Name: Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Lernen Sie die Probennahme menschlichen Speichels mit einer lollipop-ähnlichen Ultrafiltrationssonde für die klinische Massenspektrometrie. Diese Methode erleichtert die Detektion niedrig abundanter Peptide erheblich.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 und R21-I58002-01) unterstützt. Wir danken C. Niemeyer für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben festgestellt, dass viele Peptidfragmente in menschlichen unverdaute Speichel abgegeben. Diese Peptidfragmente sind Derivate aus verschiedenen Formen von Prolin-reiche Proteine, Actin, alpha-Amylase, Alpha-1-Globin, beta-Globin, histain 1, Keratin 1, Muzin 7, polymeren Immunglobulin-Rezeptor, satherin, S100A9. Es könnte viele Faktoren, die die Produktion von Peptiden mit ungeklärter Spaltstellen sein. Zum Beispiel können einige Peptidfragmente natürlich vorhanden sein in menschlichem Gesamtblut Speichel. Viele ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Polyethersulfonmembranen </td><td> Pall Corporation </td><td></td><td> 30 kDa MWCO </td></tr><tr><td> Teflon fluorierten Ethylen-Propylen-Rohr </td><td> Upchurch Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Blaudextran </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nano-LC-System </td><td> Eksigent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C18-Trap-Säule </td><td> Agilent </td><td> 5065-9913 </td><td></td></tr><tr><td> LTQ linearen Ionenfallen-Massenspektrometer </td><td> Thermo Fisher </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sorcerer 2 </td><td> Sage-N ReseaRCH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril-0.1% Ameisensäure </td><td> JT Baker </td><td> 9832-03 </td><td> LC / MS-Klasse </td></tr><tr><td> Wasser-0,1% Ameisensäure </td><td> JT Baker </td><td> 9834-03 </td><td> LC / MS-Klasse </td></tr></tbody></table>

probenahme menschliche speichel indigene peptidoms mit einem lollipop-like ultrafiltration sonde: vereinfachen und erweitern peptid-erkennung für klinische massenspektrometrie

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Obwohl menschlichen Speichel Proteom-und Peptidoms worden 1-2 offenbart haben sie majorly von tryptischen Verdaus von Speichel-Proteine ​​identifiziert. Identifizierung von indigenen Peptidoms von menschlichem Speichel ohne vorherige Spaltung mit exogenen Enzyme wird aber notwendig, da nativen Peptide im menschlichen Speichel mögliche Werte stellen für die Diagnose von Krankheiten, die Vorhersage Fortschreiten der Erkrankung sowie die Überwachung therapeutische Wirksamkeit. Entsprechende Probenahme ist ein wichtiger Schritt für die Verbesserung der Identifikation der menschlichen Speichel indigenen Peptidoms. Traditionelle Methoden der Probenahme menschlichen Speichel mit Zentrifugation, um Verschmutzungen zu entfernen 4.3 kann zu zeitaufwendig anwendbar zu sein für den klinischen Einsatz. Darüber hinaus kann Müllbeseitigung durch Zentrifugation nicht in der Lage, die meisten der infizierten Krankheitserregern reinigen und entfernen Sie die hohe Abundanz Proteine, die oft behindern die Identifikation von geringer Menge Peptidoms. Herkömmliche Ansätze Proteomik, dass priLinie nutzen zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE Gelen) in Konjugation mit in-Gel-Verdau, imstande sind, viele Proteine ​​Speichel 5-6. Allerdings ist dieser Ansatz im Allgemeinen nicht ausreichend empfindlich gegenüber niedrigen Häufigkeit Peptide / Proteine ​​zu detektieren. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) basierten Proteomik ist eine Alternative, die Proteine ​​ohne vorherige 2-DE Trennung identifizieren können. Obwohl dieser Ansatz bietet eine höhere Empfindlichkeit, muss es in der Regel vor Proben-Fraktionierung 7 und vor dem Verdau mit Trypsin, was es schwierig für den klinischen Gebrauch macht. Um das Hindernis in der Massenspektrometrie durch Probenvorbereitung zu umgehen, haben wir eine Technik, die als Kapillare Ultrafiltration (CUF) Sonden 8-11 entwickelt. Daten aus unserem Labor gezeigt, dass die Sonden, die CUF Erfassung Proteine ​​in vivo aus verschiedenen Mikroumgebungen bei Tieren in einem dynamischen und minimal invasiven Weise 8 -11. Keine Zentrifugation ist notwendig, da ein Unterdruck durch einfaches Herausziehen Spritze während der Probenahme erstellt wird. Die CUF-Sonden mit LC-MS kombiniert erfolgreich identifizierten tryptischen-verdaute Proteine ​​11.08. In dieser Studie wurden aufgerüstet wir die Ultrafiltration Sampling-Technik, indem sie einen Lutscher-wie Ultrafiltration (LLUF) Sonde, die sich leicht in die menschliche Mundhöhle kann passen. Die direkte Analyse mittels LC-MS ohne Trypsin-Verdau zeigte, dass menschliche Speichel enthält viele indigenously Peptidfragmente aus verschiedenen Proteinen abgeleitet sind. Probenahme mit Speichel LLUF Sonden vermieden Zentrifugation aber effektiv entfernt viele größere und hohe Abundanz Proteine. Unsere massenspektrometrischen Ergebnisse dargestellt, dass viele geringer Menge nachweisbar Peptide nach Herausfiltern von größeren Proteinen mit LLUF Sonden wurde. Erkennung von Peptiden geringer Menge Speichel war unabhängig von mehrstufigen Stichprobe Trennung mit Chromatographie. Für die klinische Anwendung, verfügen die Sonden LLUFd mit LC-MS könnte möglicherweise in der Zukunft genutzt werden, um den Krankheitsverlauf aus Speichel zu überwachen.

