In-vitro-Analyse der PDZ-abhängigen CFTR Makromolekulare Signalkomplexe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen PDZ-abhängigen makromolekularen Signalkomplex des zystischen Fibrose-Transmembran-Konduktanzregulators, also CFTR, in vitro zusammenzusetzen. Dazu werden rekombinante, markierte Fusionsproteine in Bakterien exprimiert und gereinigt. Anschließend werden Zelllysate aus Kulturen gewonnen, die CFTR oder CFTR-bindende Proteine exprimieren.

Anschließend werden CFTR und Bindungsproteine in vitro kombiniert, um den CFTR-haltigen makromolekularen Signalkomplex zusammenzusetzen. Danach wird eine Westernblot-Analyse durchgeführt, die die Bildung von CFTR-makromolekularen Komplexen nachweist und mittels Westernblotting bewertet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass wir direkt die Bildung eines CFTR-haltigen makromolekularen Protein-Komplexes einzeln nachweisen und sichtbar machen können.

Daher kann diese Methode Einblicke in die Bildung von CT-R-haltigen makromolekularen Komplexen liefern. Sie kann außerdem zur Assemblierung nicht an CFTR beteiligter, nicht-proteinhaltiger Komplexe wie des sex-C2-makromolekularen Signalisierungskomplexes angewendet werden. Vor Kurzem haben wir mit derselben Methode gezeigt, dass unser Chemo-Rezeptor CXCR2 physisch einen Protein-Komplex mit dem downstream wirkenden Effektor bildet.

PRC-Beta-3 vermitteln den Wildtyp-Nerv 1 in Neutrophilen. Verwenden Sie PCR, um die DNA zu amplifizieren, die die letzten 50 bis 100 Aminosäuren codiert, welche die PDZ-Motive am C-Terminus enthalten. Für den CAMP-Transporter, MRP-4 und die PDZ-1-Domäne des Natrium-Wasserstoff-Austauschregulatorfaktors oder N-H-E-R-F.

Klonieren Sie anschließend die RP-vier-PCR-R-Produkte in PGE X vier T eins, um GST-Fusionsproteine herzustellen, und die PDZ-eins-Domäne von N-H-E-R-F in PET 30. Um Hiss-s-Fusionsproteine zu erzeugen, transformieren Sie die Bakterien durch Hitzeschock. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator in 50 Milliliter LB-Medium, das die geeigneten Antibiotika für den Vektor enthält, in SOC-Medium und einem protease-defizienten E. coli-Stamm.

Am nächsten Tag die Kultur im Verhältnis 1 zu 10 in 500 Milliliter Luria-Bertani-Medium verdünnen und die Kultur erneut zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Die Transkription des rekombinanten Proteins mit 0,5 bis 1 Millimolar IPTG vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius induzieren.

Nach der Inkubation die Kulturen in 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und die Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius pelletieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen und 20 Milliliter Sucrose-Puffer mit Lysozym hinzufügen. Ein Milligramm pro Milliliter 0,2 % Triton X-100 und Proteaseinhibitoren zum Lyse der Zellen hinzufügen und die bakterielle Suspension in ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.

Mischen Sie 30 Minuten lang auf einem rotierenden Schüttler bei vier Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie 30 Minuten bei 20.000 ×g und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation ist der Überstand klar und ein unlösliches App-Pellet befindet sich am Boden des Reaktionsgefäßes.

Sammeln Sie das klare Überstandsgemisch in einem neuen 50-Milliliter-Konischgefäß. Geben Sie dann zum Überstand ein Milliliter des geeigneten Harzes hinzu. Aero-Beads, suspendiert als 50%-Slurry in Saccharosepuffer mit Glutathion.

Für GST-Fusionsproteine sollten Aero-Beads und für His-S-Fusionsproteine Talon-Beads verwendet werden. Vier Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Rotationsrüttler mischen. Anschließend die Beads bei 800×g für zwei Minuten zentrifugieren.

Waschen Sie sie anschließend durch Resuspension in 15 Milliliter PBS und mischen Sie sie zwei Minuten lang auf einem Rotator. Entsorgen Sie schließlich den Überstand. Wiederholen Sie den Schritt insgesamt sechsmal, nach dem sechsten Waschgang.

Um das Protein von den Kügelchen zu eluieren, geben Sie zwei Milliliter des geeigneten Elutionspuffers pro einen Milliliter Kügelchen hinzu und mischen zehn Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie das gesamte eluierte Protein zusammen mit den Kügelchen in eine Säule und sammeln Sie den Durchlauf als eluiertes Protein. Überführen Sie anschließend das UD-Protein in Dialyse-Schlauchmaterial.

Dialysieren Sie die eluierten Proteine gegen zwei Liter PBS unter Rühren bei vier Grad Celsius. Wechseln Sie das PBS alle vier Stunden insgesamt viermal nach der Dialyse. Konzentrieren Sie das Protein auf 0,5 bis ein Milliliter.

Unter Verwendung eines Zentrifalfilters mit einer Grenzgröße von 10.000 Megawatt. Portionieren Sie die Probe in jeweils 200 Mikroliter. Eine Probe zur Analyse aufbewahren und die übrigen bei minus 80 Grad Celsius zur Lagerung aufbewahren.

