Modeling Colitis-assoziierten Krebs mit Azoxymethan (AOM) und Dextransulfat Natrium (DSS)

Am Tag Null injizierte Myer in der folgenden Woche Azoxymethan oder ein OM. Ihr Trinkwasser wird durch eine Lösung ersetzt, die Dextransulfat, Natrium oder DSS enthält. In der dritten Woche erhalten die Mäuse Wasser für die folgenden zwei Wochen.

Dieser DSS-Wasserzyklus wird zwei weitere Male wiederholt. Nach dem zweiten DSS-Zyklus. Mäuse können durch Spiegelendoskopie auf Tumore untersucht werden.

Nach der 10. Woche werden Mäuse getötet und Dickdarm entnommen. Die Doppelpunkte werden gespült und in Längsrichtung geöffnet. Der Dickdarm wird auf Tumorgröße und Tumorzahl untersucht.

Ein Längsschnitt des Dickdarms in Dritteln kann eingebettet und zur histologischen Analyse eingereicht werden. Mit Hilfe der Lichtmikroskopie können Tumore gezählt und klassifiziert werden. Wir demonstrieren ein Protokoll, in dem die Verabreichung des genotoxischen Wirkstoffs ein OM ist, gefolgt von drei Zyklen des proinflammatorischen Mittels.

DSS erzeugt schnell und konsistent Dickdarmtumoren bei Mäusen mit morphologischen und molekularen Ähnlichkeiten zu denen, die bei menschlichen Colitis-assoziierten Krebsmäusen beobachtet werden, die am Tag Null individuell mit Schwanzmarkierungen oder Ohrclips markiert wurden, notieren Sie das Ausgangsgewicht jeder Maus auf einem Tisch und injizieren Sie dann jeder Maus eine Lösung von 10 Milligramm pro Kilogramm einer OM-Übung. Vorsicht beim Umgang mit einem OM, da es sich um einen genotoxischen Wirkstoff handelt, wurde der Geizhals am siebten Tag mit einer 2,5%igen DSS-Lösung als Trinkwasser für die folgende Woche versorgt. Um diese Lösung herzustellen, geben Sie DSS-Pulver in destilliertes Wasser und mischen Sie, bis es sich aufgelöst hat.

Die Lösung ist fertig, nachdem sie durch einen 0,2-Mikron-Celluloseacetatfilter geleitet wurde. Um eine kontinuierliche Versorgung mit DSS-Lösung für sieben Tage zu gewährleisten. Ersetzen Sie DSS alle zwei bis drei Tage.

Stellen Sie die Käfige nach dieser Zeit für zwei Wochen wieder auf Wasser um. Wiegen Sie Mäuse zwei- bis dreimal pro Woche und achten Sie auf rektale Blutungen und Durchfall. Mäuse mit großen Tumoren können vorübergehend einen Rektumprolaps entwickeln, obwohl dies die Überlebensrate im Allgemeinen nicht verringert.

Der Gewichtsverlust im Vergleich zum Ausgangswert wird als Ersatzmaß für den Schweregrad der Kolitis verwendet. Ein Gewichtsverlust von bis zu 10% zusammen mit zwei bis drei Tagen Durchfall und rektalen Blutungen ist in der Woche nach einem vollständigen Zyklus der DSS-Endoskopie zu erwarten. Folgende. Der zweite oder dritte Zyklus des DSS kann durchgeführt werden, um das Tumorwachstum in vivo vor der Tötung zu bestätigen.

Da das A-O-M-D-S-S-Modell bei der Herstellung von Tumoren recht zuverlässig ist, ist dieser Schritt in der Regel nicht erforderlich. Nur wenige Mäuse sollten mit dieser Methode untersucht werden, da sie das Potenzial hat, Maustumore zu zerstören. Ihr Arbeitsbereich sollte ein Becherglas mit sterilem Phosphat, gepufferter Kochsalzlösung oder PBS sowie ein leeres Becherglas umfassen.

Um gebrauchtes PBS zu entsorgen, ziehen Sie acht bis 10 Milliliter PBS in eine Spritze und befestigen Sie es pro Anwendung am Endoskop. Beim Spülen des intraluminalen Inhalts wird jede Maus mit inhalativer oder injizierbarer Sedierung betäubt und die Maus auf einem flachen Brett fixiert. Mit Klebeband an Schwanz und Brust können Mausfußballen eingeklemmt werden. Um eine ausreichende Sedierung zu gewährleisten, kneifen Sie mit Daumen und Zeigefinger den Unterbauch der Maus zusammen, um den Anus freizulegen, und schieben Sie das Muren-Endoskop in das Rektum der Maus vor.

