Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf ¹⁵ N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Proteine zu identifizieren, die spezifisch mit einem gegebenen Zielprotein in Zelllysaten interagieren, die lösliche und Membranproteine enthalten. Zunächst erfolgt eine vollständige metabolische Markierung von Chlamydomonas-Zellen mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 sowie die Herstellung von Zelllysaten, die ein TP enthalten beziehungsweise nicht enthalten. Ein optionaler Vernetzungsschritt dient dazu, vorübergehende Protein-Protein-Interaktionen zu stabilisieren. Anschließend werden die Zelllysate in Fraktionen getrennt, angereichert an unlöslichen und Membranproteinen, aus denen das Zielprotein und seine spezifischen Interaktionspartner gewonnen werden.

Ein Kontrollprotein und verunreinigende Proteine werden immunpräzipitiert und eluiert. Nun mischen Sie die immunpräzipitierten Proteine, verdauen sie dreifach und analysieren sie mittels tandem LCMS. Die Ergebnisse unterschieden zwischen echten und falschen Interaktionspartnern, indem sie unterschiedliche Stickstoff-Isotopenverhältnisse, 14-Stickstoff-15-Peptidverhältnisse für Proteine, die spezifisch mit dem Zielprotein interagieren, und gleiche Stickstoffverhältnisse zeigten.

14 Stickstoff-15-Peptid-Verhältnisse für das Zielprotein, das Kontrollprotein und kontaminierende Proteine. Die Methode der Wahl zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen besteht darin, das gewünschte Protein direkt mit seinen Interaktionspartnern aus Zellextrakten, in denen beide in ihrer nativen Konformation und Konzentration vorliegen, immunpräzipitierend anzureichern.

Bei dieser Vorgehensweise werden jedoch hauptsächlich auch kontaminierende Proteine mitpräzipitiert, da sie mit den verwendeten Antikörpern interagieren, da moderne Massenspektrometer äußerst empfindlich sind. Sie werden eindeutig auch die kontaminierenden Proteine identifizieren, wodurch es unmöglich ist, echte Interaktionspartner von Hintergrundsignalen zu unterscheiden. Dieses Problem wird durch die hier gezeigte Technik umgangen, die auf einer 15N-metabolischen Markierung, immunpräzipitativer Affinitätsmodulation – hier vermittelt durch den ATP-Zustand – und quantitativer Massenspektrometrie beruht.

Die Technik wird von Stefan SCH Malinger gezeigt, der ein fortgeschrittener Doktorand in meinem Labor ist. Nach der Markierung der Zellen über 10 Generationen überführen Sie jeweils zwei Aliquote der mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 markierten Chlamydomonas-Zellen in 4G-SA-Röhrchen, ernten Sie durch Zentrifugation, resuspendieren die Pellets in zwei Milliliter eiskaltem Lysepuffer und überführen die Suspensionen in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Sammeln Sie die verbleibenden Zellen mit jeweils einem zusätzlichen Milliliter Lysepuffer pro Eloqua. Geben Sie 50 Mikroliter 25×-Proteaseinhibitor und 12,5 Mikroliter einmolar Magnesiumchlorid zu, und sonifizieren Sie die Proben viermal 20 Sekunden lang auf Eis mit 22 Sekunden Pause dazwischen zur Kühlung, um eine vollständige Zelllyse zu erreichen.

Bereiten Sie vier sechs Milliliter schwere Saccharose-Polster in SW 41 TI Dünnwandröhrchen vor. Geben Sie vorsichtig das gesamte Volumen der Zelllysate auf die Saccharose-Polster. Wägen Sie mit Lysepuffer aus und zentrifugieren Sie, um lösliche Protein-Komplexe von Membranen zu trennen.

Überführen Sie die löslichen Protein-Komplexe von der Oberseite der Gradienten in vier 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Bestandteile des Saccharosepolsters mitübertragen werden. Geben Sie dann jedem Probenansatz Triton X-100 10 % bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % hinzu, mischen Sie vorsichtig und ergänzen Sie Lysepuffer auf ein Gesamtvolumen von sieben Millilitern.

Für SDS-Gelelektrophorese und immunologische Blutanalysen. Stellen Sie 70 Mikroliter jedes löslichen Zellextrakts in ein frisches 1,5-Milliliter-Konizialröhrchen beiseite und geben Sie 70 Mikroliter zweifach konzentrierter SDS-Probelösungspuffer hinzu. Entsorgen Sie danach die Saccharosecushions aus den dünnwandigen SW-41-TI-Röhrchen und geben Sie drei Milliliter Lysepuffer zu jedem Pellet hinzu.

