Name: Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren C elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Lernen Sie, eine kontinuierliche Durchfluss-Hypoxiekammer zur Untersuchung von Sauerstoffmangel bei C. elegans aufzubauen. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle der O₂-Konzentrationen für Entwicklungsbiologie-Studien.

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Wir danken Mitglieder der Miller-Labor für die Diskussion und die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem New Investigator Award von der Nathan Shock Center of Excellence in der Basic Biologie des Alterns zu DLM und den National Institutes of Health Award R00 AG030550 zu DLM unterstützt.

1. Bau von Klimakammern <ol><li> Wählen Sie den kleinsten vernünftigen Volumen der Kammer für den Umfang des Projekts erforderlich sind. Kammer muss aus Gas (O 2) undurchlässigen Material. Pyrex Kristallisation Gerichte, Anaeropack Boxen, oder große Stimmen-Acryl-Boxen (Ellard Instrumentation), verwendet werden kann. Wir haben festgestellt, dass 9 50 mm-Platten in einem 100 x 50 Kimex Kristallisationsschale passen. Glasplatten als Deckel für Pyrex Kristallisation Speisen verwendet werden. </li><li> Bohren Sie ein Loch in der ausgewählten Kammer und passen mit einem Kunststoff Luer zu Schlauchstutzen (Cole Parmer). Fittings können durch Rohrverschraubung oder mit Epoxy gesichert werden. Installieren eines ähnlichen Montage auf der gegenüberliegenden Seite des Behälters zu ermöglichen, um Gas zu fließen und aus der Kammer. Wenn möglich, ausgeglichen werden, um Löcher turbulente Mischung zu erhöhen. </li><li> Erhalten Druckgasbehältern mit definierten O 2-Konzentrationen (saldiert mit N 2), die Standard zertifiziert sind für O 2 COntent oder, für anoxische Bedingungen, reines N 2 (&lt;10 ppm O 2). Verwenden Sie automatische Umschaltung Regulatoren für längerfristige Studien zu verhindern, dass der Sauerstoffgehalt in den Kammern. </li><li> Organismus auf Hypoxie wurde gezeigt, dass temperaturabhängigen 15 sein. Rl die Kammer in einem Inkubator, können verschiedenen Temperaturen gehalten werden. Die Temperaturen in einem Inkubator kann ungleichmäßig und als solche, ist es ratsam, die Verwendung eines Temperatur-Datenlogger, um ständig die Temperatur im Inneren der Kammer zu machen. </li></ol> 2. Anschließen des Gas zu der Klimakammer <ol><li> Für alle Verbindungen, verwenden Sie ein Achtel-Zoll-Außendurchmesser Schlauch entweder durch Schnappverbindungen oder Klemmringverschraubungen verbunden. Schlauch sollte undurchlässig und nicht reaktiv mit O 2, wie beispielsweise fluoriertes Ethylen-Propylen (FEP) oder Nylon (Cole Parmer). Für eine schematische Darstellung des Setup abgeschlossen, siehe Abbildung 1. </li><li> Verbinden Sie den COM-gedrückt Gastanks zu einer Absperreinrichtung, wie ein Mass Flow Controller (Sierra Instruments) oder Rotameter (Aalborg). Sicherstellen, dass vor dem Druck des Tanks innerhalb des Bereichs der Durchflußeinrichtung und die Schlauchtülle ist. Zwei-Stufen-Regler werden im Allgemeinen verwendet, mit der zweiten Stufe gesetzt, um den gewünschten Druck [Siehe Abschnitt drei zur Auswahl der geeigneten Flussrate] </li><li> Hydrat das Gas durch Blasenbildung durch destilliertes Wasser mit einer Gaswaschflasche mit Fritte Zylinder, dann direkt in einen der Anschlüsse auf der Klimakammer, so dass der zweite Beschlag offen für Gas-Ausstoß (siehe Abbildung 1). Für kurzfristige Studien, schützt gegen Feuchtigkeit Gas Platte Austrocknung, sondern Luftfeuchtigkeit Überwachung kann notwendig sein, für Langzeitstudien. </li><li> Dow Corning Vakuumfett verwendet, um die Kammer abzudichten. Platz Gewichte auf dem Deckel der Kammer, um sicherzustellen, eine luftdichte Abdichtung. Um einen dichten Abschluss und ausreichende Strömung zu bestätigen, halten Sie einen kleinen Pool von Wasser in der Handfläche von yunsere behandschuhten Hand auf die passende aus der Kammer auf und überprüfen Sie die Blasen. </li></ol> 3. Die Auswahl Durchfluss <ol><li> Unter der Annahme, perfekte Mischung, gibt es 90% Gasaustausch der gasförmigen Atmosphäre jedes Mal das Volumen der Kammer Fassung (Fick-Gesetz) ist. Zum Beispiel in einem 100 ccm Kammer mit einer Flussrate von 100 cm ³ / min, wird das ursprüngliche Haus Luft in der Kammer mit 90% des von Ihnen gewünschten Gas nach 1 Minute ausgewechselt werden, und wird asymptotisch vollständigen Austausch von 90% pro Minute danach. </li><li> Höhere Fließgeschwindigkeiten und kleinere Behälter wird Ihre gewünschte Sauerstoffkonzentration schneller zu erreichen. Für 100 x 50 Kimex Containern (400 cc), einer Flussrate von 120 cm ³ / min erreicht 99,9% Austausch in 10 Minuten (3 Austausch). Diese Durchflussrate ist für die meisten Sauerstoff-Bedingungen. Nach unserer