Name: Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus Legionellen-Infizierten Phagozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Lernen Sie die Reinigung intakter Legionella-Vakuolen aus infizierten Phagozyten mittels Homogenisierung, immuno-magnetischer Trennung und Dichtegradienten-Zentrifugation. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zu Wirt-Pathogen-Interaktionen.

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Forschung in unserem Labor wurde von der Max von Pettenkofer-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität München, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HALLO 1511/3-1) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Medical Infektion Genomics&quot;-Initiative unterstützt ( 0315834C).

1. Die Vorbereitungen für LCV Isolation <ol><li> Streak aus Legionella pneumophila Herstellung DsRed-Express 13,14 Aktien aus Glycerin auf CYE-Agar-Platten mit 5 ug / ml Chloramphenicol (Cam) vier Tage vor LCV Isolation. Inkubieren der Bakterien bei 37 ° C </li><li> Seed aus 1 x 10 7 D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin oder RAW264.7 murinen Makrophagen in 75 cm 2 Zellkulturflaschen einen Tag vor Infektion. Verwenden Sie 10 ml HL5 Medium mit 20 ug / mL G418 für D. discoideum und inkubieren Sie die Amöben bei 23 ° C. Für RAW264.7 Makrophagen verwendet 10 ml RPMI 1640 Medium mit 10% FCS (hitze-inaktiviert) und 1% Glutamin, und wachsen die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. Verwenden Sie mindestens drei 75 cm 2 Flaschen pro Probe und Infektion (mindestens 6 x 10 7 Zellen). </li><li> Impfen eine Übernacht-Kultur mit L. pneumophila aus dem CYE Platte. Werfen Sie einen 15-ml-Reagenzglas mit 3 ml Medium AYEund 5 pg / ml Cam. Impfen mit 100 ul einer Bakteriensuspension eine OD 600nm von 0,1 ergeben. Inkubieren der Kultur über Nacht auf einem Overhead-Rotationsrad bei 37 ° C für 21-22 Stunden. </li></ol> 2. LCV Isolation <ol><li> Ändern Sie das Medium der D. discoideum Zellen zu entfernen, die Antibiotika, die mit der nach der Infektion beeinträchtigen würde. </li><li> Messen Sie die OD der Übernacht-Kultur. Bakterien sollten ihren Höhepunkt Infektiosität bei einer OD 600nm von ≥ 3, die 2 x 10 9 Bakterien / ml entspricht erreicht. </li><li> Infizieren die Zellen durch Zugabe von ca. 500 ul des L. pneumophila-Nacht-Kultur zu den wachsenden Zellen in 10 ml Medium HL5 (D. discoideum) oder 10 ml RPMI 1640 (Makrophagen). Dies entspricht einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 50. Anschließend wird die Infektion durch Zentrifugation der Bakterien auf die Zellen bei 500 × g für 10 min synchronisiert. Die Zentrifugation wird gefolgtgefolgt von einer Inkubation des D. discoideum Zellen bei 25 ° C und die RAW264.7 Makrophagen bei 37 ° C und 5% CO 2 sind. Die Infektion der Zeit von 1 Stunde beinhaltet die Zentrifugationsschritt. </li><li> Nach der Infektion entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal an extrazelluläre Bakterien zu entfernen. Verwenden Sie eiskalten Zauberin Puffer für D. discoideum und eiskaltem PBS für RAW264.7 Makrophagen. In 3 ml HS-Puffer mit Protease-Inhibitoren (Roche) ergänzt zu jedem Kolben und sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Pool die entsprechenden Proben in einem 15 ml Teströhrchen. </li><li> Zur Homogenisierung der Probe Gebrauch 3 ml Kunststoff-Luer-Lock-Spritzen und die Kugel aus Edelstahl Homogenisator. Stellen Sie sicher, dass Sie auf dem Eis zu arbeiten. Bevor Sie beginnen, waschen Sie den Ball Homogenisator mit destilliertem Wasser, um jede Verunreinigung zu vermeiden Waschmittel und spülen Sie es mit eiskaltem Puffer HS loszuwerden Luftblasen. Verwenden Sie das 8-Clearance um Kugel. </li><li> Füllen Sie die ersten 3 ml in die Spritze auf und montieren Sie ihn auf the Homogenisator. Drücken Sie auf die Probe hin und her, neun Mal durch den Homogenisator. Tauschen Sie die Spritzen danach um eine Kontamination mit nicht-homogenisierte Material zu vermeiden. Sammeln und bündeln die homogenisierte Probe in einem 15 ml Reagenzglas und werfen Sie einen 150 ul Probe für die mikroskopische Analyse. Bevor Sie mit einer anderen Probe zerlegen und waschen den Ball Homogenisator. </li><li> Sperren des Homogenats mit 2% FCS CS oder für 30 min auf einem Schüttler auf Eis oder auf einem Overhead-Spinnrad (10-20 min) bei 4 ° C </li><li> Nach der Blockierung verwenden Sie einen affinitätsgereinigten primären Antikörper gegen SidC (Verdünnung 1:3000) oder gegen jeden anderen bakteriellen Marker ausschließlich die Bindung an die LCV-Membran. Vortex der Antikörper-Lösung, bevor Sie es zum Homogenat. Inkubieren Sie die Probe für 1 Stunde auf einem Schüttler auf Eis oder auf einem Overhead-Spinnrad (10-20 min) bei 4 ° C </li><li> In der Zwischenzeit bereiten die Histodenz Gradienten. Verwenden Sie eine 15-ml-Reagenzglas pro Steigung und drei 75 cm 2-Kolben von einer Probe. TanneSt, 5,75 ml 35% Histodenz an das Rohr, und zweitens, vorsichtig 5,75 ml 10% Histodenz Lösung an der Spitze. Danach legen Sie es vorsichtig nach unten die Rohre horizontal für 1 Stunde. </li><li> Nach der Inkubation des Homogenats mit dem Blockierungsreagenz und dem primären Antikörper, Zentrifuge bei 600 × g für 15 min bei 4 ° C bis Pellet die Probe. Überstand verwerfen und das Pellet in 1,5 ml HS-Puffer. Übertragen Sie die Proben in ein frisches 15 ml Reagenzglas und werfen Sie einen 40 ul Probe für die mikroskopische Analyse später auf. </li><li> Inkubieren Sie die Pellets mit dem sekundären Antikörper - MACS Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Mikro-Perlen (Verdünnung 1:25) - für 30 min auf einem Schüttler bei 4 ° C In der Zwischenzeit setzen die Spalten auf der MACS-Magnethalter und äquilibrieren sie mit 0,5 ml HS-Puffer. </li><li> Anschließend gelten die Proben auf die Säule. Sammeln Sie 150 ul des Flow-Through für die anschließende mikroskopische Analyse. Die Säule wird dreimal mit 0,5 ml HS-Puffer. </li><li> Entfernen Sie die Spalten aus ter Magnet und Eluat die leichte Nutzfahrzeuge mit 0,5 ml HS-Puffer durch unmittelbare spritzen. Werfen Sie einen 20 ul Probe für die mikroskopische Analyse. Der Reinigungsschritt mittels Immuno-magnetische Trennung wird erwartet, dass pro 1 × 10 7 zu ergeben infiziert D. discoideum Zellen etwa 1 × 10 6 intakte leichte Nutzfahrzeuge, die etwa das Siebenfache werden im Eluat gegenüber dem Durchfluss-13 angereichert. </li><li> Setzen