Name: Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Kultivierung von Neuralleistenzellen aus embryonalen murinen Neuralrohr. Diese Methode liefert hochreine Zellpopulationen ohne FACS oder Fütterzellschichten für Entwicklungsbiologie.

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Wir möchten Marc Wozniak für Video-Hilfe anzuerkennen. Wir möchten auch Sean Morrison an der UT Southwestern anerkennen für das Original-Protokoll zur Kultivierung von Ratten-NC-Zellen. Diese Arbeit wurde Vanderbilt University Medical Center Academic Program-Support unterstützt und durch Zuschüsse der NIH (HD36720 und HD036720-11S109) und der AHA 11GRNT7690040 zu PAL, Chemiefonds Stipendien von der AHA (0615209B) und NIH (NS065604) zu NAM und ERP war unterstützt durch ein NIH Ausbildungsförderung T32HD007502.

1. Vorbereiten von Platten <ol><li> Verwenden steriler Technik zu jeder Zeit. </li><li> Planen Fibronektin (FN) durch Verdünnen von 100 ul Blutplasma FN Brühe in einem Endvolumen von 3,3 ml in Dulbeccos PBS (DPBS). Endkonzentration 30 ug / ml, und dies kann bei 4 ° C für 1 Woche aufbewahrt werden. </li><li> Titelbild Boden jeder Vertiefung einer sterilen Gewebekultur vier Well-Platte mit FN-Lösung und lassen Sie sich für 15 Minuten. Sicherstellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Machen Medien während dieser Zeit (die Schritte 2 und 3). </li><li> Entfernen Sie FN-Lösung und erlauben Platten zum Trocknen auf. Vorsichtig spülen Wells mit 500 ul DMEM, DMEM entfernen, und fügen Sie 500 ul der Selbsterneuerung (SR) Medium (siehe unten). Bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 Prozent CO 2. Füllen Sie dieses etwa eine Stunde vor ihrer Zerlegung, so dass die Platten werden vor Gebrauch trocknen. </li></ol> 2. Vorbereiten SR Medium <ol><li> Für die Kultur des Vagus und des Rumpfes NCaus zehn Embryonen (etwa ein Wurf, je nach genetischem Hintergrund der Mauslinie), bereiten Sie 25 ml Medium SR. Kombinieren 12,5 ml niedrige Glukose-DMEM, 7,5 ml Neurobasalmedium, 25 ul Retinsäure (117 uM Endkonzentration) und 25 ul 2-Mercaptoethanol (50 mM Endkonzentration). Gut mischen. </li><li> In 3,75 ml Hühnerembryo-Extrakt, 250 ul N 2 Salz Ergänzung, 500 ul B27 Ergänzung und 250 ul Penicillin-Streptomycin (1% Endkonzentration). Filtern Sie das Medium durch ein 0,22 um-Filter. </li><li> Fügen Sie 10 ul sterilem IGF1 (20 ug / ml Endkonzentration) und 20 ul sterilem bFGF (20 ug / ml Endkonzentration). Mischen durch Invertieren. Lagerung bei 4 ° C. </li></ol> 3. Vorbereiten Waschmedium <ol><li> Für etwa 10 Embryonen vorzubereiten 50 ml Waschmedium. Kombinieren Sie 50 mg BSA mit 35 ml niedrige Glukose-DMEM, 15 ml Neurobasalmedium, und 500 ul Penicillin-Streptomycin (1% Endkonzentration). Sterilfilter mit einem 0,22um-Filter. </li></ol> 4. Vorbereiten Kollagenase / Dispase <ol><li> Dann werden 50 ul 100 mg / ml Collagenase / Dispase bis 5 ml DPBS. Gut mischen. </li><li> Spritze mit Filter einen 0,2 um Filter und 1,5 mL in jedes der drei Vertiefungen einer zwölf Well-Platte. Pipette ca. 1 ml Wasch-mittel in den restlichen Brunnen. Bewahren gesamte Platte auf Eis, bis bereit, seziert Gewebe zu verdauen. </li><li> Schneiden Sie Tipps eines P20 und P1000 Pipettenfilter Spitze mit einer sterilen Rasierklinge. Kurz unterhalb der abgeschrägten Kante der Spitze. Die abgeschnittenen P1000 wird verwendet, um den ganzen Embryo zu übertragen, während die p20 wird verwendet, um Stücke von isoliertem Gewebe übertragen werden kann. </li></ol> 5. Isolating Vagale und Trunk Neuralrohrs aus 9,5 DPC Embryonen <ol><li> Für zeitgesteuerte Schwangerschaften, sind Dämme mit einer vaginalen Stecker 0,5 DPC mittags als der Morgen der Stecker wird beobachtet. Opfern und entfernen die Gebärmutter bei 9,5 DPC. </li><li> Entfernen Sie die Decidua von Gebärmutter und sanft rntfernen den Embryo aus der Decidua. Wenn mit diesem Protokoll erfahren, zu isolieren 3-4 9,5 dpc Embryonen zu einem Zeitpunkt in sterilem dPBS. Verwenden steriler Technik und sterilisiert Dissektionsinstrumente. Instrumente können durch Autoklavieren, Hitzesterilisation oder durch Inkubation in Ethanol sterilisiert werden. </li><li> Für Front-vagalen NC: mit Insulin Nadeln, schneiden Sie das Neuralrohr in der Mitte