Kenntnis hat es nicht eine systematische Untersuchung, wie sich die Rate der Änderung der O 2-Konzentration beeinflusst die Reaktion in C. elegans. </li></ol><ol><li> Worms die hypoxischen Bedingungen ausgesetzt häufig entkommen die Oberfläche der Agarplatten. Um dies zu verhindern, das einen Ring aus Palmitinsäure (10 mg / ml in Ethanol) um den Rand der Platten. Die Palmitinsäure wird aus der Lösung, wie die Ethanol verdampft und bildet eine physische Barriere. Palmitinsäure Barrieren wirken sich nicht auf Rate von Eier-und Fruchtbarkeit oder Lebensdauer in C. elegans 16,17. Burrowing nicht häufiger auftreten in hypoxischen Bedingungen, so sind zusätzliche vorbeugende Maßnahmen in der Regel nicht erforderlich. </li><li><ol><li> Generieren Sie synchronisierten Populationen durch Bleichen graviden Erwachsenen in einem kleinen Tropfen alkalische Bleichmittel-Lösung auf ungesetzte Nematodenwachstum Media (NGM) Platten 18. Im Gegensatz zu Standard-Großserienfertigung Hypochloritbleiche Protokolle, Pick 1-100 Tiere in einem Tropfen Bleichmittel-Lösung auf der Oberfläche eines NGM Platte, dann können die Bleichmittel-Lösung in die Platte aufnehmen <sup&gt; 18. Nach mindestens 12 Stunden, überweisen Sie den synchronisierten L1-Larven auf Platten mit Live-OP50 Bakterien geimpft. Alternativ kann man damit schwangeren Erwachsenen, um Eier auf dem Teller lag für 2-3 Stunden, um eine Gruppe von Würmern, die synchron entwickeln wird oder Pick L4-Larven aus einer gemischten Bevölkerung zu generieren. </li><li> Vermeiden Sie es, gebleicht Embryonen zu Hypoxie, da dies die Lebensfähigkeit 13 reduzieren können. Um jungen Embryonen (2-4 Zellen) zu sammeln, können trächtige Erwachsene in einer kleinen Menge Wasser mit einer Rasierklinge und Embryonen bewegt, um Platten mit dem Mund pipettieren für nachfolgende Exposition gegenüber Hypoxie gehackt werden. </li></ol></li><li> Dichtungsplatten in der Klimakammer. Kontrolltiere sollte Normoxie (Haus Luft) bei der gleichen Temperatur wie behandelten Würmern zu halten. Es gibt keinen Unterschied zwischen beobachtbaren Proben im Haus Luft gelassen und diese in einem identischen Haus mit Kammer strömende Luft über ihnen aufrechterhalten. Initiieren Sie Gasfluss und pflegen Belichtung für die gewünschte Zeit. Um die Einheitlichkeit in der Rampe zu gewährleisten, achten Sie darauf,ersetzen Sie das Wasser in der Gaswaschflasche vor der Belichtung. </li><li> Zum Nachweis Überleben von Embryonen, können die Würmer für 48 h nach Rückkehr in Raumluft zu entwickeln, zu welchem ​​Zeitpunkt sie sollte vierten Larvenstadium / Tag Erwachsene. Ergebnis für das Überleben, Zensur keine Würmer, die nicht berücksichtigt werden können. </li><li> Mit Tieren in Kontakt, um eine Hypoxie zu visualisieren, zu bewegen Würmer zu einem Rückgang der M9 auf einem 22 mm 2 Deckglas, und schwenken auf ein Kissen aus 2% Agarose in M9-18. Falls erforderlich, Levamisol (25 mM) oder Natriumazid (10 mM) als Anästhetikum verwendet. Natriumazid und Levamisol kann verwirren einige Beobachtungen aufgrund der Toxizität und sollte überlegt eingesetzt werden 19. </li></ol> 5. Schnelle Ernte des Hypoxie-exponierte Worms (Beispiel: Vorbereitung von Proben für HIF-1 Western-Analyse) Viele Hypoxie-induzierte Effekte sind schnell bei der Rückkehr in Raumluft umgekehrt, einschließlich der Wiederaufnahme der Eierproduktion 12, die Phosphorylierung von mitotischen Epitopein der Embryogenese 13 und den Abbau des HIF-1-Protein 9,20. Schnelle Isolierung von Tieren ausgesetzt Hypoxie ist erforderlich, um reproduzierbare Effekte in diesen Bedingungen zu erhalten. Mit diesem Setup können Tiere geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren in weniger als zwei Minuten. Während Handschuhfach Hypoxie Kammern für die Manipulation von Proben ermöglichen in anoxischen Bedingungen, beschränken ihre Kosten und Praktikabilität für die andere Bedingungen als Anoxie ihre Nützlichkeit. <ol><li> Wachsen Bristol N2 Würmer auf 4 10 cm hohe Wachstumsraten (HG)-Platten, bis ein Großteil der Würmer graviden Erwachsenen sind 18. Waschen Sie Würmer in ein 15 ml konischen Röhrchen, das eine 1:5 alkalische Bleichmittel-Lösung und Inkubation mit Rotation, bis Würmer zu lösen, nicht mehr als 5 Minuten 9 beginnen. Waschen Sie die Würmer dreimal mit M9, Abzentrifugieren bei 1500 xg zwischen jedem Waschen ohne Bremsen. </li><li> Platte gebleichten Embryonen auf 8 150 mm NGM-Platten und ermöglichen auf L4-Larven (~ 48 Stunden für Bristol N2 bei 22 ° C) zu entwickeln.Bewegen Platten zu Klimakammern und entlarven zu hypoxischen (1.000 ppm, 5.000 ppm) und anoxische (N2) Bedingungen für 4 Stunden. Die Belichtungszeiten werden je nach Versuchsaufbau variieren. Während der Exposition gegenüber Hypoxie hat eine unmittelbare Auswirkung auf Rate der