Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

Nehmen Sie sich drei Stunden Zeit, um dieses Protokoll durchzuführen. Sobald Sie Erfahrung haben, sollte dieses Protokoll je nach Anzahl der präparierten Embryonen zwischen eineinhalb und zwei Stunden dauern. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein 9,5 Tage nach dem Cort-Embryo-Schnitt am mittleren otischen Plaque-Code und som möglicherweise vier entnommen wird, um Gewebe zu isolieren, das das vagale Neuralrohr enthält. Schneiden.

Dabei isolieren Milben 16 und 22 Gewebe, das das Neuralrohr des Rumpfes enthält. Die vagale Neuralleiste wandert aus dem vagalen Neuralrohr. Während die Neuralleiste des Rumpfes aus dem Neuralrohr des Stammes migriert, wird das präparierte Gewebe enzymatisch in einer Lösung aus Kollagenase dys verdaut, im Weltraum gewaschen und das nicht-neurale Epiderm und Mesoderm werden wegpräpariert.

Das isolierte Neuralrohr wird noch zweimal gewaschen und dann mit selbsterneuerndem Medium überzogen. Ich bin Elise Graph vom Bosky Laboratory an der Vanderbilt University. Heute zeige ich, wie man die Neuralleiste vom Neuralrohr in der Explankultur isoliert

Mit dieser Technik können Sie die Eigenschaften der Neuralleiste in vitro untersuchen. Fangen wir an. Beginnen Sie mit der Verdünnung von 100 Mikrolitern eines mg pro Mil Fibronektin in 3,2 Milliliter sterilem DPBS.

Geben Sie so viel von der 30 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektinlösung, dass der Boden jeder Vertiefung einer Vier-Well-Platte bedeckt ist. Klopfen Sie vorsichtig auf die Ecken der Platte mit vier Vertiefungen, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung gleichmäßig bedeckt ist. Lassen Sie die Platte beiseite liegen, während Sie Ihre Medien erstellen und filtern.

Der Teller sollte mindestens 15 Minuten ruhen. Sammeln Sie die folgenden Reagenzien: Um Ihre Medien vorzubereiten. Die Medien werden in einer Biosicherheitswerkbank frisch aufbereitet, bevor sie verwendet werden.

Achten Sie darauf, immer eine sterile Technik zu verwenden. Nimm das Faser-Nin aus der Vier-Well-Schale und lasse es trocknen, während du den Deckel auf der Rückseite der Haube abnimmst. Es dauert etwa 15 Minuten, bis die Faser nin getrocknet ist.

Sobald die Platte trocken ist, fügen Sie jeweils 500 Mikroliter selbsterneuerndes Medium hinzu. Platzieren Sie die Platte von 37 Grad in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator unmittelbar vor Beginn der Dissektion, mischen Sie 50 Mikroliter Kollagenase-Scheibenraum in fünf Milliliter DPBS. Achten Sie darauf, alle Kollagenase-Dispa hinzuzufügen, um eine effiziente Verdauung zu gewährleisten.

Verwenden Sie einen 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter, um die Kollagenase-Dispa-Lösung in drei Vertiefungen einer 12-Well-Platte zu filtrieren. Jede Vertiefung sollte ein Drittel der Fünf-Milliliter-Lösung aufnehmen. Pipettieren Sie etwa einen Milliliter Waschmedium in jede der verbleibenden Vertiefungen. Legen Sie die Platte auf Eis, bis Sie bereit sind, Ihr isoliertes Gewebe zu verdauen.

Schneiden Sie anschließend mit einer sterilen Rasierklinge die Spitze einer Pipettenspitze P 20 knapp unterhalb der abgeschrägten Kante ab. Tauchen Sie die Spitze in Waschmedium, um Embryonen und isolierte Gewebestücke zu entfernen. Kleben Sie nicht an den Spitzen, während Sie zwischen den Lösungen übertragen werden.

Machen Sie dasselbe mit der Spitze eines P 1000 aus einer zeitgesteuerten Paarung. Entferne die Gebärmutter vom Muttertier. Schließen Sie die Dissektion in sterilem DPBS ab.

Sterilisieren Sie Ihre Sezierwerkzeuge mit einer beliebigen Methode, wie z. B. der Hitzesterilisation. Wenn das DPBS trüb wird, wird der Embryo mit dem Cutoff P 1000 in eine frische Schale mit sterilem DPBS gebracht, beginnend am geschnittenen Gewebe. Tosper das Gebärmuttergewebe vorsichtig von der Dezidua weg.

Entfernen Sie dann vorsichtig den Embryo aus dem Decidua. Die Position des Embryos ist hier mit einer Karikatur gekennzeichnet. Entfernen Sie nach der Isolierung eines 9,5 Tage post-coum-Embryos vorsichtig den Dottersack mit Insulinnadeln.

Wenn die Genotypisierung ein notwendiger Teil Ihres Protokolls ist, waschen Sie den Dottersack und das verbleibende embryonale Gewebe in sauberem, sterilem DPBS. Legen Sie das Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie das Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius, bis Sie bereit sind, DNA zu isolieren. Orientieren Sie sich an der Anatomie des Embryos.