Geben Sie ein Milliliter 10 % Triton X-100 hinzu, um eine Endkonzentration von 2 % zu erreichen. Nach dem Auflösen jedes Pellets durch Beschallung fügen Sie Puffer zum Lysevorgang hinzu, bis ein Gesamtvolumen von fünf Millilitern erreicht ist, und zentrifugieren Sie die Probe. Wie zuvor sammeln Sie die oberen Fraktionen der Membranproteinkomplexe in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Fügen Sie Lysepuffer mit 2 % Triton X-100 hinzu, bis ein Endvolumen von sieben Millilitern erreicht ist.

Verwenden Sie 70 Mikroliter dieser Proben für die SDS-Gelelektrophorese und immunologische Blutanalysen. Puffern Sie zunächst das antikörpergekoppelte Protein an. Waschen Sie die Sero-Beads mit zwei Portionen je vier Milliliter Lysepuffer, verdünnen Sie auf insgesamt acht Milliliter und portionieren Sie.

Ein Milliliter der Suspension wird jeweils in acht 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen gegeben, die lösliche oder membranständige Protein-Komplexe aus stickstoff-14- und stickstoff-15-markierten Zellen mit und ohne TP enthalten, und zwei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchenroller inkubiert, um die Protein-Komplexe auszufällen. Die Perlen werden durch Zentrifugation pelletiert, das Überstand wird verworfen, wobei eine kleine Flüssigkeitsmenge über den Perlen verbleibt, um Kontamination durch an die Kunststoffwände bindende Proteine zu vermeiden. Die Proben werden in frische 1,5-Milliliter-Konusröhrchen überführt, um alle verbleibenden Perlen aus den Falcon-Röhrchen zu sammeln. Zu jedem Ansatz werden weitere 0,8 Milliliter Lysepuffer mit 0,1 % Triton zugegeben, kurz verwirbelt, vorsichtig zentrifugiert und der Puffer mit den Restperlen in die Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach mehreren Waschschritten werden die Proben 15 Sekunden bei 16.100 × g und vier Grad Celsius zentrifugiert.

Entfernen Sie zuerst die Probenüberstände mit einer normalen Pipette. Danach entfernen Sie jeglichen verbleibenden Überstand vollständig mit der 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze. Geben Sie zu jeder Probe 100 Mikroliter frisch zubereiteten Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie die Proben in einem Thermo-Mixer bei 800 U/min, zentrifugieren Sie 15 Sekunden bei 16.100 × g und 25 °C.

Überführen Sie nun jeden Überstand mit einer sauberen 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze in ein frisches Gefäß. Geben Sie außerdem 50 Mikroliter Elutionspuffer zu den Perlen hinzu, genauso wie zuvor bei den Proben, und sammeln Sie die entsprechenden Eluate. Denken Sie daran, 30 Mikroliter aller Probe-Eluate für die SDS-Page- und Immunschwestern-Analysen zurückzubehalten.

Vereinigen Sie nun die eluierten Präzipitate aus den mit ATP behandelten und nicht behandelten, mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 markierten löslichen und membranständigen Proteinen. Führen Sie anschließend die Reduktion, Alkylierung und den initialen Verdau unter hohem Harnstoffgehalt wie in der begleitenden Veröffentlichung beschrieben durch. Setzen Sie den Verdau dann im Triptych-Verfahren auf einem Rotationswischer für mindestens 16 Stunden fort.

Bei 37 Grad Celsius. Pelletieren Sie die Trypsinkügelchen durch eine fünfundzwanzigminütige Zentrifugation bei 16.100 × g und 4 Grad Celsius. Überführen Sie die Überstände in frische 2-Milliliter-Eppendorfgefäße.

Waschen Sie die alten Röhrchen mit 50 Mikrolitern 20 Millimolar Ammoniumbicarbonat, 0,5 % Essigsäure und vereinigen Sie sie mit den ersten Überständen. Um selbst hergestellte C 18-Spitzen zur Entsalzung der Proben vorzubereiten, schneiden Sie zwei Scheiben aus Emcor-C 18-Material mit einer Spritzennadel aus und fügen Sie sie in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze ein. Stanzen Sie anschließend Löcher in die Deckel von vier 2-Milliliter-Einor-Röhrchen und setzen Sie die Spitzen ein. Bedingen Sie die C 18-Stage-Spitzen mit 50 Mikrolitern Lösung B, zentrifugieren Sie drei Minuten bei 800 ×g und 25 Grad Celsius.

