als wahr Interaktionspartner des Zielproteins. Endlich hebt Affinität Modulation die Notwendigkeit der Suche nach einem geeigneten Antikörper-to-Antigen-Verhältnis. Obwohl wir unser Protokoll Chlamydomonas reinhardtii als Modellorganismus, Kann es leicht zu einem anderen Organismus, in Zellkultur gezüchtet werden können und in der Lage ist Ammonium oder Nitrat als Stickstoffquelle zu verwenden angepasst werden. Affinität Modulation von Proteinkomplexen durch ATP / ADP kann direkt an andere Chaperone, deren Wechselwirkung mit Substraten und Kohorte Proteine ​​hängt vom ATP Zustand aufgetragen werden, wie die GroEL/HSP60/Cpn60 oder HSP90 Chaperonsysteme 14,15, oder zu einem anderen System, bei dem Bindungsaffinitäten sind moduliert durch ATP. Affinität Modulation sollte auch für Fälle, in denen Affinitäten zwischen Protein-Wechselwirkungen durch spezifische Medikamente, wie Radicicol oder Geldanamycin im Fall von HSP90-Systeme 15 verändert werden arbeiten. Eine klare Beschränkung unserer Protokoll ist, dass es erfordert affinitätsgereinigten Antikörper gegen ein Zielprotein bekanntlich empfindlich auf eine spezifische Behandlung / Medikament, seine Affinität für Partner Proteine ​​moduliert. Daher ist es nicht Hochdurchsatzverfahren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimethyl pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Bewahren Sie trocken bei -20 ° C, direkt auflösen, bevor verwenden </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor (komplett, EDTA-free) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatinphosphat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatinphosphokinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [Succinimidylpropionat] </td><td> Thermo Sientific </td><td> 22585 </td><td> Bewahren Sie trocken bei 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge Isotopen Laboratorien, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteinase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin Perlen (Poroszyme immobilisiertem Trypsin) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Gründlich mischen unmittelbar vor Gebrauch </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm Scheibe </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll für die identifizierung von protein-protein-wechselwirkungen basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; n metabolische markierung, immunpräzipitation, quantitative massenspektrometrie und affinity modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind für viele biologische Prozesse in der Zelle von grundlegender Bedeutung. Deshalb spielt deren Charakterisierung eine wichtige Rolle in der gegenwärtigen Forschung und eine Vielzahl von Methoden für ihre Untersuchung steht ein. Protein-Protein Wechselwirkungen sind oft sehr dynamisch und kann auf der subzellulären Lokalisation, posttranslationale Modifizierungen und dem lokalen Proteinumgebung 2 abhängen. Daher sollten sie in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden, für die Co-Immunopräzipitation Ansätze die Methode der Wahl 3 sind. Co-gefällte Interaktionspartner werden entweder durch Immunoblotting in einem zielgerichteten Ansatz oder durch Massenspektrometrie (LC-MS/MS) in einer ungezielte Weise identifiziert. Die letztgenannte Strategie wird oft negativ von einer großen Zahl von falsch positiven Entdeckungen, vor allem aus der hohen Empfindlichkeit der modernen Massenspektrometern, die selbstbewusst erkennt Spuren von unspezifisch Ausfällen von Proteinen abgeleitet betroffen. A recent Ansatz zur Überwindung dieses Problems liegt der Gedanke zugrunde, dass verringerte Mengen an spezifischen Bindungspartner wird Copräzipitat mit einer gegebenen Zielprotein deren zelluläre Konzentration wird durch RNAi reduziert, während die Mengen an unspezifisch Ausfällen von Proteinen sein sollte unberührt. Dieser Ansatz, genannt QUICK zur quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown 4 Kombinierte beschäftigt Stable Isotope Labeling von Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) 5 und MS, um die Mengen von Proteinen aus Wildtyp-und knock-down Stämme immunpräzipitiert quantifizieren. Proteinen in einem Verhältnis von 1:1 zu finden ist als Verunreinigungen, die in Ausscheidungen vom Wildtyp als spezifische Bindungspartner des Zielproteins angereichert betrachtet werden. Obwohl innovative trägt QUICK einige Einschränkungen: Erstens ist SILAC kostenintensiv und beschränkt auf Organismen, die im Idealfall auxotroph für Arginin und / oder Lysin. Außerdem, wenn schwere Arginin eingespeist wird, Arginin-zu-Prolin Umwandlung führt additional Masse verschiebt für jeden Prolin in einem Peptid und leicht verdünnt schwere mit Licht Arginin, die Quantifizierung mühsamer und weniger genau 5,6 macht. Zweitens erfordert QUICK dass Antikörper titriert sind, dass sie nicht in die Sättigung mit Zielprotein in Extrakten aus knock-down-Mutanten. Hier stellen wir ein modifiziertes Quick-Protokoll, das die obengenannten Einschränkungen von SCHNELL durch Ersetzen SILAC für 15 N metabolische Markierung und durch Ersetzen RNAi-vermittelte knock-down für Affinität Modulation von Protein-Protein-Wechselwirkungen überwindet. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Protokolls unter Verwendung der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii als Modellorganismus und der Chloroplasten HSP70B Chaperon als Zielprotein 7 (Abbildung 1). HSP70s sind dafür bekannt, mit speziellen Co-Chaperone und Substrate nur in der ADP Zustand 8 interagieren. Wir nutzen diese Eigenschaft als ein Mittel, um den spezifischen überprüfenZusammenspiel von HSP70B mit seinen nucleotide exchange factor CGE1 9.

