Modeling Colitis-assoziierten Krebs mit Azoxymethan (AOM) und Dextransulfat Natrium (DSS)

Am Tag null injizierte Myer Azoxymethan oder ein OM in der folgenden Woche. Ihr Trinkwasser wird durch eine Lösung ersetzt, die Dextransulfatnatrium oder DSS enthält. In der dritten Woche erhalten die Mäuse zwei Wochen lang Wasser.

Dieser DSS-Wasserkreislauf wird zwei weitere Male wiederholt. Nach dem zweiten DSS-Zyklus können Mäuse mittels Spiegelung auf Tumore untersucht werden.

Nach Woche 10 werden die Mäuse getötet und die Kolons entnommen. Die Kolons werden gespült und längs eröffnet. Die Kolons werden auf Tumorgröße und Anzahl der Tumoren untersucht.

Ein Längsschnitt des Kolons in Drittel kann eingebettet und zur histologischen Analyse eingereicht werden. Mit Hilfe der Lichtmikroskopie können Tumore gezählt und klassifiziert werden. Wir demonstrieren ein Protokoll, bei dem die Gabe des genotoxischen Agents a OM gefolgt von drei Zyklen des proinflammatorischen Agents erfolgt.

DSS erzeugt rasch und reproduzierbar Kolontumoren bei Mäusen mit morphologischen und molekularen Ähnlichkeiten zu den bei menschlichem kolitisassoziiertem Karzinom beobachteten Tumoren. Kennzeichnen Sie die einzelnen Mäuse am Tag null mit Schwanzmarkierungen oder Ohrmarken, notieren Sie das Ausgangsgewicht jedes Mäuschens in einer Tabelle und injizieren Sie anschließend jedem Tier eine Lösung von 10 Milligramm pro Kilogramm eines OM-Trainings. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit OM, da es ein genotoxisches Agens ist. Am Tag sieben erhalten die Tiere eine 2,5-%-ige DSS-Lösung als Trinkwasser für die folgende Woche. Um diese Lösung herzustellen, geben Sie DSS-Pulver in destilliertes Wasser und rühren, bis es vollständig gelöst ist.

Die Lösung ist gebrauchsfertig, nachdem sie durch einen 0,2-Mikron-Celluloseacetat-Filter geführt wurde. Um eine kontinuierliche Versorgung mit DSS-Lösung über sieben Tage sicherzustellen, sollte das DSS alle zwei bis drei Tage erneuert werden.

Nach diesem Zeitraum wechseln Sie die Käfige für zwei Wochen wieder auf Wasser. Wiegen Sie die Mäuse zwei- bis dreimal pro Woche und beobachten Sie sie auf rektale Blutungen und Durchfall. Mäuse mit großen Tumoren können vorübergehend einen rektalen Prolaps entwickeln, dies beeinträchtigt jedoch im Allgemeinen nicht den Überlebensprozentsatz.

Der Gewichtsverlust relativ zur Ausgangsbasis wird als Surrogatmaß für die Schwere der Kolitis verwendet. Ein Gewichtsverlust von bis zu 10 % zusammen mit zwei bis drei Tagen Durchfall und rektalem Bluten ist in der Woche nach einem vollständigen DSS-Endoskopiezyklus zu erwarten. Nach dem zweiten oder dritten DSS-Zyklus kann eine Bestätigung des Tumorwachstums in vivo vor der Tötung erfolgen.

Da das A-O-M-D-S-S-Modell sehr zuverlässig Tumoren erzeugt, ist dieser Schritt im Allgemeinen nicht erforderlich. Nur wenige Mäuse sollten mit dieser Methode untersucht werden, da sie das Potenzial hat, die Tumoren der Mäuse zu stören. Ihr Arbeitsbereich sollte einen Becher mit steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS sowie einen leeren Becher umfassen.

Um das verwendete PBS zu entsorgen, ziehen Sie acht bis zehn Milliliter PBS in eine Spritze auf und befestigen Sie diese pro Anwendung am Endoskop. Um intraluminale Inhalte zu spülen, betäuben Sie jede Maus mit inhalativer oder injizierbarer Sedierung und befestigen Sie die Maus mit Klebeband am Schwanz und am Brustbereich auf einer flachen Unterlage; die Fußsohlen der Maus können fixiert werden. Um eine ausreichende Sedierung sicherzustellen, verwenden Sie Daumen und Zeigefinger, um den Unterbauch der Maus zusammenzudrücken, um den Anus freizulegen, und führen Sie das Muren-Endoskop in das Rektum der Maus ein.

