Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie

Diese Studie des Speichel-Peptids verwendet eine lutscherähnliche Ultrafiltrationssonde, gefolgt von einer direkten nano-LC-LTQ-Massenspektrometrie-Analyse. Zunächst wird die LLUF-Sonde unter Verwendung einer Polyethersulfon-Membran und eines Ethylen-Propylen-Rohrs zusammengesetzt. Anschließend werden Speichelproben von Freiwilligen gesammelt und durch die LLUF-Sonde verarbeitet, um den Speichel zu gewinnen.

Danach unmittelbar zur Nano-L-C-L-T-Q-Massenspektrometrie übergehen und die Daten von Speichelproben mit und ohne LLUF-Sondenbehandlung analysieren. Letztendlich kann das Speichelpeptid durch Analyse der L-C-M-S-S-Daten und Vergleich der identifizierten Peptide zwischen den beiden Proben erhalten werden. Dieser Ansatz, bei dem eine lutscherartige Ultrafiltrationssonde mit einer direkten Nano-LC-LTQ-Massenspektrometrie-Analyse gekoppelt wird, bietet entscheidende Vorteile gegenüber anderen Methoden wie dem Verdauen von Speichelproteinen in Peptide.

Anschließend erfolgt die Massenspektrometrie-Analyse. Der LUF PRO vereinfacht und reinigt den Speichel und verbessert zudem die MS-Detektion von Peptiden im Gesamtspeichel für die klinische Anwendung. Versiegeln Sie die Polyetherschaum-Membranen mit Epoxidharzkleber an den Rändern der dreieckigen Polypropylen-Spateln. Befestigen Sie dann ein Teflon-Fluorethylenpropylen-Röhrchen an einem Zylinderausgang eines Dreiecks.

Polypropylen-Spatel: Sterilisieren Sie die Proben mit 70 %igem Alkohol über Nacht, um die korrekte Abdichtung zu überprüfen. Tauchen Sie die LLUF-Proben in eine 50 Milligramm pro Milliliter starke Blau-Dextran-Lösung für zwei Stunden ein. Bestätigen Sie das Fehlen von Blau-Dextran in den gesammelten Proben.

Rekrutieren Sie gesunde Freiwillige im Alter von 20 bis 40 Jahren. Bitten Sie die Versuchsperson nach einer Mundspülung mit Wasser, Speichelproben in ein mit Eis gekühltes Gefäß zu spucken. Sammeln Sie alle Proben und lagern Sie sie auf Eis.

Unmittelbar nach der Sammlung begeben Sie sich mit 200 Mikroliter Speichel für die Probenahme mit LLUF-Probenahmeköpfen in einen Raum mit vier Grad Celsius. Tauchen Sie nun die Polyethermembran in menschlichen Speichel in einer Kulturschale ein. Erzeugen Sie einen Unterdruck, indem Sie eine Spritze zurückziehen, um einen Ultrafiltrationsprozess zur Probenahme aus dem Speichel zu simulieren.

Als Nächstes bestimmen Sie die Protein-Konzentrationen. Bereiten Sie jeweils ein Mikrogramm pro Mikroliter der Speichelproteinproben für die Analyse mittels Nano-LC-Massenspektrometrie vor. Für die Probenanalyse verwenden wir eine Exigent Nano-LC, die online mit einem Finnegan LTQ-Massenspektrometer gekoppelt ist. Laden Sie zunächst fünf Mikroliter der undigested Speichelproben mittels Autosampler auf die Trap-Säule des Nano-LC-Systems.

Nach einem Waschschritt wechseln Sie das Ventil und leiten einen linearen Gradienten von 0 bis 50 % Puffer B zur Fangsäule und zur C18-Trennsäule. Sammeln Sie im datenabhängigen Modus von Excalibur die MS/MS-Spektren der vier stärksten MS-Ionen mit einer Intensität über 1 × 10⁴. Führen Sie für jede Probe doppelte Analysen von drei verschiedenen separaten Präparationen durch.