Sie die Histodenz Gradienten Rohre zurück in eine vertikale Position und laden Sie das Eluat vorsichtig an der Spitze. Zentrifugieren bei 3350 × g für 1 Stunde bei 4 ° C </li><li> Nach der Zentrifugation nehmen 1,5 ml Fraktionen von unten beginnend von dem Reagenzglas mit Hilfe eines langen Pasteurpipette aus Glas. Insgesamt acht Fraktionen zu sammeln, die jeweils von der Unterseite des Rohres. Keine sichtbaren Schichten werden in der kontinuierlichen Histodenz Gefälle beobachtet. Die höchste Ausbeute von leichten Nutzfahrzeugen wird typischerweise in der Fraktion 4 in einem Verhältnis von ~ 2 × 10 5 erwarten intakte leichte Nutzfahrzeuge pro 1 x 10 7betroffen Amöben 13. Kleinere Mengen von leichten Nutzfahrzeugen sind auch in den Fraktionen 3 und 5 vorhanden ist, beziehungsweise. Somit ist die Gesamtausbeute des gereinigten leichten Nutzfahrzeugen ~ 1 × 10 6 intakte leichte Nutzfahrzeuge pro 6 × 10 7 infiziert D. discoideum Zellen 13. Die Rückgewinnung von leichten Nutzfahrzeugen kann bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden, und die leichten Nutzfahrzeugen angezeigt mehrere Stunden lang stabil. </li></ol> 3. Mikroskopische Analysen der gesammelten Proben <ol><li> Bereiten Sie eine 24-Loch-Flachboden-Gewebekulturplatten mit Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser. </li><li> Pipettieren Sie jede Probe während des LCV Reinigung plus 150 ul jeder Dichtegradienten Fraktion in die 24-Well-Platte aufgenommen. Fügen Sie 0,5 ml HS-Puffer in jede Vertiefung, um die hohe Histodenz Konzentration zu verdünnen. Anschließend zentrifugieren Sie die Platte bei 600 × g für 10 min bei 4 ° C Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fixieren Sie die Proben mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT. Nach der Fixierung waschen die Proben zweimal. Unse Zauberin für D. discoideum und PBS für RAW264.7 Makrophagen. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montieren Sie die Proben von GFP-Expression Calnexin D. discoideum, auf verschiedenen Stufen während LCV Isolation, direkt auf Glas-Folien mit zB Vectashield genommen. </li><li> Inkubieren der Proben von RAW264.7 Makrophagen, auf verschiedenen Stufen während der Transporter genommen, mit Blocking-Lösung (1% BSA in PBS) für 10 min bei RT. Verwenden Sie ein Anti-SidC primären Antikörpers an das leichte Nutzfahrzeuge Fleck und inkubieren für 1h in einer feuchten Kammer bei RT (affinitätsgereinigt Kaninchen-Anti-SidC; 1:1000 in Blocking-Puffer). Anschließend waschen Sie die Proben dreimal mit PBS. Inkubation mit einem sekundären Antikörper (zB Anti-Kaninchen-Cy5; 1:200 in Blocking-Lösung) für 30 min in einer feuchten und dunklen Kammer bei RT. Schließlich, waschen Sie die Proben dreimal mit PBS und montieren sie auf Glas-Folien mit zB Vectashield. </li></ol></li><li> Morphologie, Integrität und die Menge der leichten Nutzfahrzeugen von GFP-Expression isoliert Calnexin D. discoideum oder RAW264.7 Makrophagen werden durch ein Fluoreszenzmikroskop mit den angemessenen Filtern ausgestattet analysiert. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Qualität und die Ausbeute an dem LCV Reinigung durch Immunaffinitätschromatographie Trennung und Dichtegradientenzentrifugation kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie (Abb. 1) befolgt werden. Eine Übersicht der Proben während des LCV isoliert von D. gesammelt discoideu m oder Makrophagen gezeigt (Abb. 2). Das Homogenat von L. pneumophila-infizierten Fresszellen zeigt intakte leichte Nutzfahrzeuge, sondern auch eine Menge von Zelltrümmern und extrazellulären Bakterien. Nach dem Pelletieren der Probe, ist das Bild ähnlich dem Homogenat, manchmal ein wenig dichter. Da intakte leichte Nutzfahrzeuge auf die Säule haften bleiben sollte, enthält die Durchströmung meist extrazellulären Bakterien und Zelltrümmer. Nach der Elution der Probe aus der Säule enthält das Eluat intakte leichte Nutzfahrzeuge in großen Mengen. In unseren Händen, das LCV purificati<html> auf scheint wirksamer D. discoideum als für Makrophagen. In D. discoideum die Erreger Vakuolen erscheinen runder und die Ausbeute an isoliertem leichten Nutzfahrzeugen um mehr als 10 mal höher im Vergleich zu Makrophagen (Abb. 3). In intakten Makrophagen LVCs mit verschiedenen Antikörpern gefärbt erscheinen auch mehr unregelmäßig geformt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der LCV Isolation. A) Isolierung von leichten Nutzfahrzeugen durch Immuno-magnetische Trennung mit Hilfe eines affinitätsgereinigten Antikörper gegen das bakterielle Protein-Effektor SidC, lokalisieren sich ausschließlich auf die LCV-Membran. Eine sekundäre MACS Mikro bead-gekoppelter Antikörper und einen Magneten verwendet, um leichten Nutzfahrzeugen von Zelltrümmern zu isolieren. B) Nach Immuno-magnetische Trennung leichten Nutzfahrzeugen werden durch Histodenz Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Leichte Nutzfahrzeuge werden in Fraktion 4 angereichert. upload/4118/4118fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Proben, die während LCV Reinigung gesammelt. Bilder aus Homogenat, Pellet-, Durchfluss-und Eluat aus D. discoideum oder Makrophagen dargestellt sind. Die Proben zeigen, L. pneumophila Herstellung DsRed-Express (rot) in D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin-Signal (grün, oben) oder in Makrophagen mit einem Anti-SidC Antikörper (Cyan, unteres Bild) gefärbt. Bars, 10 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig3.jpg" /> Abbildung 3. Gereinigtes leichte Nutzfahrzeuge aus D. discoideum oder Makrophagen. Die Proben zeigen Fraktion 4 nach Histodenz Dichtegradientenzentrifugation von L. pneumophila Herstellung DsRed-Express (rot) in (a) D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin (grün) oder (B) in Makrophagen mit einem Anti-Antikörper SidC (Cyan) gefärbt. Bars, 10 um.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Verfahren wird dieses Protokoll auf zwei Schritten, zuerst die Trennung von leichten Nutzfahrzeugen mit einem Immuno-magnetische Ansatz und zweiten, die Reinigung von leichten Nutzfahrzeugen durch Dichtegradientenzentrifugation bezogen. Die LCV Trennung kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie, wenn entweder fluoreszenzmarkierten Bakterien und GFP-produzierenden Zellen oder Antikörper-Färbung verwendet wird, gefolgt werden. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, unkomplizier...