Vorsichtig mit PBS aufblasen und spülen, um die intraluminale Sicht zu verbessern und fäkale Inhalte zu entfernen. Setzen Sie die langsame Vorschubbewegung des Endoskops unter Beobachtung des Monitors fort. Am Tag 70 sollte jedes mit A-O-M-D-S-S behandelte Maus mehrere Kolontumoren aufweisen, sofern makroskopische Tumoren vorhanden sind, und zur Beurteilung bereitstehen.

Dieser Zustand kann um Wochen bis Monate verzögert werden, wenn größere Tumore gewünscht sind. Bereiten Sie eine mit PBS gefüllte Spritze vor, die an eine Gavagesonde angeschlossen ist. Eine mit 10 % Formalin beladene Spritze, chirurgische Schere, Schere mit abgerundeten Spitzen.

Eine kleine Spritze, gefüllt mit 1 % Ian-Blau-Lösung, und eine feine Pinzette. Legen Sie außerdem ein kaltes Tablett, ein „away“-Boot mit gekühlter PBS, ein neues Rasiermesser zum Schneiden und ein Fixierbecken, gefüllt mit 10 % Formalin, bereit. Töten Sie jede Maus durch Isofluran und zervikale Dislokation oder eine andere institutionell genehmigte Methode. Endgewicht und andere Messungen können anschließend vorgenommen werden.

Zu diesem Zeitpunkt legen Sie die Maus mit der ventralen Seite nach oben auf ein Schneidebrett. Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70 %igem Ethanol ein, um die Haare vom Präparationsbereich fernzuhalten. Greifen Sie mit einer Pinzette die Bauchmitte und führen Sie einen kleinen Schnitt durch die Haut, um das Peritoneum freizulegen.

Verwenden Sie sanfte Zugkraft, um die Haut vom Peritoneum zu lösen, und legen Sie die gesamte Bauchhöhle frei. Führen Sie einen Schnitt in das Peritoneum ein und verlängern Sie diesen Schnitt beidseitig entlang des Rippenbogens. Benutzen Sie geschlossene Scheren, um Dünndarm und Dickdarm zur Seite zu schieben.

Dadurch werden die mesenterialen Lymphknoten freigelegt, die optional gewonnen werden können. Zur Beurteilung den urogenitalen Trakt kaudal verlagern, um den Colon descendens und das Rektum freizulegen, und die Harnblase sowie die Fortpflanzungsorgane nach Bedarf entfernen, um das Becken weiter freizulegen, wobei darauf geachtet werden muss, angrenzende Gewebe nicht zu verletzen.

Schneiden Sie durch die untere und obere Schambeinäste, um die anorektale Verbindung freizulegen. Schneiden Sie die Haut um die anorektale Verbindung herum, um den Kolon zu lösen, wobei sanfte Zugkraft nach oben ausgeübt wird. Mit mesenterischen Pinzetten können die mesenterischen Verbindungen des Kolons abgetrennt oder vorsichtig gelöst werden.

Es ist wichtig, etwas Haut an der anorektalen Übergangszone beizubehalten, da dieser Bereich häufig von einer Dysplasie betroffen ist. Durchtrennen Sie das große vom kleinen Darm unmittelbar proximal zum Zäkum. Lösen Sie das Zäkum vom angrenzenden Colon mithilfe einer mit einer Fünf-Milliliter-Spritze verbundenen 18-Gauge-Sondierkanüle.

Spülen Sie den Dickdarm mit eiskalter PBS, sodass die Flüssigkeit in physiologischer Richtung austritt, unter Verwendung von Scheren mit abgerundeten Kanten. Öffnen Sie den Dickdarm entlang seines Mesenteriums. Legen Sie den geöffneten Dickdarm auf das kalte Tablett.

Stellen Sie sicher, dass das Tablett ausreichend aufgetaut ist, um das Gewebe nicht einzufrieren. Tragen Sie mit dem Finger einige Tropfen 1 % Ian Blue auf, um Tumore besser sichtbar zu machen. Bestimmen Sie die Anzahl und Größe der Tumore mit einem Lineal oder fertigen Sie Fotografien für die digitale Analyse an.

Kleine Tumorabschnitte im angrenzenden Normalgewebe können an dieser Stelle für eine spätere Analyse mittels RNA-, Protein- oder immunhistochemischer Methoden entfernt werden, wobei ein Teil des Kolons für die histologische Beurteilung zurückbleibt. Geben Sie 10 % Formalin mit einer Spritze oder dem Finger in den verbleibenden Kolonabschnitt auf dem kalten Tablett, und lassen Sie das Gewebe mindestens 30 Sekunden lang fixieren. Auf diese Weise wird die Übertragung in das Fixierbecken erleichtert.