Eiablage, zwei Zell-Embryonen nach 16-18 Stunden der Exposition 12 sterben. Mit diesem Aufbau Hypoxie Kammer wird der untere Grenzwert für die Belastung durch die Geschwindigkeit der Atmosphärenaustausch bis das Gleichgewicht erreicht beschränkt. </li><li> Beschriften Sie ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen und eine 15 ml konischen Röhrchen für jede experimentelle Probe. Würmer ausgesetzt Hypoxie eher zu den Seiten des Rohres während der Ernte zu halten. Um dies zu verhindern, Platz 100 ul 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in den einzelnen 15 ml konischen Röhrchen. Wenn SDS inhibiert Downstream-Anwendungen, Rinderserumalbumin (BSA) verwendet Festsitzen zu verhindern werden. Der routinemäßige Einsatz von SDS oder BSA scheint nicht eine scheinbare Unterschied haben. In 50 ul 2x Protein Loading-Farbstoff (4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol und einverfolgen Bromphenolblau in 30% Glycerin (w / v)) in den 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Werfen Sie einen Dewar mit flüssigem Stickstoff bereit. </li><li> Zeit die Schritte nach dem Entfernen der Würmer von Hypoxie und aufzeichnen. Nehmen Sie den Deckel auf die Hypoxiekammer, nehmen Sie eine Probe Platte, und verschließen die Kammer. Verwenden Sie destilliertes Wasser, um die Würmer auf eine Nylon-Filter waschen und gießen Sie dann in das 15 ml konischen Röhrchen. Drehen Sie die Würmer, die in einem Desktop-Zentrifuge bei 1500 xg für 15-20 Sekunden mit Bremse. </li><li> Verwendung eines Vakuums an die meisten der aus dem Glas zu entfernen, wobei die Schnecke Pellet unberührt. </li><li> Mit einer Pipette, bewegen Sie den Wurm Pellet in 50 ul auf die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die Tube und tauchen Sie ein in flüssigem Stickstoff. </li><li> Wiederholen, bis alle Proben isoliert worden. Befolgen Sie diese Verfahren für die Stallluft Kontrollproben für Konsistenz. Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Organismal Effekte von Hypoxie zu sehendurch Prüfung der Realisierbarkeit bis zum Erwachsenenalter von C. elegans (Abbildung 2). Embryonen, die durch Wildtyp-Bristol (N2) und HIF-1 (IA04) Deletionsmutanten gelegt sind alle im Haus Luft O 2-Konzentrationen (210.000 ppm O 2) zu überleben. N 2 Würmer sind in der Lage, sich anzupassen und Erwachsenenalter überleben in 5.000 ppm O 2, während HIF-1-Embryonen nicht lebensfähig sind. Dies zeigt, dass HIF-1 essentiell für die Anpassung an die wechselnden Konzentrationen von Sauerstoff in der Umgebung 10 ist. Weder noch N2 HIF-1-Tiere können überleben Exposition gegenüber 1.000 ppm O 2. Visualisierung Wurm direkt in Hypoxie ist machbar mit der Verwendung eines Binokular und durchsichtigen Behälter (Abbildung 3). Durch die direkte Platzierung der Hypoxie Kammer auf der Binokular, gibt es keine Notwendigkeit, die Würmer aus Hypoxie Organismen zu entfernen, Reaktionen zu beobachten. Der Umfang kann mit Fluoreszenz-Flatscreen ausgestattet werden (wie in Abbildung 3 </strong&gt;), weiter auszubauen, welche Arten von Beobachtungen in Hypoxie, die möglich sind. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> Abbildung 1. Beispiel Hypoxie Kammer. Richtung der Gasströmung durch Pfeile angedeutet. Das Gas wird in Druckgasbehältern mit definierten O 2-Konzentrationen (1) und einer Zweistufen-Druckregleranordnung befestigt ist (2) gespeichert. Gas tritt in den Boden des Strömungsrohrs (3), beim Verlassen des an der richtigen Strömungsrate. Gas strömt dann in die Blase Kolben (4), Hydratisieren des Gases (die korrekte Verbindung der Blase Kolben durch Beobachtung Blasen). Hydratisierte Gas strömt dann in die Kammer bei der Hypoxie Zuflussventilmechanismus (5), Aussetzen der Proben auf Hypoxie. Das Gas schließlich Öffnungen in den Raum durch eine Auslassloch in der Kammer gebohrt. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Lebensfähigkeit von Embryonen ausgesetzt bis 1.000 ppm O 2, 5000 ppm O <sub&gt; 2 und Normoxie (~ 210.000 ppm O 2). Embryonen wurden jeweils Sauerstoffgehalt als Embryonen für 24 Stunden in einem kontinuierlichen Fluß Sauerstoffkammern ausgesetzt. Worms wurden normoxischen Bedingungen, dürfen bis zum Erwachsenenalter für 48 Stunden entwickeln bewegt, und dann trafen für die Lebensfähigkeit bis zum Erwachsenenalter. n&gt; 50, n = 5. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> Abbildung 3. Visualisierung von C. elegans in Hypoxie mit Mikroskopie. Worms sind auf die Hypoxie mit den beschriebenen Methoden ausgesetzt. Die transparente Klimakammer (gebaut mit einer Pyrex Kristallisierschale und Glasplatte) wird direkt auf der Bühne eines Binokular gelegt. Zwei Ansichten werden gezeigt, darunter die gesamte ein Gasstrom einrichten, die andere nur mit der Kammer auf dem Mikroskoptisch.