die reinigung von pathogen vakuolen aus<em&gt; legionellen</em&gt;-infizierten phagozyten

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Die opportunistischen Erreger Legionella pneumophila ist eine Amöbe-resistentes Bakterium, das auch den Wiederholungen in Alveolarmakrophagen wodurch die schweren Lungenentzündung &quot;Legionärskrankheit&quot; ein. In Protozoen-und Säugetier-Phagozyten, L. pneumophila beschäftigt konservierten Mechanismus, um eine bestimmte, Replikations-permissive Fach, die &quot;Legionellen-enthaltenden Vakuolen&quot; (LCV) zu bilden. LCV Bildung erfordert die bakterielle Icm / Dot-Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), was so viel wie 275 &quot;Effektor&quot; transloziert Proteine ​​in Wirtszellen. Die Effektoren manipulieren Host-Proteinen sowie Lipide und kommunizieren mit sekretorischen, endosomalen Organellen und Mitochondrien-04.02. Die Bildung von leichten Nutzfahrzeugen stellt eine komplexe, robuste und redundante Prozess, der nur schwer in einer reduktionistischen Weise zu erfassen ist. Ein integrativer Ansatz ist erforderlich, um umfassend zu verstehen LCV Bildung, einschließlich einer globalen Analyse Wegogen-Host-Faktor-Wechselwirkungen und ihre zeitliche und räumliche Dynamik. Als ein erster Schritt zu diesem Ziel werden intakte leichte Nutzfahrzeuge gereinigt und analysiert durch Proteomik und Lipidomik. Die Zusammensetzung und die Bildung von Erreger-enthaltenden Vakuolen durch Proteom-Analyse durch Flüssigkeitschromatographie oder 2-D Gelelektrophorese gekoppelt Massenspektrometrie untersucht. Vakuolen entweder von der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum Boden oder Säugetier-Phagozyten isoliert hegte Leishmania 5, Listeria 6, 7 Mycobacterium, Rhodococcus 8, 9 oder Salmonella Legionella spp. 10. Allerdings sind die Aufreinigungsprotokolle in diesen Studien beschäftigt zeitraubend und langweilig, wie sie z. B. Elektronenmikroskopie zu LCV Morphologie, Integrität und Reinheit zu analysieren erfordern. Darüber hinaus müssen diese Protokolle nicht ausnutzen Besonderheiten des Erregers Vakuole für dereicherung. Die hier vorgestellte Methode überwindet diese Einschränkungen durch den Einsatz von D. discoideum Herstellung eines fluoreszierenden Marker und LCV durch Targeting des bakteriellen Effektorprotein SidC, die selektiv Anker auf die LCV Membran durch Bindung an Phosphatidylinositol-4-phosphat (PtdIns (4) P) 3,11. LCV in einem ersten Schritt mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines affinitätsgereinigten primären Antikörper gegen SidC und einen sekundären Antikörper an magnetische Beads gekoppelt ist, in einem zweiten Schritt durch eine klassische Histodenz Dichtegradientenzentrifugation 12,13 (Abb. 1), gefolgt angereichert . Ein Proteom-Studie von isolierten leichte Nutzfahrzeuge aus D. discoideum ergab mehr als 560 Wirtszellproteinen, einschließlich Proteine ​​mit phagozytischen Vesikel, Mitochondrien, ER und Golgi, sowie mehrere GTPasen, die nicht in LCV Bildung wurden vor dem 13. beteiligt zugeordnet. LCV angereichert und gereinigt mit derProtokoll hier skizzierten kann durch Mikroskopie (Immunfluoreszenz, Elektronenmikroskopie), biochemischen Methoden (Western Blot) und Proteomik oder der Lipid Ansätze analysiert werden.