Ohrplakode. Schneiden Sie wieder an der hinteren Kante des 4. Somiten. Trim Gewebe ventral des Neuralrohrs, die Schlundbögen und Herz zu entfernen. </li><li> Für Stamm NC: mit Insulin Nadeln, entfernen Sie den Teil des Neuralrohrs zwischen Somiten 16-22 (oder der letzte Somiten, wenn Embryonen sind entwicklungsgeschichtlich älter als die 22 Somiten-Stadium). </li><li> Halten Sie den Dottersack und alle verbleibenden embryonalem Gewebe für die Genotypisierung. </li></ol> 6. Entfernung von nicht-neuronalen Ektoderm und Mesoderm <ol><li> Legen Neuralrohr, die Segmente in Collagenase / Dispase bei Raumtemperatur für 10 Minutens. Unmittelbar in Waschmedium zu waschen. </li><li> Zurück zur sterilen Gewebe dPBS. Mit einer sterilen Insulin-Nadeln, entfernen Sie vorsichtig die nicht-neuronalen Ektoderm aus dem Gewebe und trennen Sie die Somiten vom Neuralrohr. Die letzten Teile des Mesoderm von Somiten Gewebe kann durch Verreiben sanft mit einem Cut-down p20 Spitze entfernt werden. Seien Sie vorsichtig, um nicht zur Beschädigung des Neuralrohrs. Beachten Sie dies beim Zerreiben eng. </li><li> Platzieren Sie die isolierten neuronalen Rohr durch einen zweiten und dritten 30 Sekunden Waschgang Waschmedium. </li><li> Waschen einmal SR Medium, und legen die isolierten neuronalen Rohr in der Mitte eines FN-beschichteten, die zuvor hergestellt wurde (Schritt 1.3). Befeuchten die Hypoxie Kammer mit einem Gericht aus sterilem Wasser. Anschließend wird die Schale in die Kammer Hypoxie und spülen Sie die Kammer mit Mischgas bis 3% O 2 (verwenden Sie einen Tank mit einer Mischung aus 1% O 2, 6% CO 2, 93% N 2). </li><li> Behandeln Sie die Kammer extrem vorsichtig zu gewährleisten that Explantate sind ungestört und bleiben in der Mitte der Brunnen. </li><li> Bei 37 ° C. Zusammenfassung der Schritte 5-6 wird in 1 gezeigt. </li></ol> 7. Die Entfernung von Neuralrohrdefekten <ol><li> Nach 24 Stunden Inkubation, entfernen das Neuralrohr durch leichtes necken den Rand des Neuralrohr von den wandernden Zellen unter Verwendung einer sterilen Nadel Insulin. Entfernen und Entsorgen der Neuralrohr aus dem Medium mit einer sterilen p20 Schnitt wie in Schritt 6,2 und ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium SR (Abbildung 2). Dies geschieht am einfachsten mit einem inversen Mikroskop. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 ° C in hypoxischen Bedingungen, NC-Zellen haben sich von dem Neuralrohr in einer nahezu reinen Population (Abbildung 3a) migriert. Manchmal wird als ideal Kulturen nicht nachgeben robust Auswüchse. Zum Beispiel ist es möglich, dass nach 24 Stunden ter Neuralrohr wird auf sich selbst zusammengerollt haben und der NC wird nicht wandern weg von der Neuralrohrdefekte (Abbildung 3b). Gelegentlich wird das Neuralrohr nicht auf die mit Fibronectin beschichteten Platten zu befestigen. Nach unserer Erfahrung können suboptimale NC Migration oder Probleme mit der Befestigung des Neuralrohrs negativ durch Normoxie Bedingungen oder Konzentration des Fibronektin betroffen sein, jeweils. Die enzymatische Aktivität der Kollagenase / Dispase variiert leicht von Batch-und Verdauung Zeit entsprechend angepasst werden müssen, jedoch nicht verdauen das Gewebe länger als 15 Minuten. Overdigestion des neuronalen Gewebes in Röhrchen mit Collagenase / Dispase auch zu einer mangelhaften Auswüchse führen. Wenn Somiten Gewebe nicht leicht von dem Neuralrohr nach Inkubation in Collagenase / Dispase entfernt wird, kann das Neuralrohr länger als zehn Minuten lang inkubiert werden. Manchmal das Neuralrohr nicht an dem Substrat. Wenn dies der Fall, überprüfen Sie die fibronecZinn-Konzentration und die Hypoxie Bedingungen. Während normoxischen Bedingungen zur Kultur Wildtyp-NC verwendet werden können, hypoxischen Bedingungen genauer nachahmen die in vivo-Umgebung 29,30. Nach unserer Erfahrung wurde hypoxischen Bedingungen kritisch, wenn die Kultivierung Mutanten NC. Zum Beispiel, wenn Foxd3 Mutante NC in normoxischen Bedingungen kultiviert wurden, hatten Stamm NC eine stark reduzierte Zelle Auswachsen im Vergleich zu Kontrollen. Dieses Missverhältnis in Auswuchs Größe wurde entfernt, wenn die Explantate in hypoxischen Bedingungen (Abbildung 4) kultiviert wurden. Darüber hinaus, wenn Wildtyp-Neuralrohr Explantaten in Normoxie kultiviert wurden, war die Anzahl der Caspase-positiven Zellen größer als die ähnlicher Explantaten in Hypoxie kultiviert (Daten nicht gezeigt). Durch die Beibehaltung aller NC-Kultur in Hypoxie, können Vergleiche zwischen einfacher Steuerung und Dynamik der mutierten Kulturen durchgeführt werden. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="1" /> <strong&gt; Abbildung 1. Insgesamt schematische von NC-Isolation. A) Dissect Regions of Interest aus dem Embryo. B) Digest Neuralrohr in Kollagenase / Dispase für 10 Minuten (nicht mehr als 15 Minuten). C) in Wasch-mittel waschen. D) Dissect weg die nicht-neuronalen Ektoderm und Mesoderm. EF) zweimal Waschen in Wasch-mittel. G) Platte in Selbsterneuerung Medium. Bei 37 ° C in 3% O 2 hypoxischen Bedingungen. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Schrittweise Entfernung von Neuralrohrdefekten aus Explantat. Das Neuralrohr muss nach 24-48 Stunden entfernt werden, um eine Kontamination mit nicht-NC-Zellen zu verhindern. A) Man beachte die Grenze zwischen dem Neuralrohr und der NC-Auswuchs (durchgezogene Linie). B) Schneiden Sie entlang der Kante des Neuralrohrs mit einer Insulin-Nadel. C) Entsorgen Sie das Neuralrohr und ersetzen Medium durch frisches Medium selbst zu erneuern. Eine gestrichelte Linie zeigt an, inwieweit der Auswuchs. Abkürzung: NT, Neuralrohr. Abbildung 3. Beispiele für repräsentative Ergebnisse. A) Typische Explantat Auswachsen nach 24 Stunden Inkubation in Selbsterneuerung Medium in hypoxischen Bedingungen (gestrichelte Linie gibt Ausmaß der Auswuchs). B) Vergrößerte Ansicht von NC Auswuchs nach 48 Stunden in der Kultur. C) Weniger ideal Kultur mit geringer Ausbeute Auswuchs. A und C wurden unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird. Bilder zeigen den natürlichen Verbreitungsgebieten in Kultur Robustheit. Dies kann durch die Effizienz des Neuralrohrs Isolation, Konzentration der FN, hypoxischen Bedingungen, und die Zeit in Kollagenase / Dispase Verdauung beeinträchtigt werden. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. In-vitro-Analysen von NC Explantatkulturen in Normoxie gegenüber Hypoxie. Control (Wildtyp) NC-Zellen von Neuralrohr-Explantaten nach 48 Stunden in normoxischen Kulturbedingungen migriert. Im Gegensatz dazu Foxd3 MutanteNC war stark Zelle Auswüchse in Normoxie (rote Konturen Marke Kanten der NC Auswüchse) reduziert. Als vergleichbar Explantate unter hypoxischen Bedingungen angebaut wurden, wuchs Foxd3 mutierten NC-Explantate vergleichsweise zu den Kontrollen, so dass spätere Analysen. Beachten Sie, dieses Verhalten auch mit dem Verhalten der Foxd3 Mutante NC in vivo korreliert.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Entwicklungsstufe des Embryos zu zahlen, um den Erfolg dieses Ansatzes zu gewährleisten. Zählen von Somiten frühe Mausembryonen ist sowohl für die Bühne passend Embryonen innerhalb eines Wurfes und der Bestimmung der richtigen Regionen des Neuralrohrs für die Isolierung von entscheidender Bedeutung. Eine Variation von ein oder zwei Somiten zwischen Embryonen ist innerhalb einer angemessenen Palette von der zeitlichen Entwicklung, abhängig von der Auflösung des Experiments durchgef...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM (low Glukose) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasalmedium </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-10G </td><td></td></tr><tr><td> dPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> IGF1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354037 </td><td> Shop in 50 mu g / ml Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> BD Biosciences </td><td> 354060 </td><td> Shop in 25 ug / ml Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Gibco </td><td> 33016-015 </td><td> Gespeichert in 1mg/ml aliquots bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Retinsäure </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td> Shop in 35 mu g / ml Aliquots nach Rekonstitution in Ethanol bei -20 ° C </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> D-5637 </td><td></td></tr><tr><td> N 2 Ergänzung </td><td> Gibco </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Ergänzung </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Steriflip 0,22 um Filter </td><td> Millipore </td><td> SCGP00525 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> 0,20 um-Filter </td><td> Corning </td><td> 431219 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzen (für die Filtration) </td><td> BD Biosciences </td><td> 301604 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Vier-Well-Platten </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> Roche </td><td> 269 ​​638 </td><td> Aktivität variiert je nach Charge. Shop in 100 mg / ml Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Insulin Nadeln (29 ½ Gage) </td><td> Becton Dickson </td><td> 309306 </td><td></td></tr><tr><td> Hypoxie-Kammer </td><td> Billups-Rothenberg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sauerstoff-Analysator </td><td> Billups-Rothenberg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td></td><td> Zur Entfernung von Gebärmutter und Decidua. </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (0,25%) </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und kultivierung von zellen der neuralleiste aus embryonalen murinen neuralrohr

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Die embryonalen Neuralleiste (NC) ist ein multipotenten Vorläufer-Population, die an der dorsalen Seite des Neuralrohrs stammt, erfährt eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) und wandert während des Embryos, was zu diversen Zelltypen 1-3. NC hat auch die einzigartige Fähigkeit, die Differenzierung und Reifung von Zielorganen 6.4 zu beeinflussen. Wenn es in vitro explantiert, NC Vorläuferzellen Selbsterneuerung durchlaufen, Migration und Differenzierung in eine Vielzahl von Gewebetypen einschließlich Neuronen, Gliazellen, glatten Muskelzellen, Knorpel und Knochen. NC Multipotenz wurde zum ersten Mal aus Explantaten der Vogelgrippe Neuralrohr 7-9 beschrieben. In-vitro-Isolierung von NC-Zellen erleichtert die Untersuchung der Dynamik NC einschließlich Proliferation, Migration, und Multipotenz. Weitere Arbeiten in den Vogel-und Ratten-Systemen gezeigt, dass explantierten NC-Zellen ihre NC-Potenzial zu behalten, wenn wieder in den Embryo verpflanzt 10-13. Da diese inhärenten zellulären Eigenschaften in explantierten NC Vorfahren bewahrt werden, bietet das Neuralrohr Explantat Assay eine attraktive Option für das Studium der NC in vitro. Um ein besseres Verständnis der Säuger NC zu erreichen, wurden viele Verfahren verwendet worden, um NC-Populationen zu isolieren. NC-abgeleitete Vorläuferzellen aus der Post-wandernde Standorten können sowohl im Embryo und Erwachsenen, die Dynamik des Post-NC wandernden Vorläuferzellen 11,14-20 studieren kultiviert werden, jedoch Isolierung von NC-Vorläuferzellen, wie sie aus dem Neuralrohr auswandern sorgt für eine optimale Erhaltung der NC-Zellen-Potenzial und wandernde Eigenschaften 13,21,22. Einige Protokolle verwenden fluorescence activated cell sorting (FACS), einen NC Bevölkerung für bestimmte Vorläuferzellen 11,13,14,17 bereichert zu isolieren. Allerdings, wenn beginnend mit frühen Embryonen, sind ausreichende Zellzahlen für die Analysen nur schwer mit FACS erhalten, erschwert die Isolierung des frühen NC populations aus einzelnen Embryonen. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der nicht auf FACS Ergebnisse angewiesen ist und in einer etwa 96% reines NC Bevölkerung auf einem Wnt1-Cre-Reporter aktivierte Linie 23 basiert. Das hier vorgestellte Verfahren ist von Protokollen für die Kultur von Ratten-NC 11,13 optimiert angepasst. Die Vorteile dieses Protokoll im Vergleich zu früheren Verfahren sind, daß 1) die Zellen nicht auf einer Feeder-Schicht, 2 gezüchtet) FACS ist nicht erforderlich, eine relativ reine NC Bevölkerung, 3 zu erhalten) premigratory NC Zellen isoliert und 4) Ergebnisse sind leicht quantifiziert. Darüber hinaus ist dieses Protokoll für die Isolierung von NC von jedem mutante Maus-Modell verwendet, die die Untersuchung der NC-Eigenschaften mit unterschiedlichen genetischen Manipulationen. Die Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die NC aus dem Kontext des Embryos, von denen bekannt ist, um das Überleben, Migration und Differenzierung der NC 2,24-28 zu beeinflussen, wird entfernt.