Verwenden Sie PBS sanft zum Aufblasen und Bewässern, um die intraluminale Sicht zu verbessern und Stuhlinhalt zu entfernen. Schieben Sie das Endoskop langsam weiter, während Sie den Monitor beobachten. Für das Vorhandensein von groben Tumoren an Tag 70 sollte jede A-O-M-D-S-S-s-behandelte Maus mehrere Dickdarmtumoren beherbergen und bereit für die Beurteilung sein.

Dieser Zustand kann Wochen bis Monate hinausgezögert werden, wenn größere Tumore gewünscht werden. Bereiten Sie eine PBS-gefüllte Spritze vor, die an einer Sondennadel befestigt ist. Eine Spritze, die mit einer 10%igen Formalin-Basis-OP-Schere beladen ist, eine Schere mit abgerundeten Spitzen.

Eine kleine Spritze, die mit 1%iger Ian Blue Lösung und einer feinen Pinzette gefüllt ist. Legen Sie außerdem ein kaltes Tablett, ein Ausweichboot mit gekühltem PBSA-Rasierer zum Schneiden und ein mit 10% Formalin gefülltes Fixierungsbecken bereit, um jede Maus durch isof, Fluor und Gebärmutterhalsdislokation oder eine andere institutionell anerkannte Methode einzuschläfern. Es können Endgewichts- und andere Messungen vorgenommen werden.

Legen Sie die Maus zu diesem Zeitpunkt mit der Bauchseite auf ein Schneidebrett. Besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol, um Haare aus dem Sezierbereich zu halten. Fassen Sie mit einer Pinzette die Mittellinie des Bauches und machen Sie einen kleinen Schnitt durch die Haut, um das Bauchfell freizulegen.

Trennen Sie die Haut mit sanfter Traktion vom Bauchfell und legen Sie die gesamte Bauchhöhle frei. Machen Sie einen Schnitt in das Bauchfell und verlängern Sie diesen Schnitt entlang des Rippenrandes beidseitig. Streichen Sie mit einer geschlossenen Schere den Dünndarm und den Dickdarm zur Seite.

Dadurch werden die mesenterialen Lymphknoten freigelegt, die optional entnommen werden können. Zur Beurteilung fegen Sie die genitalen Harnwege nach unten, um den absteigenden Dickdarm und das Rektum freizulegen, entfernen Sie die Blase und die Fortpflanzungsorgane nach Bedarf, um das Becken weiter freizulegen. Achten Sie darauf, benachbartes Gewebe nicht zu stören.

Schneiden Sie durch die unteren und oberen Schambeinäste, um den analen rektalen Übergang freizulegen. Schneiden Sie die Haut um den analen rektalen Übergang herum, um den Dickdarm zu befreien und gleichzeitig eine sanfte Traktion nach oben zu gewährleisten. Mit der mesenterialen Pinzette können Ansätze des Dickdarms herausgeschnitten oder weggerissen werden.

Es ist wichtig, einen Teil der Haut am analen rektalen Übergang zu erhalten, da dieser Bereich häufig von Dysplasie betroffen ist. Durchtrennen Sie den Dickdarm vom Dünndarm direkt neben dem Blinddarm. Trennen Sie das Secum vom angrenzenden Dickdarm mit einer 18-Gauge-Sondennadel, die an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist.

Spülen Sie den Dickdarm mit eiskaltem PBS, so dass die Flüssigkeit mit einer Schere mit abgerundeten Kanten in physiologischer Richtung austritt. Öffne den Dickdarm entlang seines Mesenteriums. Malen Sie den offenen Doppelpunkt auf das kalte Tablett.

Stellen Sie sicher, dass das Tablett ausreichend aufgetaut ist, damit das Taschentuch nicht einfriert. Tragen Sie ein paar Tropfen 1%Ian Blue mit einem Finger auf, um Tumore besser sichtbar zu machen. Beurteilen Sie die Anzahl und Größe des Tumors mit einem Lineal oder machen Sie Fotos für die digitale Analyse.

Kleine Tumorabschnitte im angrenzenden normalen Gewebe können zu diesem Zeitpunkt für die zukünftige Analyse mit RNA-Proteinen oder immunhistochemischen Methoden herausgeschnitten werden, wobei ein Teil des Dickdarms für die histologische Beurteilung übrig bleibt. Tragen Sie 10%formal mit einer Spritze oder einem Finger in den verbleibenden Dickdarm auf dem kalten Tablett auf und lassen Sie das Gewebe mindestens 30 Sekunden lang fixieren. Auf diese Weise wird der Transfer in das Fixierbecken erleichtert.