Wir präsentieren eine Variation der QUICK (quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown kombiniert) Ansatz, der zuvor wurde eingeführt, um zwischen wahr und falsch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden. Unser Ansatz basiert auf<sup&gt; 15N</sup&gt; Metabolische Markierung, die Modulation der Affinitäten von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch die Anwesenheit / Abwesenheit von ATP, Immunpräzipitation und quantitative Massenspektrometrie.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-Protein-Interaktionen sind grundlegend für viele biologische Prozesse in der Zelle. Daher spielt ihre Charakterisierung eine wichtige Rolle bei ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Proteine zu identifizieren, die spezifisch mit einem gegebenen Zielprotein in Zelllysaten interagieren, die lösliche und Membranproteine enthalten. Zunächst erfolgt eine vollständige metabolische Markierung von Chlamydomonas-Zellen mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 sowie die Herstellung von Zelllysaten mit und ohne ein TP. Ein optionaler Vernetzungsschritt dient der Stabilisierung vorübergehender Protein-Protein-Interaktionen. Anschließend werden die Zelllysate in Fraktionen getrennt, angereichert an unlöslichen und Membranproteinen, aus denen das Zielprotein und seine spezifischen Interaktionspartner gewonnen werden.Ein Kontrollprotein und kontaminierende Proteine werden immunpräzipitiert und eluiert. Nun mischen Sie die immunpräzipitierten Proteine, verdauen sie dreifach und analysieren sie mittels tandem LCMS. Die Ergebnisse unterscheiden zwischen echten und falschen Interaktionspartnern, indem sie unterschiedliche Stickstoff-Isotopenverhältnisse, 14-Stickstoff-15-Peptid-Verhältnisse für Proteine, die spezifisch mit dem Zielprotein interagieren, und gleiche Stickstoffverhältnisse zeigen.14 Stickstoff-15-Peptid-Verhältnisse für das Zielprotein, das Kontrollprotein und kontaminierende Proteine. Die Methode der Wahl zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen besteht darin, das gewünschte Protein direkt mit seinen Interaktionspartnern aus Zelllysaten, in denen beide in ihrer nativen Konformation und Konzentration vorliegen, immunpräzipitieren zu lassen.Jedoch werden dabei auch kontaminierende Proteine präzipitiert, hauptsächlich weil sie mit den Antikörpern interagieren, da moderne Massenspektrometer äußerst empfindlich sind. Sie werden eindeutig auch die kontaminierenden Proteine identifizieren und es somit unmöglich machen, echte Interaktionspartner von Hintergrundsignalen zu unterscheiden. Dieses Problem wird durch die hier gezeigte Technik umgangen, die auf 15N-metabolischer Markierung, immunpräzipitativer Affinitätsmodulation – hier vermittelt durch den ATP-Zustand – und quantitativer Massenspektrometrie basiert.Die Technik wird von Stefan SCH Malinger gezeigt, der ein erfahrener Doktorand in meinem Labor ist. Nach der Markierung der Zellen über 10 Generationen werden jeweils zwei Aliquote der mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 markierten Chlamydomonas-Zellen in 4G-SA-Röhrchen überführt, durch Zentrifugation gesammelt, die Pellets in zwei Milliliter eiskaltem Lysepuffer resuspendiert und die Suspensionen in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen übertragen. Die verbleibenden Zellen werden mit jeweils einem zusätzlichen Milliliter Lysepuffer pro Eloqua gesammelt. 50 Mikroliter 25×-Proteaseinhibitor und 12,5 Mikroliter einmolar Magnesiumchlorid zugeben, die Proben viermal 20 Sekunden lang auf Eis sonifizieren, jeweils mit 20-sekündigen Pausen zur Kühlung, um eine vollständige Zelllyse zu gewährleisten.Bereiten Sie vier sechs Milliliter schwere Saccharose-Polster in SW 41 TI Dünnwandröhrchen vor. Geben Sie das gesamte Volumen der Zelllysate vorsichtig auf die Saccharose-Polster. Wägen Sie mit Lysepuffer aus und zentrifugieren Sie, um lösliche Protein-Komplexe von Membranen zu trennen.