Als Nächstes equilibrieren Sie die C 18 Stage-Tips mit 100 Mikrolitern Lösung, zentrifugieren Sie drei Minuten bei 800 ×g und 25 °C. Wiederholen Sie diesen Equilibrierungsschritt ein weiteres Mal. Führen Sie danach das Beladen der C 18 Stage-Tips mit 100 Mikrolitern der Probenüberstände aus den Triptych-Verdauungen durch und zentrifugieren Sie drei Minuten bei 800 ×g und 25 °C.

Wiederholen Sie das Beladen der Säule, um die vollständige Aufgabe der Probenüberstände sicherzustellen. Nach dem Waschen der C 18-Stage-Tips eluieren Sie die tryptischen Peptide in ein frisches 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen mit 50 Mikrolitern Lösung B, zentrifugieren für drei Minuten bei 800 ×g und 25 °C. Wiederholen Sie den Elutionsschritt einmal und trocknen Sie die Peptide anschließend vollständig in einem Speed-VAC-Gerät.

Suspendieren Sie die getrockneten Peptide in 20 Mikroliter Lösung A und inkubieren Sie mindestens eine Stunde auf Eis, unterbrochen durch zwei 15-minütige Inkubationen in einem Ultraschallbad, anschließend Zentrifugation für 20 Minuten bei 16.100 × g und vier Grad Celsius, und geben Sie Senna auf nano C-M-S-M-S HSP 70. Hitzeschockproteine sind dafür bekannt, nur in Abwesenheit von ATP mit spezifischen Ko-Chaperonen und Substraten zu interagieren; in diesen stickstoff-14-markierten Zellextrakten sind hs P 70 B und CGE 1 nahezu ausschließlich in der löslichen Fraktion lokalisiert, unabhängig vom ATP-Zustand. Im Gegensatz dazu ist CF 1 beta sowohl in der löslichen als auch in der membranangereicherten Fraktion lokalisiert.

Da die Beschallung einen Teil von CF1β vom membranständigen ATP-Synthasekomplex ablöst, dient dieser als Ladekontrolle für beide Fraktionen. Unabhängig vom ATP-Zustand wurden ähnliche Mengen an HSP70B mit anti-HSP70B-Antikörpern aus den mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 markierten löslichen Extrakten präzipitiert. Im Gegensatz dazu wurden geringe Mengen des HSP70B-Proteins aus Membranfraktionen präzipitiert, wobei geringfügig höhere Mengen aus ATP-depletierten Membranfraktionen im Vergleich zu ATP-reichen Fraktionen stammten, wie es der erwarteten Affinität von CGE1 für HSP entspricht.

P 70 B ist kontextabhängig. Kein CGE eins wurde mit HSP 70 B aus TP-reichen löslichen oder membranären Fraktionen mitpräzipitiert. Die Mengen an CGE-eins-Protein, die mit HSP 70 B aus TP-depletierten löslichen Fraktionen und TP-depletierten membranären Fraktionen mitpräzipitiert wurden, korrelieren quantitativ mit der Menge des präzipitierten HSP 70 B. Die Interaktion von CGE eins mit HSP 70 B ausschließlich im ADP-Zustand wird ebenfalls in der Analyse mittels Massenspektrometrie beobachtet.

In diesem Experiment wurden Präzipitate aus Mischungen von mit Stickstoff-14 markierten Extrakten, die kein TP enthielten, sowie von mit Stickstoff-15 markierten Extrakten mit TP hergestellt. Während die schwer und leicht markierten Formen des HSP70B-Peptids mit gleicher Intensität nachgewiesen wurden, wurde nur die leicht markierte Form des CGE1-Peptids aus den TP-depletierten Extrakten detektiert. Die gleichen Peptide aus dem Anti-HSP70D-DB-Präzipitat, gewonnen aus Mischungen von wechselseitig markierten löslichen Zellextrakten, sind hier dargestellt. Demnach wurde nur die schwer markierte Form des CGE1-Peptids aus TP-depletierten Extrakten nachgewiesen, ebenso wie sowohl die leicht als auch die schwer markierten HSP70B-Peptide.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man ein Koimmunpräzipitationsexperiment mit Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie-Analyse durchführt. Vergessen Sie nicht, dass Kontaminationen mit menschlichen Proteinen, insbesondere Keratin, Ihre Profilanalysen im Massenspektrometer stören können, und deshalb sind Sicherheitsvorkehrungen wie Handschuhe, eine saubere Umgebung und LCMS-reine Bereiche während der Durchführung dieses Verfahrens entscheidend.