Sie schneiden in der Mitte des OTIC-PLA-Codes in SOMITES vier, 16 und 22. Sie müssen den Fokus Ihres Mikroskops einstellen, um die Somiten zu zählen. Machen Sie den ersten Schnitt in der Mitte des Otic PLA-Codes.

Verwenden Sie die Nadeln wie die Klingen einer Schere, ohne den Rest des Neuralrohrs zu beschädigen. Mache den zweiten Schnitt nach der vierten Milbe. Als nächstes schneidest du auf die Milbe 15 und schneidest sofort danach.

Machen Sie den letzten Schnitt Nach so milbe 22 oder der letzten, so milbe. Wenn der Embryo in seiner Entwicklung früher ist. Dieses Gewebe enthält das Neuralrohr des Rumpfes, um das Gewebe zu isolieren, das das vagale Neuralrohr enthält.

Schneiden Sie das Herz aus dem Gewebe zwischen dem mittleren Plateau und der vierten Milbe ab. Beachten Sie den Größenunterschied zwischen den isolierten Gewebestücken. Das Stück, das das vagale Neuralrohr enthält, ist breiter als das andere.

Diese physikalische Unterscheidung ermöglicht es Ihnen, die beiden Teile zusammen zu verarbeiten. Verwenden Sie den Cutoff P 20, um das Neuralrohr in den Kollagenase-Dis space zu übertragen. Das verbleibende Gewebe kann für die Genotypisierung aufbewahrt werden.

Wie bereits erwähnt, legen Sie die isolierten Gewebestücke in eine der Vertiefungen mit Kollagenase dis space. Jetzt bei Zimmertemperatur. Lassen Sie es 10 Minuten einwirken.

Während der 10-minütigen Inkubation können Sie mit der Präparierung des nächsten Embryos beginnen. Entfernen Sie nach 10 Minuten das isolierte Gewebe aus dem Kollagenase-Raum und waschen Sie es, indem Sie es in Waschmedium auf und ab pipettieren und das verdaute Gewebe in DPBS legen. So sollte das Gewebe nach der Verdauung aussehen.

Der nächste Schritt besteht darin, die nicht-neurale Derm und das Mesoderm zu entfernen. Zuerst wird die nicht-neurale Derm vom Neuralrohr weggehoben. Als nächstes kann das Mesoderm aus dem Neuralrohr entfernt werden.

Um die Entfernung von nicht-neuraler Derm und Mesoderm zu demonstrieren, konzentrieren wir uns auf das vagale Neuralrohr. Der gleiche Vorgang kann mit dem Neuralrohr des Rumpfes durchgeführt werden. Beginnen Sie damit, das nicht-neuronale Gewebe mit einer Nadel festzuhalten.

Verwenden Sie die andere, um die nicht-neurale Derm sanft zu entfernen. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die an das Neuralrohr angrenzenden Somiten, um die Überreste von nicht-neuralem Gewebe zu entfernen. Vorsichtig mit der abgeschnittenen Pipettenspitze P 20 iterieren.

Waschen Sie das Neuralrohr zweimal mit Waschmedium. Legen Sie das Neuralrohr in ein Selbsterneuerungsmedium und plättieren Sie es dann in eine vorbereitete Vier. Na Gericht.

Legen Sie die Vier-Well-Platte in eine Hypoxiekammer. Stellen Sie sicher, dass die Kammer versiegelt ist. Schließen Sie einen Sauerstoffanalysator an und schalten Sie die Mischgasquelle ein.

Verwenden Sie eine Mischung aus 1 % Sauerstoff, 6 % Kohlendioxid und 93 % Stickstoff. Laden Sie die Hypoxiekammer auf, bis sie bei 3 % Sauerstoff ist. Schalten Sie das Mischgas aus und stellen Sie die Hypoxiekammer auf 37 Grad Celsius auf.

24 Stunden später. Schauen Sie sich den Plan des Neuralrohrs an. Neuralleistenzellen sollten aus dem Neuralrohr gewandert sein, das mit der durchgezogenen Linie umrandet ist, um eine Kontamination mit Nicht-Neuralleistengewebe zu verhindern, das mit einer Insulinnadel um die Außenseite des Neuralrohrs geschnitten wurde.

Entfernen Sie als Nächstes das Neuralrohr aus dem Explan und alle verbleibenden Nicht-Neuralleistenzellen. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Selbsterneuerungsmedium und stellen Sie die Platten wieder in die Hypoxiekammer. Laden Sie es auf und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius.

Nach 24 Stunden in Kultur wandert die Neuralleiste vom Neuralrohr weg. Die Ausdehnung des Auswuchses wird mit einer gestrichelten Linie dargestellt. Dieser Neuralleistenauswuchs, der durch Pfeile hervorgehoben ist, ist zu etwa 96 % rein und die Zellen exprimieren P 75, SOX 10 und Fox D drei.

Experimente, die mit diesen kultivierten Kammzellen durchgeführt werden können, umfassen unter anderem die folgenden. Manchmal führen weniger ideale Kulturen in diesem Fall zu keinen effizienten Auswüchsen. Überprüfen Sie hypoxische Bedingungen, Fibronektinkonzentrationen und die Zeit, die das Gewebe in Kollagenase DYS Space verdaut wurde. Heute habe ich die Grundlagen der Kultivierung der Neuralleiste aus dem Neuralrohr demonstriert.

Viel Glück bei Ihren Experimenten.