<ol><li>Danovaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+metazoa+living+in+permanently+anoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The first metazoa living in permanently anoxic conditions.</a> BMC Biology. 8, 30(2010).</li>
<li>Birner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Hypoxia-inducible+Factor+1+alpha+Is+a+Marker+for+an+Unfavorable+Prognosis+in+Early-Stage+Invasive+Cervical+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer.</a> Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+-+a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).</li>
<li>Ramirez-Bergeron, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+affects+mesoderm+and+enhances+hemangioblast+specification+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development.</a> Development. 131, 4623-4634 (2004).</li>
<li>Staff, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheel-well+Stowaways+Risk+Lethal+Levels+of+Hypoxia+and+Hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Factors+and+Aviation%22%5BJournal%5D)">Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia.</a> Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).</li>
<li>Shen, C., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Analysis+of+Hypoxia+Signaling+and+Response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).</li>
<li>Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+HIF-1+Hypoxia-inducible+Factor+during+Hypoxia+Response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).</li>
<li>Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1+is+a+basic-helix-loop-helix-PAS+heterodimer+regulated+by+cellular+O2+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).</li>
<li>Epstein, A. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+EGL-9+and+Mammalian+Homologs+Define+a+Family+of+Dioxygenases+that+Regulate+HIF+by+Prolyl+Hydroxylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation.</a> Cell. 107, 43-54 (2001).</li>
<li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+Animation+in+C.+elegans+Requires+the+Spindle+Checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li>
<li>Gray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430, 317-322 (2004).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+Elegans+Are+Protected+from+Lethal+Hypoxia+by+an+Embryonic+Diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause.</a> Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li>
<li>Hu, C. -J., Wang, L. -Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Roles+of+Hypoxia-Inducible+Factor+1%7Balpha%7D+%28HIF-1%7Balpha%7D%29+and+HIF-2%7Balpha%7D+in+Hypoxic+Gene+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).</li>
<li>Treinin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+is+required+for+heat+acclimation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+increases+thermotolerance+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 104, 20618-20622 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Salceda, S., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+Factor+1%CE%B1+%28HIF-1%CE%B1%29+Protein+Is+Rapidly+Degraded+by+the+Ubiquitin-Proteasome+System+under+Normoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).</li>
<li>Theilacker, J. C., White, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Gases+in+Air+and+Its+Affect+on+Oxygen+Deficiency+Hazard+Abatement%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement.</a> AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).</li>
<li>Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+degradation+by+anoxia+and+ischemia+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts.</a> Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).</li>
<li>Probst, G., Riedinger, H. Jr, Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Control+of+DNA+Replication+in+Response+to+Hypoxia+and+to+Inhibited+Protein+Synthesis+in+CCRF-CEM+and+HeLa+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells.</a> Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).</li>
<li>Semenza, G. L., Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSemenza%2C+GL+%22Oxygen+Sensing%22">Oxygen Sensing</a>. 381, Academic Press. (2004).</li>
<li>Chan, K., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia-Induced+Suspended+Animation+in+Budding+Yeast+as+an+Experimental+Paradigm+for+Studying+Oxygen-Regulated+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression.</a> Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).</li>
<li>Nystul, T. G., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide-induced+suspended+animation+protects+against+hypoxic+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 101, 9133-9136 (2004).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Verfahren stellt eine Strategie zur Konstruktion einer hypoxischen Umgebung, die für Umgebungen mit präzisen Konzentrationen von Sauerstoff, der im Labor gehalten werden können. Diese Kammern bieten eine einfache Methode zur Belichtung von Organismen auf bestimmte niedrige Konzentrationen von O 2 und die Überwachung der molekularen und physiologischen Ausgänge. Die Klimakammer beschrieben wird durch das Labor statt im Handel erworben und können so modifiziert werden, um die Bedürfnisse des Experiments ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Schlauch (FEP und PTFE) </td><td> Cole Parmer Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;FEP) 06.605 bis 27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE)&quot; R-3603 </td></tr><tr><td> Klemmringverschraubungen </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> 06.363 bis 58 (M. Koppler 1/16 &quot;) 06.363-62 (F-Koppler 1/16 &quot;) 06.363 bis 60 (M. Koppler 1/8 &quot;) 06.363-61 (F-Koppler 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> Messkonus </td><td> Aalborg </td><td> PMR3-010073 (3 Ausgang) PMR1-013520 (1 Ausgang) </td></tr><tr><td> Mass Flow Controller </td><td> Sierra Instruments </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) </td></tr><tr><td> Druckgasbehälter </td><td> Airgas </td><td> Auf Bestellung &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Kunststoff Luer zu Schlauchtülle </td><td> Cole Parmer </td><td> 45505-41 (Serie 500 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> Gegossenes Acrylglas-Boxen </td><td> Ellard Instrumentation </td><td> Auf Bestellung </td></tr><tr><td> Rohrverbindungsstücke (Messing oder Edelstahl) </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> B-402-1 (1/4 &quot;Überwurfmutter) B-200-3 (1/8 &quot;T-Stück) B-400-Set (1/4 &quot;Aderendhülsen) B-QM2-B1-200 (QM Körper QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;male conn) </td></tr><tr><td> Dow Corning Vakuumfett </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> AnaeroPack Box </td><td> Misubishi Gas Chemical Company </td><td> R684004 (0,4 Liter) R685025 (2,5 Liter) R685070 (7,0 Liter) </td></tr><tr><td> Pyrex Gaswaschflasche </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Palmitinsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase </td><td> Southern Biotechnology Associates </td><td> 1032-05 </td></tr><tr><td> SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrat </td><td> Pierce Chemical </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 Glaskristallisationsverfahren Gerichte </td><td> Kimax Kimble </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