Bestimmen Sie die Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode. Beurteilen Sie die Proteinqualität mittels SDS-Gelelektrophorese unter Verwendung von BSA-Standards. Falls die Integrität des Proteins nicht zufriedenstellend ist, können sekundäre Reinigungsverfahren wie Gelfiltration oder Ionenaustausch verwendet werden.

HEK 293-Zellen, die wildtypisches Flag-CFTR exprimieren, sollten wie in dem begleitenden Dokument beschrieben kultiviert werden. Entfernen Sie das Medium von den Zellen und waschen Sie mit PBS. Um die Zellen zu lysieren, geben Sie anschließend 500 µL Lysispuffer pro 60-mm-Kulturschale hinzu und schwenken Sie die Zelllysate 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Überführen Sie die Lysate in neue Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie dann bei 16.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um unlösliche Proteine zu entfernen, und sammeln Sie die Überstände. Bestimmen Sie die Protein-Konzentration mittels Bradford-Assay, um die CFTR-haltigen makromolekularen Komplexe in vitro zusammenzusetzen.

Beginnen Sie damit, 20 Mikrogramm gereinigtes GST-MRP4-C-terminales 50-Aminosäuren-Fusionsprotein und steigende Mengen von 0 bis 40 Mikrogramm gereinigtes His-S-PDZK1-Fusionsprotein in 200 Mikroliter Lysepuffer in einer 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenprobe zu kombinieren. Mischen Sie die beiden Proteine auf einem Rotationsmischer bei 22 Grad Celsius für eine bis zwei Stunden. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter einer 50%igen Suspension von Glutathion-Kügelchen zur Proteinmischung hinzu und mischen Sie weitere eine Stunde lang weiter.

Dieser Schritt wird auch als paarweise Bindung bezeichnet, bei der G-S-T-M-R-P vier CT 50 an SPD zk eins bindet. Währenddessen bereiten Sie die HEK 2 93-Zelllysate vor, die wie im vorherigen Abschnitt des Videos beschrieben wildtypisches Flag-CFTR überexprimieren, und zwar nach dem Schritt der paarweisen Bindung. Waschen Sie den Komplex zweimal mit Lysepuffer span bei 800 × g für jeweils eine Minute und aspirieren Sie vorsichtig den Überstand nach jedem Waschgang.

Beachten Sie Vorsicht, um die Kügelchen vom Boden nicht abzusaugen. Geben Sie die HT K 2 93-Zelllysate zu den Kügelchen und mischen Sie vorsichtig vier Stunden lang bei vier Grad Celsius für drei Stunden oder über Nacht nach der Inkubation in einem Rotationsmischer. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit Lysepuffer, zentrifugieren Sie nach jeder Waschung wie zuvor, nach der letzten Waschung.

Um die Proteine zu eluieren, 30 Mikroliter 5x-Probenpuffer hinzufügen und 10 bis 15 Minuten im Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend eine Minute bei 5.000 ×g zentrifugieren, um die Kügelchen zu präzipitieren. Danach die gesamte Eluierprobe auf ein 4–15 % SDS-Page-Gel laden und bei 200 Volt bis zum Ende des Gels laufen lassen. Übertragen Sie die Proteinbanden anschließend 1,5 Stunden lang bei 60 Volt mit einer BioRad-Transferapparatur auf eine PVDF-Membran.

Nach Abschluss der Übertragung die Membran eine Stunde lang in TBS-Tween mit 5 % fettfreier Milch blockieren. Danach wie in dem begleitenden Dokument beschrieben mit der Western-Blot-Analyse fortfahren, um CFTR-Interaktionsproteine sichtbar zu machen. Der aus A-C-F-T-R enthaltener makromolekularer Signalkomplex wurde in vitro wie in diesem Video beschrieben und in dieser schematischen Darstellung gezeigt, zusammengesetzt.

Ein makromolekularer Komplex, der zwischen den C-terminalen 50 Aminosäuren von Mr.RRP vier PD zk eins und dem vollständigen CFTR gebildet wurde, um die Dosisabhängigkeit der Bildung des makromolekularen Komplexes zu bestimmen. Steigende Mengen des vermittelnden Proteins PD ZK eins wurden wie hier gezeigt hinzugefügt. Der Komplex nahm dosisabhängig zu, was darauf hindeutet, dass das vermittelnde Protein PD ZK eins die Interaktion zwischen CCF TR und Mr.Rrp vier vermittelt.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die für die Western-Blot-Analyse vorbereiteten Mikromolekül-Komplex-Proben des FTR-Behälters nicht zu erhitzen, da eine Aggregation von FTR ein häufiges Problem darstellt. Stattdessen sollten die Proben vor dem Auftragen auf das Gel gemäß diesem Verfahren 10 bis 15 Minuten lang bei 37 Grad erhitzt werden. Andere Methoden wie die Co-Immunpräzipitation können durchgeführt werden, um die endogenen CFTR-Komplexe in Zellen wie Atemwegs-, Epithelzellen und Darmepithelzellen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen PTC-abhängigen CFDR-makromolekularen Signalkomplex in vitro zusammenbaut.