Stellen Sie sicher, dass vor dem Auftragen eines neuen geöffneten Kolons auf demselben Tablett jeglicher Restformin entfernt wurde. Überführen Sie den Kolon in ein Becken, das mit 10 % Formin gefüllt ist, und fixieren Sie ihn an den Rändern. Nach dreistündiger Fixierung entsorgen Sie das Formin und ersetzen es durch 70 % Ethanol.

Das Colon kann unbegrenzt in 70 % Ethanol aufbewahrt werden. Eine Lösung von 2 % Agar unter schwacher Wärmezufuhr herstellen und eine saubere Objektträger auf einer Glasplatte bereitstellen. Das fixierte Colon in drei Teile schneiden und ungenutzte Stücke in das Ethanolbad zurücklegen.

Kürzen Sie die Schnitte mit zwei Rasierklingen auf eine einheitliche Größe. Legen Sie die Kolonschnitte und -schichten in Agar auf dem sauberen Objektträger ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das nächste Kolon.

Schneiden Sie ein Segment ab, entfernen Sie überschüssiges Agar und geben Sie den eingebetteten Dickdarm in eine Kassette zur Verarbeitung und Färbung mit Hämatin und Eosin. Abbildung eins zeigt den Protokollablauf zur Induktion von kolitisassoziiertem Krebs. Abbildung zwei zeigt das Mausgewicht relativ zum Ausgangswert während der Verabreichung von OM und DSS.

Beachten Sie, dass die Mäuse in der Woche nach jedem DSS-Zyklus fünf bis zehn Prozent ihres Körpergewichts verlieren. Der Gewichtsverlust in diesem Experiment ist ein Surrogatmarker für die Schwere der Kolitis. Abbildung drei zeigt einen Überblick über Tumoren im distalen Kolon mittels muriner Endoskopie am Tag 50 der A-O-M-D-S-S-Behandlung.

Beachten Sie die mehrfachen polypösen Massen, die das Lumen des distalen Kolons in den Abbildungen B und C im Vergleich zum normalen Kolon verlegen. In Abbildung A zeigt eine Abbildung vier ein längs eröffnetes Mauskolon, das das makroskopische Erscheinungsbild von Tumoren veranschaulicht. Beachten Sie die höhere Tumormasse im distalen Kolon und die charakteristische ated-Textur des proximalen Kolons mit geringem Tumorwachstum.

Abbildung fünf zeigt Tumore, die durch die Anwendung von lc und Blaufärbung hervorgehoben werden. Beachten Sie, wie die Färbung die normale Textur des Kolons sowie die Grenzen jedes einzelnen Tumors betont. Eine solche Färbung kann bei der genauen Messung der Tumorflächen mit dem Lineal oder durch digitale Messung hilfreich sein.

Abbildung sechs zeigt die repräsentative Verteilung der durchschnittlichen Anzahl von Tumoren pro Maus, die mit OM und DSS behandelt wurde. Beachten Sie, dass die Mehrheit der Tumoren im distalen Kolon lokalisiert ist und einen Durchmesser von weniger als zwei Millimetern aufweist. Abbildung sieben zeigt paraffin-eingebettete Längsschnitte des Kolons in einer Kassette sowie einen H-und-E-gefärbten Objektträger.

Beachten Sie, dass Reste von S und blaue Färbung die H-und-E-Färbung nicht stören. Ein großer Tumor ist auf dem Objektträgerbild umkreist. Die Bezeichnungen distal, mittel und proximal ergeben sich aus der Aufteilung des gesamten Kolons in Drittel zwischen Zäkum und Anus.

Abbildung acht zeigt die repräsentative Histologie eines Tumors, der nach Verabreichung von OM und DSS im distalen Kolon entstanden ist. Die dargestellten Mikrofotografien wurden mit H und E-B-R-D-U sowie Beta-Catenin gefärbt und weisen dysplastische Veränderungen auf, die menschlichen Kolonadenokarzinomen ähneln. In diesem Video haben wir ein Protokoll zur entzündungsbedingten kolorektalen Tumorbildung bei Mäusen demonstriert, das eine Einzelinjektion von OM gefolgt von drei siebentägigen Zyklen mit DSS umfasst.

Über einen Zeitraum von 10 Wochen induziert dieses Modell Tumoren mit histologischen und molekularen Veränderungen, die jenen beim colitisassoziierten Karzinom des Menschen stark ähneln, und stellt ein äußerst wertvolles Modell für die Untersuchung der Onkogenese und der chemoprophylaktischen Maßnahmen bei dieser Erkrankung dar.