Überführen Sie die löslichen Protein-Komplexe von der Oberseite der Gradienten in vier 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Bestandteile des Saccharosepolsters mitübertragen werden. Geben Sie dann jedem Probenansatz Triton X-100 10 % bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % hinzu, mischen Sie vorsichtig und ergänzen Sie Lysepuffer auf ein Gesamtvolumen von sieben Millilitern.Für SDS-Gelelektrophorese und Immunblot-Analysen. 70 Mikroliter jedes löslichen Zelllysats in ein frisches 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen abgeben und 70 Mikroliter 2× SDS-Probelösung zugeben. Anschließend die Saccharosecushions aus den dünnwandigen SW-41-TI-Röhrchen verwerfen und zu jedem Pellet 3 Milliliter Lysepuffer hinzufügen.Geben Sie ein Milliliter 10 % Triton X-100 hinzu, um eine Endkonzentration von 2 % zu erreichen. Nach dem Auflösen jedes Pellets durch Beschallung fügen Sie Puffer zur Zelllyse hinzu, um ein Gesamtvolumen von fünf Millilitern zu erreichen, und zentrifugieren Sie die Probe. Wie zuvor sammeln Sie die oberen Fraktionen der Membranproteinkomplexe in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Geben Sie Lysispuffer mit 2 % Triton X-100 hinzu, um ein Endvolumen von sieben Millilitern zu erreichen.Verwenden Sie 70 Mikroliter dieser Proben für die SDS-Gelelektrophorese und immunologische Blutanalysen. Puffern Sie zunächst das antikörpergekoppelte Protein an. Eine Sero-Beads-Lösung mit zwei Vier-Milliliter-Waschschritten in Lysepuffer auf acht Milliliter verdünnen und aliquotieren.Ein Milliliter der Suspension wird jeweils in acht 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen gegeben, die lösliche oder membranassoziierte Protein-Komplexe aus stickstoff-14- und stickstoff-15-markierten Zellen mit oder ohne TP enthalten, und zwei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchenroller inkubiert, um die Protein-Komplexe auszufällen. Die Kügelchen werden durch Zentrifugation pelletiert, das Überstand wird verworfen, wobei eine kleine Flüssigkeitsmenge über den Kügelchen verbleibt, um eine Kontamination durch an die Kunststoffwände adhärierende Proteine zu vermeiden. Die Proben werden in frische 1,5-Milliliter-Konusröhrchen überführt, um alle verbleibenden Kügelchen aus den Falcon-Röhrchen zu sammeln. Zu jedem Ansatz werden weitere 0,8 Milliliter Puffer mit 0,1 % Triton zugegeben, vorsichtig verwirbelt, kurz zentrifugiert und der Puffer mit den Restkügelchen in die Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach mehreren Waschschritten werden die Proben 15 Sekunden bei 16.100 × g und vier Grad Celsius zentrifugiert.Entfernen Sie zuerst die Probenüberstände mit einer normalen Pipette. Danach entfernen Sie jeglichen verbleibenden Überstand vollständig mit der 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze. Geben Sie zu jeder Probe 100 Mikroliter frisch zubereiteten Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie die Proben in einem Thermomixer bei 800 U/min, zentrifugieren Sie 15 Sekunden bei 16.100 × g und 25 °C.Überführen Sie nun jedes Überstand auf ein frisches Röhrchen, indem Sie eine saubere 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze verwenden. Geben Sie außerdem 50 Mikroliter Elutionspuffer zu den Perlen hinzu, genauso wie zuvor bei den Proben, und vereinigen Sie die jeweiligen Eluate. Denken Sie daran, jeweils 30 Mikroliter aller Proben-EITs für die SDS-Page- und Immuno-Blot-Analysen zurückzuhalten.Vereinigen Sie nun die eluierten Präzipitate aus den mit ATP behandelten und nicht behandelten, mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 markierten löslichen