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von intakten<em&gt; Legionellen</em&gt;-Haltigen Vakuolen (leichte Nutzfahrzeuge) von Amöben und Makrophagen. Das Zwei-Schritt-Protokoll umfasst LCV Anreicherung mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein bakterielles LCV-Marker und weitere Reinigung durch Dichtegradientenzentrifugation.

Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

Der opportunistische Erreger Legionella pneumophila ist ein amöbenresistentes Bakterium, das sich auch in alveolären Makrophagen repliziert und dadurch die schwere ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, intakte, Legionellen enthaltende VAEs oder LCDs aus infizierten Phagozyten zu isolieren. Dies wird erreicht, indem die infizierten Phagozyten zunächst mit einem Homogenisator aus rostfreiem Stahl homogenisiert werden. Im zweiten Schritt wird das Homogenat mit einem primären Antikörper inkubiert, der spezifisch ein bakterielles Effektorprotein targetiert, das in der LCV-Membran lokalisiert ist, gefolgt von einer Inkubation mit einem sekundären Antikörper, der an magnetische Kügelchen gekoppelt ist.Anschließend werden die mit Antikörpern beladenen lc vs. durch ein Magnetfeld zurückgehalten und anschließend gewaschen und eluiert. Abschließend können die magnetisch angereicherten LCDs durch Dichtegradientenzentrifugation weitergereinigt werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass kompartimentenspezifische molekulare Eigenschaften der infizierten Parasiten genutzt werden können, um intakte pathogene Bakterien zu reinigen. Vier Tage vor der LCV-Isolierung werden DS-red-expressierende Legionella pneumophila aus Glycerin-Stämmen auf Kohle-Hefe-Extrakt-Agar-Platten mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol ausgestrichen. Die Bakterien werden einen Tag vor der Infektion bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von Chloramphenicol kultiviert. CDA 1 × 10⁷ Calnexin-GFP-exprimierende Dictyostelium discoideum werden in 75 cm² Zellkultur-Flaschen angezüchtet und die Amöben werden einen Tag vor dem Experiment in 10 Milliliter HL-5-Medium mit G418 bei 23 Grad Celsius inkubiert. Anschließend wird ein 15-Milliliter-Reagenzglas, das drei Milliliter YE-Medium und fünf Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol enthält, mit etwa 100 Millilitern einer L. pneumophila-Suspension beimpft.Um eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,1 zu erhalten, inkubieren Sie die Übernachtkultur vor Beginn der Isolierung 21 bis 22 Stunden lang auf einem Rotationsgerät bei 37 Grad Celsius. Wechseln Sie zunächst das Medium der Dedis-Qadium-Zellen, um das Antibiotikum zu entfernen. Messen Sie nun die optische Dichte der 1:10 verdünnten Übernachtkultur von L. pneumophila, die etwa 0,3 betragen sollte.Überführen Sie anschließend etwa 500 Mikroliter der L. pneumophila-Suspension in jeden Kolben zur Infektion der dsco-Dium-Zellen. Synchronisieren Sie die Infektion, indem Sie die Bakterien durch Zentrifugation 10 Minuten bei 500 × g und 25 °C auf die Zellen aufbringen, gefolgt von einer Stunde Inkubation der dqu-Dium-Zellen bei 25 °C. Nach der Infektion.Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Amöben einmal mit eiskaltem Quelle-C-Puffer. Um eventuelle extrazelluläre Bakterien zu entfernen, geben Sie drei Milliliter HS-Puffer, der mit Proteaseinhibitoren angereichert ist, zu jedem Kolben hinzu und sammeln Sie die Zellen anschließend mit einem Zellkratzer. Die Homogenisierung der infizierten Zellen ist der schwierigste Teil des Verfahrens.Der Erfolg hängt von einem äußerst sauberen Homogenisator mit Stahlkugel, der korrekten Ausschlussgröße der Stahlkugel, einer ungeraden Anzahl an Hubbewegungen und der aufgebrachten Druckmenge ab. Nachdem die entsprechenden Proben in einem 15-Milliliter-Reagenzglas vereinigt wurden, spülen Sie einen Stahlkugel-Homogenisator mit einem Acht-Mikrometer-Spiel mit destilliertem Wasser und spülen anschließend den Homogenisator mit eiskaltem hs-Puffer durch. Füllen Sie nun eine dreimilliliterige Kunststoff-LOR-Verschluss-Spritze mit dem ersten dreimilliliter-Aliquot der Zelllösung und setzen Sie die Spritze auf den Homogenisator auf.Drücken Sie die Probe neunmal hin und her durch den Homogenisator und sammeln Sie die homogenisierte Probe in einem neuen 15-Milliliter-Reagenzglas. Entsorgen Sie die verwendete Spritze und montieren Sie eine neue. Nachdem die gesamte homogenisierte Probe vereinigt wurde, überführen Sie 150 Mikroliter Eloqua in ein Einor-Gefäß für die spätere Analyse.Anschießend das Homogenat mit 2 % Kälberserum für 30 Minuten auf Eis unter Schütteln blockieren. Nach dem Blockieren kurz vortexen, einen Primärantikörper gegen einen bakteriellen Marker hinzufügen, der ausschließlich an die LCV-Membran bindet, und die Probe dann eine Stunde lang unter Schütteln auf Eis mit dem Antikörper inkubieren. In der Zwischenzeit 5,75 Milliliter einer 35 %igen Histo-Den-Lösung in ein frisches kegelförmiges 15-Milliliter-Gefäß geben.