erstellen definierte gasförmigen umgebungen, um die auswirkungen von hypoxie auf studieren<em&gt; c elegans</em

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Sauerstoff ist für alle Metazoen, um zu überleben, mit einer Ausnahme 1 bekannt. Verminderte Verfügbarkeit von O 2 (Hypoxie) kann Verlauf einer Krankheit, eine normale Entwicklung oder Änderungen der Umgebungsbedingungen 5.2 entstehen. Das Verständnis der zellulären Signalwege, die bei der Reaktion auf Hypoxie beteiligt sind, konnten neue Einblicke in die Behandlungsstrategien bieten für unterschiedliche menschliche Erkrankungen, Schlaganfall, Krebs aus. Dieses Ziel wurde behindert, zumindest teilweise, durch technische Schwierigkeiten mit kontrollierter hypoxische Exposition in genetisch zugänglich Modell-Organismen verbunden sind. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ideal als Modellorganismus für das Studium der hypoxischen Reaktion geeignet, da sie einfach zu kultivieren ist und genetisch zu manipulieren. Darüber hinaus ist es möglich, die zellulären Reaktionen auf spezifische hypoxischen O 2-Konzentrationen, ohne Verwechslung wirksam, da C zu studieren elegans erhalten O 2 (und andere Gase) durch Diffusion, um eine erleichterte Atemwege 6 gegenüber. Faktoren bekannt, in der Reaktion auf Hypoxie beteiligt sind in C. erhalten elegans. Die tatsächliche Reaktion auf Hypoxie hängt von der spezifischen Konzentration von O 2 erhältlich ist. In C. elegans, Hypoxie mäßig einen Transkriptions-Reaktion vermittelt wesentlich durch HIF-1 löst, erfordert die hoch-konservierten durch Hypoxie induzierbare Transkription Faktor 6-9. C. elegans Embryonen HIF-1 in 5.000-20.000 ppm überleben O 2 7,10 . Hypoxie ist ein allgemeiner Begriff für &quot;weniger als normale O 2&quot;. Normoxie (normale O 2) können auch schwer zu definieren. Wir betrachten in der Regel Raumluft, die 210.000 ppm O 2 zu Normoxie zu sein. Es hat sich jedoch gezeigt, dass C elegans hat eine Präferenz für Verhaltens-O 2-Konzentrationen von 5 bis 12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. In larvae und Erwachsene, hif-1 wirkt, um Hypoxie-induzierte Diapause 5000 ppm O 2 12 zu verhindern. Allerdings ist hif-1 keine Rolle in der Antwort auf eine niedrigere Konzentration von O 2 (Anoxie, Arbeitsdefinition &lt;10 ppm O 2) 13. In Anoxie, C. elegans tritt in einem reversiblen Zustand der verschobenen Animation, in der alle mikroskopisch beobachtbare Aktivität aufhört 10. Die Tatsache, dass verschiedene physiologische Reaktionen treten bei unterschiedlichen Bedingungen unterstreicht die Bedeutung der mit experimenteller Kontrolle über die hypoxische Konzentration von O 2. Hier präsentieren wir eine Methode zur Konstruktion und Anwendung von Umweltmanagementsystemen Kammern, die zuverlässige und reproduzierbare hypoxischen Bedingungen produzieren mit definierten Konzentrationen von O 2. Der kontinuierliche Flow-Verfahren sorgt für eine schnelle Äquilibrierung der Kammer und erhöht die Stabilität des Systems. Zusätzlich kann die Transparenz undErreichbarkeit der Kammern ermöglichen eine direkte Visualisierung von Tieren, die auf Hypoxie ausgesetzt. Wir zeigen weiterhin, eine effektive Methode zur Ernte C. elegans Proben schnell nach Hypoxie, ist die Notwendigkeit, viele der schnell-umgekehrt Änderungen, die in Hypoxie 10,14 auftreten, zu beobachten. Diese Methode stellt eine wesentliche Grundlage, die leicht für individuelle Bedürfnisse Labor, einschließlich verschiedener Modellsysteme und einer Vielzahl von Gasen kann geändert werden.

Die vorliegende Arbeit zeigt wie man mit kontinuierlichem Fluss Hypoxie Kammern zu verwenden, um Atmosphären mit definierten Konzentrationen von O generieren<sub&gt; 2</sub&gt;, Um biologische Reaktionen zu verstehen, um sank O<sub&gt; 2</sub&gt;. Dieses System ist einfach einzurichten und zu pflegen, und flexibel genug, um eine breite Palette von O anpassen<sub&gt; 2</sub&gt; Konzentrationen und Modellsysteme

Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren<em&gt; C elegans</em

Sauerstoff ist für das Überleben aller Metazoen essenziell, mit einer bekannten Ausnahme1. Eine verminderte O2-Verfügbarkeit (Hypoxie) kann in Krankheitszuständen auftreten, ...