und membranständigen Proteinen. Führen Sie anschließend die Reduktion, Alkylierung und den initialen Verdau in harnstoffhaltigem Puffer wie in der begleitenden Veröffentlichung beschrieben durch. Setzen Sie den Verdau dann im Triptych-Verfahren auf einer Rotationsrolle für mindestens 16 Stunden fort.Bei 37 Grad Celsius. Pelletieren Sie die Trypsinkügelchen durch eine fünfundzwanzigminütige Zentrifugation bei 16.100 × g und 4 Grad Celsius. Überführen Sie die Überstände in frische 2-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen.Waschen Sie die alten Röhrchen mit 50&nbsp;Mikrolitern 20&nbsp;Millimolar Ammoniumbicarbonat, 0,5&nbsp;% Essigsäure und vereinigen Sie sie mit den ersten Überständen. Um selbst hergestellte C&nbsp;18-Spitzen zur Entsalzung der Proben vorzubereiten, schneiden Sie zwei Scheiben aus Emcor-C&nbsp;18-Material mit einer Spritzennadel aus und setzen Sie sie in eine 200&nbsp;Mikroliter-Pipettenspitze ein. Stanzen Sie anschließend Löcher in die Deckel von vier 2&nbsp;Milliliter fassenden Einer-Röhrchen und setzen Sie die Spitzen ein. Bedingen Sie die C&nbsp;18-Stage-Spitzen mit 50&nbsp;Mikrolitern Lösung B, zentrifugieren Sie drei Minuten bei 800&nbsp;×&nbsp;g und 25&nbsp;Grad Celsius.Als Nächstes equilibrieren Sie die C 18 Stage-Tips mit 100 Mikrolitern Lösung, zentrifugieren Sie drei Minuten bei 800 ×g und 25 °C. Wiederholen Sie diesen Equilibrierungsschritt ein weiteres Mal. Führen Sie danach das Beladen der C 18 Stage-Tips mit 100 Mikrolitern der Probenüberstände aus den Triptych-Verdauungen durch und zentrifugieren Sie drei Minuten bei 800 ×g und 25 °C.Wiederholen Sie das Beladen der Säule, um die vollständige Aufgabe der Probenüberstände sicherzustellen. Nach dem Waschen der C 18-Stage-Tips eluieren Sie die tryptischen Peptide in ein frisches 1,5-Milliliter-Einor-Gefäß mit 50 Mikrolitern Lösung B, zentrifugieren für drei Minuten bei 800 ×g und 25 °C. Wiederholen Sie den Elutionsschritt einmal und trocknen Sie die Peptide anschließend vollständig in einem Speed-VAC-Gerät ein.Suspendieren Sie die getrockneten Peptide in 20 Mikroliter Lösung A und inkubieren Sie mindestens eine Stunde auf Eis, unterbrochen durch zwei 15-minütige Inkubationen in einem Ultraschallbad, anschließend Zentrifugation für 20 Minuten bei 16.100 × g und vier Grad Celsius, und geben Sie Senna auf nano C-M-S-M-S HSP 70. Hitzeschockproteine sind dafür bekannt, nur in Abwesenheit von ATP mit spezifischen Ko-Chaperonen und Substraten zu interagieren; in diesen mit Stickstoff-14 markierten Zellextrakten sind hs P 70 B und CGE eins nahezu ausschließlich in der löslichen Fraktion lokalisiert, unabhängig vom ATP-Zustand. Im Gegensatz dazu ist CF eins beta sowohl in der löslichen als auch in der membranangereicherten Fraktion lokalisiert.Da die Sonikation einen Teil von CF1β vom membranständigen ATP-Synthasekomplex ablöst, dient dieser als Ladekontrolle für beide Fraktionen. Unabhängig vom ATP-Zustand wurden ähnliche Mengen an HSP70B mit anti-HSP70B-Antikörpern aus den mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 markierten löslichen Extrakten präzipitiert. Im Gegensatz dazu wurden geringe Mengen an HSP70B-Protein aus Membranfraktionen präzipitiert, wobei geringfügig höhere Mengen aus ATP-depletierten Membranfraktionen im Vergleich zu ATP-reichen Fraktionen stammten, wie es der erwarteten Affinität von CGE1 zu HSP entspricht.P 70 B ist kontextabhängig. Kein CGE wurde mit HSP 70 B aus TP-reichen löslichen oder membranären Fraktionen mitpräzipitiert. Die Mengen an CGE-Protein, die mit HSP 70 B aus TP-armen löslichen Fraktionen und TP-armen membranären Fraktionen mitpräzipitiert wurden, korrelieren quantitativ mit der Menge an präzipitiertem HSP 70 B. Die Interaktion von CGE mit HSP 70 B ausschließlich im ADP-Zustand wird ebenfalls