Überlagern Sie vorsichtig 5,75 Milliliter einer 10 %igen Histo-Den-Lösung und legen Sie die Röhrchen anschließend eine Stunde lang horizontal bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie nun das blockierte und mit Antikörper behandelte Homogenat 15 Minuten bei 600 × g und vier Grad Celsius. Nach dem Absaugen des Überstandes wird das Pellet in 1,5 Milliliter HS-Puffer resuspendiert und anschließend in ein neues 15-Milliliter-Teströhrchen überführt.Als Nächstes den Sekundärantikörper vortexen und anschließend das Homogenat mit dem Sekundärantikörper inkubieren, danach die Probe auf Eis in einem Schüttler für 30 Minuten stellen. In der Zwischenzeit die geeignete Säule auf den Max-Magnet-Halter setzen und die Säule mit einem halben Milliliter HS-Puffer äquilibrieren. Nach 30 Minuten die Probe auf die Säule auftragen und die Säule dreimal mit HS-Puffer waschen.Entfernen Sie dann die Säule vom Magneten und eluieren Sie die LC im Vergleich zu mit 0,5 Milliliter HS-Puffer durch sofortiges Aufbringen.Drehen Sie die Histo-Dens-Gradientenröhrchen nun langsam wieder in die vertikale Position und geben Sie vorsichtig das Eluat darauf auf. Zentrifugieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei 3.350 × g und 4 °C. Sammeln Sie abschließend mit einer langen Glas-Pasteurpipette acht Fraktionen zu je 1,5 mL vom Boden jedes 15-mL-Röhrchens und füllen Sie die Aliquote in Eppendorf-Röhrchen.Überführen Sie 150 Mikroliter jeder kontinuierlichen Dichtegradientenfraktion in EPI DPH-Röhrchen für die spätere Analyse. Beginnen Sie damit, mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser in jede Vertiefung einer 24-Loch-Flachboden-Zellkulturplatte zu geben. Pipettieren Sie die während der LCV-Isolierung beiseitegestellten Proben in die Vertiefungen und geben Sie 0,5 Milliliter HS-Puffer hinzu, um die hohe Histo-Ends-Konzentration zu verdünnen, und zentrifugieren Sie.Die 24-Lochplatte 10 Minuten bei 600 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Das Überstandsvolumen vorsichtig entfernen und die Proben anschließend mit 4 % Formaldehyd 20 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Nach der Fixierung die Proben zweimal mit PBS waschen und danach mit einem geeigneten Eindeckmedium auf Objektträger aufbringen. Abschließend die Proben mit einem fluoreszenzmikroskopischen Gerät, das mit den geeigneten Filtern ausgestattet ist, analysieren.Diese erste Abbildung zeigt eine repräsentative Übersicht über Proben, die während der LCV-Isolierung aus dsco, Darm oder Makrophagen unterschiedlichen Alters gesammelt wurden. Das Homogenat von mit L. pneumophila infizierten Phagozyten enthält intakte LCVs, aber auch nach dem Zentrifugieren eine Menge an zellulärem Fragmentationsmaterial und extrazellulären Bakterien.Die Zellsuspension. Der Inhalt der Reservenprobe ähnelt dem des Homogenats, ist jedoch manchmal etwas dichter, wie hier zu sehen. Der Durchfluss durch die magnetische Säule enthält hauptsächlich extrazelluläre Bakterien und Zelltrümmer, da intakte lc vs.Sollte an der Säule haften, nachdem die Probe von der Säule eluiert wurde. Das Eluat enthält große Mengen intakter lc im Vergleich zu nach der histodichten Dichtezentrifugation.Die LCV-Reinigung scheint bei Dsco Dium wirksamer zu sein als bei Makrophagen mit Dsco Dium. Die pathogenen VAEs erscheinen runder, und die Ausbeute an isolierten LCVs ist mehr als zehnmal höher im Vergleich zu Makrophagen in intakten Makrophagen LC vs. Nach Färbung mit verschiedenen Antikörpern erscheinen sie außerdem unregelmäßiger, gefolgt von Risikoverfahren.Andere Methoden wie die Proteomik oder die Immunfluoreszenzmikroskopie können durchgeführt werden, um die Wirtszell- und Bakterienbestandteile von sexuell übertragbaren Krankheiten (STDs) detailliert zu charakterisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolierung und Analyse ihres entzündungsfördernden Potenzials auf Makrophagen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Vorbehandlung von Makrophagen mit Legionella pneumophila Vesikeln der äußeren Membran (OMVs), um deren Wirkung auf die bakterielle Replikation zu untersuchen. Durch die Veränderung der Immunsignalisierung des Wirts machen OMVs Makrophagen durchlässiger für Infektionen. Höhere Koloniezahlen in...