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Hypoxiekammer mithilfe eines Durchflussverfahrens einzurichten und zu betreiben. Dies wird erreicht, indem die erforderlichen Schläuche, Kolben und Kammern für das Verfahren besorgt und hergestellt werden. Als zweiter Schritt wird der Sauerstoffflasche angeschlossen und die Durchflussrate ausgewählt, um den gewünschten Hypoxiegrad einzustellen. Hydratisieren Sie das Gas, indem Sie es durch eine Blasenflasche leiten, die mit entionisiertem Wasser gefüllt ist. Schließen Sie das hydratisierte Gas an die Hypoxiekammer an und stellen Sie die Testproben in die Kammer, um sie hypoxischen Bedingungen auszusetzen. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine Hi F1-abhängige embryonale Letalität unter Hypoxie zeigen, basierend auf der Beobachtung der Überlebensfähigkeit bis ins Erwachsenenalter.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Handschuhboxen liegt darin, dass sie einfach und kostengünstig im Labor herzustellen ist und eine genaue sowie reproduzierbare Gaskonzentration in der Umweltkammer ermöglicht. Während diese Methode Einblicke in die hypoxische Reaktion beim Fadenwurm C. elegans ermöglicht, kann sie auch an andere Systeme angepasst werden, einschließlich größerer Modellorganismen und Zellkulturen. Zusätzlich kann sie zur Untersuchung anderer Gase verwendet werden, darunter Kohlendioxid und Schwefelwasserstoff.Dieses Protokoll zeigt, wie man eine Hypoxiekammer aufbaut. Das Gas wird in Druckgastanks mit definierten Sauerstoffkonzentrationen gespeichert, und ein zweistufiger Druckminderer wird angeschlossen. Das Gas strömt in den unteren Teil des Durchflussrohrs ein und tritt oben mit der korrekten Durchflussrate aus.Das Gas strömt anschließend in die Blasenflasche, wo es befeuchtet wird. Anschließend gelangt das befeuchtete Gas über das Einlassventil in die Hypoxiekammer und setzt die Proben der Hypoxie aus. Schließlich entweicht das Gas über eine im Kammerdeckel angebrachte Öffnung in den Raum.Eine Kristallisationsschale aus Pyrex oder eine Pfeilpack-Box kann als Gehäuse der Umweltkammer verwendet werden. Das Volumen des Behälters sollte minimal gehalten werden, und das Material muss gasundurchlässig sein. Bohren Sie ein Loch in eine Seite des Behälters mit einer Kohlenstoff- oder Diamantspitze und setzen Sie ein Kunststoff-Anschlussstück mit Schlauchtülle ein.Mischen Sie das Epoxidharz vor dem Auftragen auf die Box und die Armatur. Wiederholen Sie anschließend denselben Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des Behälters, wobei die zweite Bohrung versetzt zur ersten angeordnet ist. Um die turbulente Durchmischung zu erhöhen, verwenden Sie FEP- oder Nylonrohr mit einem Außendurchmesser von einem Achtel Zoll, um die Druckgasflaschen mit einer Durchflussregelvorrichtung, wie beispielsweise einem Massendurchflussregler oder einem Flügelradzähler, zu verbinden.Die Gastanks sollten definierte Sauerstoffkonzentrationen enthalten, die mit Stickstoff ausgeglichen sind und einem zertifizierten Standard für den Sauerstoffgehalt oder für anoxische Bedingungen entsprechen. Bei Verwendung von reinem Stickstoff verwenden Sie einen Zweistufenregler, wobei die zweite Stufe auf den gewünschten Druck eingestellt wird. Siehe die Anweisungen im schriftlichen Protokoll zur Auswahl einer geeigneten Durchflussrate.Verbinden Sie dann den Schlauch vom zweistufigen Druckminderer mit dem Durchflussrohr, das die Strömungsgeschwindigkeit des in die Kammer eintretenden Gases reguliert. Die Ausgänge des Durchflussrohrs sind mit einer Gaswaschflasche verbunden, die einen porösen Zylinder mit destilliertem Wasser enthält. Anschließend verbinden Sie den Schlauch auf der anderen Seite der Waschflasche mit einem der Anschlüsse an der Umweltkammer.Dadurch wird das in die Umweltkammer eintretende Gas befeuchtet. Versiegeln Sie die Kammer mit Vakuumfett. Anschließend platzieren Sie Gewichte auf dem Deckel der Kammer, um eine luftdichte Abdichtung sicherzustellen.Überprüfen Sie die Dichtheit, indem Sie eine kleine Menge Wasser in der Handfläche eines behandschuhten Hands auf die Gasaustrittsöffnung der Kammer halten und auf Bläschenbildung prüfen. Erzeugen Sie zunächst synchronisierte Populationen von Seeeiern. Stellen Sie ein bis 100 GR-Erwachsene in einen Tropfen alkalischer Bleichlösung auf die Oberfläche einer unbeimpften Nematoden-Wachstumsmedium-Platte. Lassen Sie die Bleichlösung nach einer Inkubationszeit von mindestens acht Stunden in die Platte eindringen. Überführen Sie die synchronisierten L1-Larven auf eine Platte, die mit lebenden OP50-Bakterien besiedelt wurde. Alternativ lassen Sie GRA-Adulttiere zwei bis drei Stunden lang Eier auf der Platte ablegen, um eine Gruppe von Würmern zu erzeugen, die synchron entwickeln, oder isolieren Sie L4-Larven aus einer gemischten Population, um junge Embryonen zu gewinnen.Im Zweizell- bis Vierzellstadium GR-Erwachsene mit einem Rasiermesser in einem kleinen Volumen Wasser zerkleinern und die Embryonen anschließend mit einer Mundpipette umsetzen, bevor die Würmer zur Exposition gegenüber