Danach importieren Sie die Datendatei in das Sequester Sorcerer Two-System und wählen eine Suche gegen eine geeignete menschliche NCBI-Proteindatenbank unter Verwendung der nicht enzymatischen Spezifität. Nach der Sequester-Suche werden die Ergebnisse automatisch gefiltert, validiert und in Peptide Prophet und Protein Prophet basierend auf den Sequester-Ergebnissen angezeigt. Peptide Prophet schätzt eine umfassende Wahrscheinlichkeits-P-Score-Wertung dafür, ob eine Peptidzuordnung korrekt oder inkorrekt ist, und identifiziert zusätzliche Informationen zu jeder Peptidsequenz.

Protein profit berechnet anhand der Peptide, die den Ms.Ms-Spektren zugeordnet sind, eine Wahrscheinlichkeitswertung zwischen null und eins für jedes Protein. Dieser Abschnitt bestimmt die Fähigkeit von LLUF-Sonden, orale Bakterien zur bakteriellen Nachkultur zu entfernen, wobei Speichelproben vor und nach der Gewinnung mittels LLUF-Sonde auf Bohrplatten aufgetragen werden, um aerobe Bakterien zu testen. Verwenden Sie antibiotikafreie LB-Bohrplatten bei 37 Grad Celsius für einen Tag; für anaerobe Bakterien verwenden Sie eine Gaspackung zur Kultur.

Die Probe wird einen Tag lang auf Bru-Brühe in Schüttelplatten unter anaeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius kultiviert. Die Herstellung von Lutscher-ähnlichen Ultrafiltrationsvorrichtungen erleichtert die Probenahme von Speichel in einem nachgeahmten oralen Milieu. In diesem System wird eine negativ geladene Polyethersulfon-Membran mit einer molekularen Grenzgröße von 30 Kilodalton an einen Polypropylen-Spatel geklebt und vor der LLUF-Sonde positioniert, um größere Proteine im Speichel herauszufiltern.

Um die menschliche orale Umgebung nachzuahmen, wird ein Schwamm mit Speichel mittels einer Spritze getränkt. Der Speichel wird über den angeschlossenen Schlauch filtriert und gesammelt. Der Vergleich von LC-Chromatogrammen des Speichels vor und nach der LLUF-Probenahme führte zur Identifizierung endogener Speichelpeptide mittels Nano-LC-LTQ-Massenspektrometrie.

Da diese differentiellen Chromatogramme ohne chemische oder enzymatische Verdauung gewonnen werden, vereinfachen sie die Probenvorbereitung für klinische Zwecke. In dieser Probe identifizierte die LLUF bei der Aufklärung der unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen 131 Peptide im unverdauten Speichel.

Diese Peptide sind Fragmente, die aus verschiedenen prolinreichen Proteinen stammen. Aktin, Alpha-Amylase, Alpha-1-Globin, Beta-Globin, His-Sustain-1, Keratin-1, Mucin-7, polymere immunoglobuline Rezeptor, Serin und S-100. A-9-26 Einzigartige Peptide, die in Speichel nach Filtration mit LLUF-Sonden identifiziert wurden, sind hauptsächlich Fragmente verschiedener prolinreicher Proteine.

Dieses aus Alpha-Amylase stammende Peptid wurde ausschließlich in einer Speichelprobe nachgewiesen, die ohne Sammlung mit LLUF-Probenahmesonden gewonnen wurde, was die Fähigkeit der LLUF-Sonden zur Entfernung großer Proteine veranschaulicht. Am bemerkenswertesten ist, dass nach Entfernung der größeren Proteine mehrere sequenzierte Peptide in der mit LLUF-Sonden gesammelten Speichelprobe detektierbar waren, insbesondere Peptide mit prolinreichen C-Termini, die in den Proben nach Ultrafiltration mittels LLUF-Sonden identifiziert wurden. Sie sollten nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie A-L-L-L-L-U-F PRO zur einfachen Speichelentnahme für die Massenspektrometrie verwendet wird.

Eine bessere Analyse ist sehr wichtig, um Speichel unter konsistenten Bedingungen zu sammeln und einfach zu handhaben. Sobald man die Methode beherrscht, glaube ich, dass diese Technik innerhalb von drei Stunden ordnungsgemäß durchgeführt werden kann. Dieser Ansatz mit einer lutscherähnlichen Ultrafiltrationssonde in Kombination mit direkter nano-LC-MS/MS-Spektrenkettenanalyse erleichtert klinische Anwendungen für Biomarker bei der Diagnose menschlicher Erkrankungen.