in der Analyse mittels Massenspektrometrie beobachtet.In diesem Experiment wurden Präzipitate aus Mischungen von mit Stickstoff-14 markierten Extrakten, die kein TP enthielten, und mit Stickstoff-15 markierten Extrakten, die ein TP enthielten, hergestellt. Während die schwer und leicht markierten Formen des HSP70B-Peptids mit gleicher Intensität nachgewiesen wurden, wurde nur die leicht markierte Form des CGE1-Peptids aus den TP-depletierten Extrakten detektiert. Die gleichen Peptide aus dem Anti-HSP70D-DB-Präzipitat, das aus Mischungen von wechselseitig markierten löslichen Zellextrakten gewonnen wurde, sind hier dargestellt. Demnach wurde nur die schwer markierte Form des CGE1-Peptids in TP-depletierten Extrakten nachgewiesen, ebenso wie sowohl die leicht als auch die schwer markierten HSP70B-Peptide.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man ein Koimmunpräzipitationsexperiment mit Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie-Analyse durchführt. Vergessen Sie nicht, dass Kontaminationen mit menschlichen Proteinen, insbesondere Keratin, Ihre Profilanalysen im Massenspektrometer stören können, weshalb Sicherheitsvorkehrungen wie Handschuhe, eine saubere Umgebung und LCMS-reine Bereiche während dieses Verfahrens von entscheidender Bedeutung sind.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Wir bieten eine schrittweise Protokoll für Split-BioID, ein Protein-Fragmente-Ergänzung-Assay basiert auf der Nähe-labeling Technik BioID. Auf das Zusammenspiel der zwei bestimmte Proteine aktiviert, ermöglicht es die Proteomik-Analyse der Kontext-abhängige Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung. Die Methode ist einfach, kostengünstig und erfordert nur standard Laborgeräten.

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Hier stellen wir ein Protokoll für eine On-Membran-Verdauungstechnik zur Vorbereitung von Proben für die Massenspektrometrie vor. Diese Technik erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Identifizierung von Proteinen, die an Inositolphosphate oder Phosphoinositide binden. Es verwendet Affinitätschromatographie mit biotinylierten Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden, die über Streptavidin zu Agarose oder magnetischen Perlen immobilisiert werden. Inositolphosphat oder Phosphoinositid-bindende Proteine werden durch western blotting oder Massenspektrometrie identifiziert.

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) verwendet Durchflusszytometrie zum empfindlichen Nachweis von Unterschieden in der Häufigkeit gezielter Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei Proben. QMI kann mit einer kleinen Menge an Biomaterial durchgeführt werden, erfordert keine gentechnisch veränderten Tags und kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden.

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung und Identifizierung krankheitsspezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen aus nativen Zellen und Geweben mit Hilfe chemischer Sonden und Massenspektrometrie ermöglicht. Die resultierenden Interaktionsdatensätze werden über eine spezielle webbasierte Plattform analysiert, um dynamische Netzwerkdysfunktionen und Veränderungen des Signalwegs im Zusammenhang mit Krankheiten aufzudecken.

Kartierung dysfunktionaler Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Krankheiten

Erfahren Sie die QUICK-Methode zur Identifizierung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen mit 15N-metabolischer Markierung, Immunpräzipitation und quantitativer Massenspektrometrie.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf 15 N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation (Video) | JoVE Journal

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf

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