Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren C elegans

Ziel des folgenden Versuchs ist es, eine Hypoxiekammer mit einem kontinuierlichen Durchflussverfahren einzurichten und zu erhalten. Dies wird erreicht, indem die für das Verfahren erforderlichen Rohre, Kolben und Kammern beschafft und hergestellt werden. Schließen Sie in einem zweiten Schritt den Sauerstofftank an und wählen Sie die Durchflussrate, um den gewünschten Hypoxiegrad zu erzeugen.

Hydratisieren Sie das Gas, indem Sie es durch einen mit deionisiertem Wasser gefüllten Sprudelkolben leiten. Schließen Sie das hydratisierte Gas an die Hypoxiekammer an und legen Sie die Testproben in die Kammer, um sie hypoxischen Bedingungen auszusetzen. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine Hi F1-abhängige embryonale Letalität bei Hypoxie zeigen, basierend auf der Beobachtung der Lebensfähigkeit bis zum Erwachsenenalter.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. Handschuhboxen, besteht darin, dass sie einfach und kostengünstig im Labor herzustellen ist und eine genaue und reproduzierbare Konzentration der Gase in der Klimakammer ermöglicht. Während diese Methode einen Einblick in die hypoxische Reaktion des Nematoden C elegance gibt, kann sie auch an andere Systeme angepasst werden, einschließlich größerer Modellorganismen und Zellkulturen. Darüber hinaus kann es zur Untersuchung anderer Gase verwendet werden, einschließlich Kohlendioxid und Schwefelwasserstoff.

Dieses Protokoll zeigt, wie man eine Hypoxiekammer konstruiert. Das Gas wird in Druckgastanks mit definierten Sauerstoffkonzentrationen gelagert und mit einem zweistufigen Regler ausgestattet. Das Gas tritt am Boden des Durchflussrohrs ein und tritt am oberen Ende mit der richtigen Durchflussrate wieder aus.

Anschließend strömt Gas in den Blasenkolben und hydratisiert das Gas. Das Hydrogas gelangt dann in die Hypoxiekammer am Zuflussventil und setzt die Proben einer Hypoxie aus. Das Gas entweicht schließlich durch ein in die Kammer gebohrtes Abluftloch in den Raum.

Eine Pyrex-Kristallisationsschale oder in einer Pfeilpackungsbox kann als Körper der Klimakammer verwendet werden. Das Volumen des Behälters sollte auf ein Minimum beschränkt werden und das Material muss gasundurchlässig sein. Bohren Sie mit einer Carbon- oder Diamantspitze ein Loch in eine Seite des Behälters, bohren Sie es und befestigen Sie es mit einer Kunststoff-Schlauchtülle.

Mischen Sie das Epoxidharz, bevor Sie es auf die Schachtel und die Armatur auftragen. Wiederholen Sie dann den gleichen Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des Behälters, wobei das zweite Loch vom ersten versetzt ist. Um die turbulente Durchmischung zu erhöhen, verwenden Sie einen FEP- oder Nylonschlauch mit einem Außendurchmesser von acht Zoll, um die Druckgastanks mit einem Durchflusskontrollgerät, wie z. B. einem Massendurchflussregler oder einem Rotormesser, zu verbinden.

Die Gastanks sollten definierte Sauerstoffkonzentrationen aufweisen, die mit Stickstoff ausgeglichen sind und einen zertifizierten Standard für den Sauerstoffgehalt oder für anoxische Bedingungen aufweisen. Für reinen Stickstoff wird ein zweistufiger Regler verwendet, wobei die zweite Stufe auf den gewünschten Druck eingestellt ist. Beachten Sie die Anweisungen im schriftlichen Protokoll zur Auswahl einer geeigneten Durchflussrate.

Verbinden Sie dann den Schlauch vom zweistufigen Regler mit dem Durchflussrohr, das die Durchflussrate des in die Kammer eintretenden Gases steuert. Die Auslässe des Durchflussrohrs sind mit einer Gaswaschflasche mit Frittenzylinder verbunden, die destilliertes Wasser enthält. Verbinden Sie dann den Schlauch auf der anderen Seite der Waschflasche mit einer der Armaturen an der Klimakammer.

Dadurch wird das in die Klimakammer eintretende Gas hydratisiert. Verwenden Sie Vakuumfett, um die Kammer abzudichten. Platzieren Sie dann Gewichte auf dem Deckel der Kammer, um einen luftdichten Verschluss zu gewährleisten.

Testen Sie die Dichtung, indem Sie eine kleine Menge Wasser in der Handfläche einer behandschuhten Hand an die Gasauslassarmatur an der Kammer halten und auf Blasen prüfen. Erstens: Erzeugen Sie synchronisierte Populationen von See-Elgan. Geben Sie ein bis 100 g erwachsene Tiere in einen Tropfen alkalischer Bleichlösung auf die Oberfläche einer nicht besäten Nematoden-Wachstumsmedienplatte.

Lassen Sie die Bleichlösung nach einer Inkubationszeit von mindestens acht Stunden in die Platte einziehen. Übertragen Sie die synchronisierten L 1-Larven auf eine Platte, die mit lebenden OP 50-Bakterien besiedelt ist. Alternativ können Sie GRA-Erwachsene zwei bis drei Stunden lang Eier auf den Teller legen lassen, um eine Gruppe von Würmern zu erzeugen, die sich synchron entwickeln, oder L 4-Larven aus einer gemischten Population auswählen, um junge Embryonen zu sammeln.