Angesichts Speichel Probenahme für zukünftige klinische Anwendung wurde ein Lollipop-ähnliche Ultrafiltration (LLUF) Sonde hergestellt, um in die menschliche Mundhöhle passen. Direkte Analyse von unverdauten Speichel mit nanoLC-LTQ Massenspektrometrie zeigten die Fähigkeit von LLUF Sonden, um große Proteine ​​und hohe Abundanz Proteine ​​zu entfernen, und machen Low-reiche Peptide mehr nachweisbar.

Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie

Obwohl das humane Saliva-Proteom und -Peptidom bereits entschlüsselt wurden 1-2, erfolgte deren Identifizierung größtenteils anhand von tryptischen Verdauen von Speichelproteinen. Die Identifizierung ...

Diese Untersuchung der Speichel-Peptide nutzt eine lutscherähnliche Ultraschnellfiltrationssonde, gefolgt von einer direkten nano-LC-LTQ-Massenspektrometrie-Analyse. Zunächst wird die LLUF-Sonde unter Verwendung einer Polyethersulfon-Membran und einer Ethylen-Propylen-Röhre zusammengesetzt. Anschließend werden Speichelproben von Freiwilligen gesammelt und mittels der LLUF-Sonde aufgenommen, um den Speichel zu analysieren.Danach unmittelbar zur nano-L-C-L-T-Q-Massenspektrometrie übergehen und die Daten von Speichelproben mit und ohne LLUF-Sondenbehandlung analysieren. Letztendlich kann das Speichelpeptid durch Analyse der L-C-M-S-S-Daten und Vergleich der identifizierten Peptide zwischen den beiden Proben erhalten werden. Dieser Ansatz, bei dem eine lutscherartige Ultrafiltrationssonde mit einer direkten nano-LC-LTQ-Massenspektrometrie-Analyse gekoppelt wird, bietet entscheidende Vorteile gegenüber anderen Methoden, wie beispielsweise dem Verdauen von Speichelproteinen in Peptide.Anschließend an die Massenspektrometrie-Analyse vereinfacht und reinigt das LUF PRO die Speichelflüssigkeit und verbessert zudem die MS-Detektion von Peptiden im Gesamtspeichel für die klinische Anwendung. Versiegeln Sie die Polyetherschaum-Membranen mit Epoxidharzkleber an den Rändern der dreieckigen Polypropylen-Spateln. Befestigen Sie dann ein Teflon-Fluor-Ethylen-Propylen-Rohr an einem Zylinderausgang eines Dreiecks.Die Proben mit einem Polypropylen-Spatel sterilisieren und mit 70 %igem Alkohol über Nacht behandeln, um die korrekte Versiegelung zu überprüfen; tauchen Sie die LLUF-Proben in eine 50 Milligramm pro Milliliter starke Lösung von Blauem Dextran für zwei Stunden ein. Bestätigen Sie das Fehlen von Blauem Dextran in den gesammelten Proben. Rekrutieren Sie gesunde Freiwillige im Alter von 20 bis 40 Jahren. Bitten Sie die Versuchsperson nach einer Mundspülung mit Wasser, Speichelproben in ein mit Eis gekühltes Gefäß zu spucken. Vereinigen Sie alle Proben und lagern Sie sie auf Eis.Unmittelbar nach der Sammlung in einen Raum mit vier Grad Celsius gehen und 200 Mikroliter Speichel für die Probenahme mit LLUF-Probenahmeköpfen bereitstellen. Nun die Polyetherschaum-Membran in einer Kulturschale in menschlichen Speichel eintauchen. Durch das Zurückziehen eines Spritzenkolbens Unterdruck erzeugen, um einen Ultrafiltrationsprozess zur Probenentnahme aus dem Speichel zu simulieren.Als Nächstes bestimmen Sie die Protein-Konzentrationen. Bereiten Sie je ein Mikrogramm pro Mikroliter der Speichelproteinproben für die Nano-LC-Massenspektrometrie-Analyse vor. Für die Probenauswertung verwenden wir eine Exigent Nano-LC, die online mit einem Finnegan LTQ-Massenspektrometer gekoppelt ist. Laden Sie zunächst fünf Mikroliter der undigierten Speichelproben mittels Autosampler auf die Trap-Säule des Nano-LC-Systems.Nach einem Waschschritt wechseln Sie das Ventil und leiten einen linearen Gradienten von 0 bis 50 % Puffer B zur Fang- und C18-Trennsäule. Sammeln Sie im datenabhängigen Modus von Excalibur die MS/MS-Spektren der vier stärksten MS-Ionen mit einer Intensität über 1 × 10⁴. Führen Sie für jede Probe doppelte Analysen von drei verschiedenen separaten Präparationen durch.Danach importieren Sie die Datendatei in das Sequester Sorcerer Two-System und wählen eine Suche gegen eine geeignete