hypoxischen Bedingungen auf die Platte gebracht werden. Einen Ring aus 10 Milligramm pro Milliliter Palmitinsäure in Ethanol am Rand der Platten anbringen. Um zu verhindern, dass die Würmer die Oberfläche der Agarplatte verlassen.Die Palmitinsäure scheidet sich aus der Lösung aus. Während das Ethanol verdampft und eine physikalische Barriere bildet, um Gleichmäßigkeit sicherzustellen, ersetzen Sie vor der Exposition in der Umweltkammer unbedingt das Wasser im Gaswaschflaschenbehälter. Nach dem Übertragen der Würmer auf die Platten verschließen Sie die Platten in der Umweltkammer, starten Sie den Gasfluss und führen Sie die Exposition für die gewünschte Versuchszeitdauer durch.Um die Überlebensfähigkeit der Embryonen bis zum Erwachsenenstadium zu bestimmen, lassen Sie die Würmer 48 Stunden nach der Rückkehr zur Raumluft weiterentwickeln, wobei sie sich zu diesem Zeitpunkt im Stadium der vierten Larvenentwicklungsstufe oder als ein Tage alter Erwachsener befinden sollten. Werten Sie die Überlebensfähigkeit bis zum Erwachsenenstadium anhand dieser Stadien aus. Um die Würmer nach einer hypoxischen Exposition sichtbar zu machen, überführen Sie die Würmer in einen Tropfen M9 auf einem 22 Millimeter quadratischen Deckglas und invertieren dieses bei Bedarf auf ein Polster aus 2 % Agar in M9.25 Millimolar Amol oder 10 Millimolar Natriumazid können als Anästhetikum verwendet werden. Alternativ kann nach Exposition gegenüber Hypoxie die durchsichtige Umweltkammer direkt auf den Objekttisch eines Stereomikroskops gestellt werden. Es werden zwei Ansichten gezeigt, eine inklusive der gesamten Gasdurchflussanordnung.Die andere mit nur der Kammer auf dem Mikroskopstadium. Züchten Sie Bristol N zwei Würmer auf vier Wachstumsplatten mit 10 Zentimeter Durchmesser, bis die Mehrheit der Würmer GR-Erwachsene sind. Spülen Sie die Würmer mit einer alkalischen Bleichlösung im Verhältnis 1:5 in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und inkubieren Sie unter Rühren, bis die Würmer beginnen sich aufzulösen.Nicht länger als fünf Minuten. Die Würmer dreimal mit M9 waschen, wobei nach jeder Wäsche bei 1.500 ×g zentrifugiert wird, ohne dabei die Pellets aufzubrechen. Die gebleichten Embryonen auf acht 150-Millimeter-NGM-Platten ausplattieren und die Embryonen etwa 48 Stunden lang zu L4-Larven entwickeln lassen.Bei 22 Grad Celsius die Platten in die Umweltkammer bringen und vier Stunden lang oder gemäß der vom Versuchsdesign vorgegebenen Dauer hypoxischen und anoxischen Bedingungen aussetzen. Um die Proben schnell zu entnehmen, den Deckel der hypoxischen Kammer entfernen. Eine Probenplatte entnehmen, die Kammer erneut verschließen und Zeitpunkt sowie Schritte dokumentieren.Nach dem Entfernen der Würmer aus der Hypoxie sollte dieser gesamte Vorgang weniger als zwei Minuten dauern. Verwenden Sie destilliertes Wasser, um die Würmer auf einen Nylonfilter zu spülen, und gießen Sie sie dann in ein beschriftetes 15-Milliliter-Konischglas, das 100&nbsp;Mikroliter 1&nbsp;% SDS enthält. Die Würmer in SDS werden in einer Tischzentrifuge 15 bis 20&nbsp;Sekunden bei 1.500&nbsp;×&nbsp;g zentrifugiert.Unterbrechen Sie, und verwenden Sie ein Vakuum, um den größten Teil des Überstandes aus dem Röhrchen zu entfernen, wobei das Wurmpellet unberührt bleibt. Überführen Sie das Wurmpellet mithilfe einer Pipette zusammen mit einem vorbestimmten Volumen Flüssigkeit in ein beschriftetes 1,5-Mikroliter-Röhrchen. Falls die Probe für eine SDS-Gelelektrophorese verwendet werden soll, kann dieses Röhrchen ein gleiches Volumen an zweifach konzentrierter Protein-Ladefarbe enthalten; verschließen Sie das Röhrchen und tauchen Sie es in flüssigen Stickstoff. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Proben isoliert wurden. Befolgen Sie diese Verfahren für Kontrollproben der Raumluft; Konsistenzproben können bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Diese Abbildung zeigt die Lebensfähigkeit von Embryonen, die 1000 Teilen pro Million Sauerstoff, 5.000 Teilen pro Million Sauerstoff und Normoxie mit etwa 210.000 Teilen pro Million Sauerstoff ausgesetzt waren.Die Embryonen werden 24 Stunden lang in Durchfluss-Sauerstoffkammern jeweils einer Bedingung ausgesetzt. Die Würmer wurden in normoxische Bedingungen überführt, durften 48 Stunden lang bis zum Erwachsenenstadium entwickeln und anschließend hinsichtlich ihrer Überlebensfähigkeit bis zum Erwachsenenstadium bewertet. Nach diesem Verfahren können Proben für nachfolgende Analysen mittels Western Blot, QPCR oder physiologischer Assays wie Lebensdauer- oder Nachkommenschaftsproduktion gesammelt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine kontinuierliche Durchfluss-Hypoxiekammer in Ihrem eigenen Labor aufbauen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Dieses Video zeigt eine Methode, um Hypoxie bei Drosophila-Larven zu testen, indem ihre Grab- und Tunnelfähigkeiten bewertet werden. Mit dieser Technik können Forscher Larven mit Sauerstoffmangel von solchen mit Entwicklungsdefiziten unterscheiden. Das Beispielprotokoll veranschaulicht den Aufbau für diesen Assay.