Assay der Legionella pneumophila-Replikation in Makrophagen, die mit äußeren Membranvesikeln vorbehandelt wurden

Quelle: Jung, A. L. et al. Legionella pneumophila äußere Membranvesikel: Isolierung und Analyse ihres proinflammatorisken Potenzials bei Makrophagen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert die Isolierung von äußeren Membranvesikeln (OMVs) aus Legionella pneumophila mittels sequentieller Zentrifugation, steriler Filtration und Ultrazentrifugation. Die gereinigten OMVs, angereichert mit Membranproteinen und Lipopolysacchariden, eignen sich für Studien zur Wirts-Pathogen-Interaktion.

Ultrazentrifugationsbasierte Isolierung von Legionella-pneumophila-Außenmembranvesikeln

Quelle: Sigal, N., et al. RNA-Reinigung aus intrazellulär gezüchteten Listeria monocytogenes in Makrophagenzellen.  J. Vis. Exp. (2016).Dieses Video demonstriert die Isolierung internalisierter pathogener Bakterien aus infizierten Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs). Bakterien dürfen sich an Wirtszellen anheften, und ungebundene Bakterien werden weggespült. Nach der Internalisierung wird ein Antibiotikum hinzugefügt, um nicht internalisierte Bakterien zu beseitigen. Die Wirtszellen...

Isolierung intrazellulärer pathogener Bakterien aus infizierten Wirtszellen

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Die Larve der Wachsmotte Galleria mellon wurde vor kurzem als ein in vivo Modell, um Legionella pneumophila-Infektion zu studieren etabliert. Hier zeigen wir grundlegende Techniken, die Pathogenese von Legionellen in den Larven charakterisieren, einschließlich Impfung, Messung der bakteriellen Virulenz und Replikation sowie die Extraktion und Analyse von infizierten Blutzellen.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Wir beschreiben die Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium in Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen mittels differentieller Digitonin-Permeabilisierung.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Hier beschreiben wir die Reinigung von Legionella pneumophila (L. pneumophila) , äußere Membranvesikel (OMVs) aus Flüssigkulturen. Diese gereinigten Vesikel werden dann für die Behandlung von Makrophagen verwendet, ihre pro-inflammatorischen Potentials zu analysieren.

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.

Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems

Lernen Sie die Reinigung intakter Legionella-Vakuolen aus infizierten Phagozyten mittels Homogenisierung, immuno-magnetischer Trennung und Dichtegradienten-Zentrifugation. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zu Wirt-Pathogen-Interaktionen.

Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus

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