menschliche NCBI-Proteindatenbank unter Verwendung der Nicht-Enzym-Spezifität. Nach der Sequester-Suche werden die Ergebnisse automatisch gefiltert, validiert und in Peptide Prophet und Protein Prophet basierend auf den Sequester-Ergebnissen angezeigt. Peptide Prophet schätzt eine umfassende Wahrscheinlichkeits-P-Score ein, der angibt, ob die Zuordnung eines Peptids korrekt oder inkorrekt ist, und identifiziert zudem zusätzliche Informationen zu jeder Peptidsequenz.Der Protein-„profit“ berechnet anhand der den Ms.Ms-Spektren zugeordneten Peptide für jedes Protein einen Wahrscheinlichkeitswert zwischen null und eins. Dieser Abschnitt untersucht die Fähigkeit von LLUF-Sonden, orale Bakterien zur bakteriellen Nachweiskultur zu entfernen, wobei Speichelproben vor und nach der Gewinnung mittels LLUF-Sonden auf Auger-Platten auf aerobe Bakterien getestet werden. Verwenden Sie antibiotikafreie LB-Auger-Platten bei 37 Grad Celsius für einen Tag; für anaerobe Bakterien verwenden Sie eine Gaspackung zur Kultur.Die Probe wird einen Tag lang auf Bru-Brühe in Auger-Platten unter anaeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius inkubiert. Die Herstellung von Lolli-ähnlichen Ultrafiltrationsvorrichtungen erleichtert die Probenahme von Speichel in einem nachgeahmten oralen Milieu. In diesem System wird eine negativ geladene Polyether-Handymembran mit einer Molekulargewichtsabscheidung bei 30 Kilodalton auf einen Polypropylenrührer geklebt und vor der LLUF-Sonde positioniert, um größere Proteine im Speichel auszufiltern.Um die menschliche orale Umgebung nachzuahmen, wird ein Schwamm mit Speichel mittels einer Spritze getränkt. Der Speichel wird über das angeschlossene Rohr gefiltert und gesammelt. Der Vergleich von LC-Chromatogrammen von Speichel vor und nach der LLUF-Probenahme führte zur Identifizierung indigener Speichelpeptide mittels Nano-L-C-L-T-Massenspektrometrie.Da diese differentiellen Chromatogramme ohne chemische oder enzymatische Verdauung gewonnen werden, vereinfachen sie die Probenvorbereitung für klinische Zwecke. In dieser Probe identifizierte die LLUF anhand der unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen 131 Peptide in unverdautem Speichel.Diese Peptide sind Fragmente, die aus verschiedenen prolinreichen Proteinen stammen. Aktin, Alpha-Amylase, Alpha-1-Globin, Beta-Globin, His-Sustain-1, Keratin, Mucin-7, polymere immunoglobuline Rezeptor, Serin und S-100. A 9 26 einzigartige Peptide, die im Speichel nach der Filtration mit LLUF-Sonden identifiziert wurden, sind hauptsächlich Fragmente verschiedener prolinreicher Proteine.Dieses aus Alpha-Amylase stammende Peptid wurde ausschließlich in einer Speichelprobe nachgewiesen, die ohne Sammlung mit LLUF-Probenahmesonden erfolgte, was die Fähigkeit der LLUF-Probenahmesonden verdeutlicht, große Proteine zu entfernen. Am bemerkenswertesten ist, dass nach dem Entfernen größerer Proteine mehrere Sequenzpeptide in der mit LLUF-Probenahmesonden gewonnenen Speichelprobe detektiert werden konnten; insbesondere Peptide mit prolinreichen C-Termini wurden in den Proben nach Ultrafiltration mittels LLUF-Probenahmesonden identifiziert. Sie sollten nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie A-L-L-L-L-U-F PRO zur einfachen Speichelentnahme für die Massenspektrometrie verwenden können.Eine bessere Analyse ist sehr wichtig, um Speichel unter konsistenten Bedingungen zu sammeln und einfach zu handhaben. Einmal beherrscht, glaube ich, dass diese Technik innerhalb von drei Stunden ordnungsgemäß durchgeführt werden kann. Dieser Ansatz mit einem lutscherähnlichen Ultrafiltrationsprobengeber in Kombination mit direkter nano-LC-MS/MS-Spektrenkettenanalyse erleichtert klinische Anwendungen für Biomarker bei der Diagnose menschlicher Krankheiten.

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Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal

Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie

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