Drosophila Burrowing and Tunneling Assay: Eine Methode zur Beurteilung der Gewebehypoxie bei Fliegenlarven

Ein Protokoll beschrieben, das Anoxie / Hunger in C verwendet elegans zu modellieren Ischämie / Reperfusion. Funktionelle Ergebnisse sind eine erhöhte Sterblichkeit, sichtbare Veränderungen in GFP-markierten neuronalen Prozesse und die Beeinträchtigung der Verhaltensreaktionen, die neuronale Funktion benötigen.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

C. elegans ist in der Regel auf festen Agarplatten oder in Flüssigkulturen ausgesät mit E. coli. Um bakterielle Nebenprodukte aus Verwechslung toxikologischen und Ernährungsstudien zu verhindern, verwendeten wir eine axenischen flüssigen Medium, CEHR, um für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen wachsen und synchronisieren Sie eine große Anzahl von Würmern.

Die Züchtung Caenorhabditis elegans In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

Hier beschreiben wir Protokolle, die speziell zur Überwachung morphogener Defekte entwickelt wurden, die während der frühen und späten Phasen der embryonalen Elongation des Fadenwurms Caenorhabditis elegans auftreten. Letztendlich sind diese Protokolle darauf ausgelegt, Gene zu identifizieren, die diese Phasen regulieren, und ihre unterschiedlichen Anforderungen entlang der antero-posterioren Achse des Embryos zu charakterisieren.

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Wir stellen ein neuartiges hypoxisches Kammersystem für die Verwendung mit Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen vor. Unser System ist einfach, robust, kostengünstig und ermöglicht die Induktion und Aufrechterhaltung der Hypoxie in vivo und für bis zu 48 h. Wir präsentieren 2 reproduzierbare Methoden zur Überwachung der Wirksamkeit der Hypoxie.

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Das Protokoll beschreibt einen einfache Assay Drosophila Melanogaster Larven zu identifizieren, die Hypoxie unter normalen atmosphärischen Sauerstoffniveaus durchleben. Dieses Protokoll ermöglicht hypoxische Larven zu unterscheiden von anderen Mutanten, die überlappende Phänotypen wie Trägheit oder langsames Wachstum zeigen.

Ein Graben/Tunneling Test zur Erkennung von Hypoxie in Drosophila Melanogaster Larven

Mitochondriale Atmung ist entscheidend für das organismal überleben; Sauerstoff-Verbrauch ist daher ein hervorragender Indikator für mitochondriale Gesundheit. In diesem Protokoll wir beschreiben die Verwendung von handelsüblichen Respirometer basale messen und maximale Sauerstoff-Verbrauch im Leben, intakt und frei bewegliche Caenorhabditis Elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Trans- und mehrgenerationenische Wirkungen persistenter Chemikalien sind für die Beurteilung ihrer langfristigen Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit von wesentlicher Bedeutung. Wir bieten neuartige detaillierte Methoden zur Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten mit der freilebenden Nematode Caenorhabditis elegans.

Verwendung von Caenorhabditis elegans zur Untersuchung der trans- und mehrgenerationenlichen Wirkungen von Toxischen Stoffen

Hier charakterisieren wir zelluläre proteotoxische Stressreaktionen in der Nematode C. elegans, indem wir die Aktivierung fluoreszierender Transkriptionsreporter messen und die Empfindlichkeit gegenüber physiologischem Stress beobachten.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Diese Studie präsentiert Protokolle für zwei halbautomatische Ansätze zur Analyse der Bewegungsaktivität in C. elegans Komplex I Krankheit Gas-1(fc21) Würmer, nämlich ZebraLab (ein Mitteldurchsatz-Assay) und WormScan (ein Hochdurchsatz-Assay) und bieten vergleichende Analysen unter einer Vielzahl von Forschungsmethoden zur Quantifizierung des Nematodenverhaltens und der integrierten neuromuskulären Funktion.

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Lernen Sie, eine kontinuierliche Durchfluss-Hypoxiekammer zur Untersuchung von Sauerstoffmangel bei C. elegans aufzubauen. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle der O₂-Konzentrationen für Entwicklungsbiologie-Studien.

Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren

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