Stellen Sie sicher, dass die restliche Form abgewischt wird, bevor Sie einen neu geöffneten Doppelpunkt auf dasselbe Tablett malen. Übertragen Sie den Doppelpunkt in ein Becken, das mit 10%Formin gefüllt und an den Rändern festgesteckt ist. Nach dreistündiger Fixierung entsorgen, formen und durch 70%iges Ethanol ersetzen.

Der Dickdarm kann in 70%igem Ethanol auf unbestimmte Zeit konserviert werden. Bei schwacher Hitze eine Lösung aus 2%Agar herstellen und einen sauberen Objektträger auf eine Glasplatte legen. Schneiden Sie den fixierten Doppelpunkt in Drittel und geben Sie unbenutzte Stücke wieder in das Ethanolbecken.

Schneiden Sie die Abschnitte mit zwei Rasierern auf eine einheitliche Größe ab. Betten Sie Doppelpunktabschnitte und -schichten in Agar auf dem sauberen Objektträger ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den nächsten Doppelpunkt.

Segmentieren Sie den Ausschnitt, den überschüssigen Agar und legen Sie den eingebetteten Dickdarm in eine Kassette zur Verarbeitung und Färbung mit Hämatin und Eoin. Abbildung eins zeigt das Protokoll für die Kolitis-assoziierte Krebsinduktion. Abbildung zwei zeigt das Gewicht der Maus im Verhältnis zum Ausgangswert während einer OM- und DSS-Verabreichung.

Beachten Sie, dass Mäuse in der Woche nach jedem DSS-Zyklus fünf bis 10 % ihres Körpergewichts verlieren. Der Gewichtsverlust in diesem Experiment ist ein Surrogatmarker für die Schwere der Colitis. Abbildung drei zeigt eine Ansicht von Tumoren im distalen Dickdarm mittels Muren-Endoskopie am Tag 50 der A-O-M-D-S-S-Behandlung.

Beachten Sie, dass die multiplen polypoiden Massen, die das Lumen des distalen Dickdarms in den Panels B und C im Vergleich zum normalen Dickdarm blockieren. In der vierten Abbildung ist ein längsgeöffneter Dickdarm der Maus zu sehen, der das grobe Erscheinungsbild von Tumoren veranschaulicht. Zu beachten sind die höhere Tumorlast im distalen Dickdarm und die charakteristische Textur des proximalen Dickdarms mit geringem Tumorwachstum.

Abbildung fünf zeigt Tumoren, die durch Anwendung von lc und blauer Färbung hervorgehoben wurden. Beachten Sie, wie der Farbstoff die normale Textur des Dickdarms sowie die Grenzen jedes einzelnen Tumors betont. Eine solche Färbung kann bei der präzisen Vermessung von Tumorbereichen per Lineal oder digitaler Messung hilfreich sein.

Abbildung sechs zeigt die repräsentative Verteilung der durchschnittlichen Anzahl von Tumoren pro Maus, die mit einem OM und DSS behandelt wurden. Beachten Sie, dass sich die meisten Tumoren im distalen Dickdarm befinden und weniger als zwei Millimeter groß sind. Abbildung 7 zeigt in Paraffin eingebettete Längsschnitte des Dickdarms in einer Kassette und einen H- und E-Färbungsträger.

Beachten Sie, dass Reste von S und Bläue die H- und E-Färbung nicht beeinträchtigen. Auf dem Diabild ist ein großer Tumor eingekreist. Die distalen, mittleren und proximalen Bezeichnungen ergeben sich aus der Drittelteilung des gesamten Dickdarms zwischen Blinddarm und Anus.

Abbildung acht zeigt die repräsentative Histologie eines Tumors, der aus einer OM- und DSS-Verabreichung im distalen Dickdarm resultiert. Die gezeigten Mikroskopaufnahmen sind mit H und E-B-R-D-u und Beta-Catenin gefärbt und zeigen dysplastische Veränderungen, die denen der humanen Adenokarzinome des Dickdarms ähneln. In diesem Video haben wir ein Protokoll für die entzündungsbedingte Dickdarmtumorgenese bei Mäusen demonstriert, bei dem eine einzige Injektion eines OM gefolgt von drei siebentägigen DSS-Zyklen verwendet wird.

Über einen Zeitraum von 10 Wochen induziert dieses Modell Tumore mit histologischen und molekularen Veränderungen, die denen bei humanen Colitis-assoziierten Krebserkrankungen sehr ähnlich sind, und stellt ein äußerst wertvolles Modell für die Untersuchung der Onkogenese und Chemoprävention bei dieser Krankheit dar.