Im Zwei- bis Vierzellstadium zerkleinern Sie GR-Erwachsene mit einer Rasierklinge in einer kleinen Menge Wasser und übertragen Sie dann die Embryonen mit einer Mundpipette, bevor Sie die Würmer auf die Platte übertragen, um sie hypoxischen Bedingungen auszusetzen. Legen Sie einen Ring aus 10 Milligramm Palmitinsäure pro Milliliter in Ethanol um den Rand der Platten. Um zu verhindern, dass die Würmer aus der Oberfläche der Agarplatte entweichen.

Die Palmitinsäure tritt aus der Lösung aus. Da das Ethanol verdunstet und eine physikalische Barriere bildet, um die Gleichmäßigkeit zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass Sie das Wasser in der Gaswaschflasche ersetzen, bevor Sie es in der Klimakammer aussetzen. Nachdem Sie die Würmer auf die Platten übertragen haben, versiegeln Sie die Platten in der Klimakammer, initiieren Sie den Gasfluss und halten Sie die Exposition für die gewünschte Zeit bis zum Assay aufrecht.

Um die Lebensfähigkeit der Embryonen bis zum Erwachsenenalter zu gewährleisten, lassen Sie die Würmer 48 Stunden nach der Rückkehr an die Raumluft entwickeln, dann sollten sie sich befinden. Larven im vierten Stadium oder Erwachsene eines Tages punkten für die Lebensfähigkeit bis zum Erwachsenenalter. Um zu visualisieren, dass Würmer hypoxisch exponiert sind, übertragen Sie die Würmer auf einen Tropfen M neun auf einem 22 Millimeter großen quadratischen Deckglas und invertieren Sie sie bei Bedarf auf ein Polster von 2%aros in M neun.

Als Anästhetikum können 25 Millimolar Amol oder 10 Millimolar Natriumazid verwendet werden. Alternativ kann die transparente Klimakammer nach Einwirkung von Hypoxie direkt auf den Tisch eines Präparierfernrohrs gestellt werden. Es werden zwei Ansichten angezeigt, eine mit dem gesamten Gasfluss-Setup.

Der andere mit nur der Kammer auf dem Mikroskoptisch. Züchten Sie Bristol N zwei Würmer auf vier 10 Zentimeter hohen Wachstumsfugen, bis die Mehrheit der Würmer GR-Erwachsene sind. Waschen Sie die Würmer in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit einer alkalischen Bleichlösung von ein bis fünf Litern und inkubieren Sie sie mit Rotation, bis sich die Würmer aufzulösen beginnen.

Nicht länger als fünf Minuten. Waschen Sie die Würmer dreimal, wobei M neun zwischen jedem Waschgang bei 1.500 Mal G herunterschleudert, ohne dass die Platte gebrochen wird. Die gebleichten Embryonen werden auf 8 150 Millimeter große NGM-Platten gebleicht und lassen die Embryonen sich etwa 48 Stunden lang zu L-Vier-Larven entwickeln.

Bei 22 Grad Celsius werden die Platten in die Klimakammer gebracht und vier Stunden lang oder für die im Versuchsplan angegebene Dauer hypoxischen und anoxischen Bedingungen ausgesetzt. Um Proben zu entnehmen, entfernen Sie schnell den Deckel der hypoxischen Kammer. Nehmen Sie eine Probenplatte, verschließen Sie die Kammerzeit wieder und notieren Sie die Schritte.

Nach der Entfernung der Würmer aus der Hypoxie sollte dieser gesamte Vorgang weniger als zwei Minuten dauern. Die Würmer werden mit destilliertem Wasser auf einen Nylonfilter gespült und dann in ein beschriftetes konisches 15-Liter-Röhrchen mit 100 Mikrolitern 1%iger SDS-Zentrifuge gegossen. Die Würmer in SDS in einer Desktop-Zentrifuge betragen 1.500 mal G für 15 bis 20 Sekunden.

Verwenden Sie bei der Pause ein Vakuum, um den größten Teil des Supinats aus dem Rohr zu entfernen, wobei das Wurmpellet unberührt bleibt. Übertragen Sie das Wurmpellet mit einer Pipette mit einem vorgegebenen Volumen Flüssigkeit in ein beschriftetes 1,5-Mikro-Abfallröhrchen. Wenn die Probe für SDS-Seiten verwendet werden soll, kann dieses Röhrchen ein gleiches Volumen von zwei Proteinbeladungsfarbstoffen enthalten, das das Röhrchen versiegeln und in flüssigen Stickstoff eintauchen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Proben isoliert sind. Befolgen Sie diese Verfahren für Kontrollproben für die Stallluft, da Konsistenzproben bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden können. Diese Zahl zeigt die Lebensfähigkeit von Embryonen, die 1000 Teilen pro Million Sauerstoff, 5.000 Teile pro Million Sauerstoff und Normoxie etwa 210.000 Teilen pro Million Sauerstoff ausgesetzt sind.

Die Embryonen werden 24 Stunden lang in Sauerstoffkammern mit kontinuierlichem Durchfluss jeder Bedingung ausgesetzt. Die Würmer wurden unter normoxischen Bedingungen gebracht, wo sie sich 48 Stunden lang bis zum Erwachsenenalter entwickeln durften, und dann auf ihre Lebensfähigkeit bis zum Erwachsenenalter bewertet. Nach diesem Verfahren können Proben für die anschließende Analyse mittels Western-Blot-QPCR oder physiologischen Assays wie Lebensdauer oder Nachkommenproduktion entnommen werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine Hypoxiekammer mit kontinuierlichem Durchfluss in Ihrem eigenen Labor einrichten können.