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Methoden zur Untersuchung von Migration, Selbsterneuerung und Multipotenz der Neuralleiste.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

Die embryonale Neuralleiste (NC) ist eine multipotente Progenitorpopulation, die an der dorsalen Seite des Neuralrohrs entsteht, eine epithelial-mesenchymale Transition durchläuft ...

Planen Sie drei Stunden ein, um dieses Protokoll durchzuführen. Wenn Sie bereits erfahren sind, sollte das Protokoll je nach Anzahl der präparierten Embryonen zwischen anderthalb und zwei Stunden dauern. Dieses Protokoll beschreibt, wie man einen 9,5 Tage post coitum alten Embryo, der am mittleren otischen Plakod und dem Somiten vier geschnitten wird, präpariert, um Gewebe zu isolieren, das das vagale Neuralrohr enthält.Bei etwa Embryonalstadium 16 und 22 werden Gewebe isoliert, die das trunkale Neuralrohr enthalten. Der vagale Neuralleistenzellen-Migrationsvorgang erfolgt aus dem vagen Neuralrohr. Während die trunkalen Neuralleistenzellen aus dem trunkalen Neuralrohr migrieren, wird das präparierte Gewebe enzymatisch in einer Lösung aus Kollagenase digeriert, gewaschen, und der nicht-neurale Epidermis- und Mesodermanteil wird wegpräpariert.Der isolierte Neuralrohr wird noch zweimal gewaschen und anschließend in Selbstvermehrungsmedium ausplattiert. Ich bin Elise Graph vom Bosky-Labor an der Vanderbilt University. Heute werde ich demonstrieren, wie man die Neuralleiste aus dem Neuralrohr in der Ex-Plante-Kultur isoliert.Mit dieser Technik können Sie die Eigenschaften der Neuralleiste in vitro untersuchen. Beginnen wir. Verdünnen Sie zunächst 100 Mikroliter eines Fibronectins mit einer Konzentration von 1 mg pro ml in 3,2 Milliliter sterilem DPBS.Geben Sie so viel von der Fibronectin-Lösung mit 30 Mikrogramm pro Milliliter, dass der Boden jedes Wells einer Vier-Well-Platte bedeckt ist. Klopfen Sie vorsichtig die Ecken der Vier-Well-Platte an, um sicherzustellen, dass jedes Well gleichmäßig bedeckt ist. Stellen Sie die Platte beiseite, während Sie Ihr Medium ansetzen und filtrieren.Die Platte sollte mindestens 15 Minuten stehen. Sammeln Sie die folgenden Reagenzien, um Ihr Medium vorzubereiten. Die Medien werden frisch vor Gebrauch in einem Biosicherheitsschrank hergestellt.Verwenden Sie stets sterile Technik. Entfernen Sie die Faser nin aus der Vier-Loch-Platte und lassen Sie sie mit geöffnetem Deckel im hinteren Bereich des Sicherheitswerks trocknen. Die Trocknung der Faser nin dauert etwa 15 Minuten.Sobald die Platte trocken ist, 500 Mikroliter Selbstvermehrungsmedium in jedes Loch geben. Die Platte sofort in einen feuchten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad stellen. Vor Beginn der Dissektion 50 Mikroliter Kollagenase Disc Space in fünf Milliliter DPBS mischen. Achten Sie darauf, die gesamte Kollagenase Dispa zuzugeben, um eine effiziente Verdauung sicherzustellen.Filtern Sie die Kollagenase-Dispase-Lösung mithilfe eines 0,2-Mikrometer-Spritzenfilters in drei Vertiefungen einer 12-Loch-Platte. Jede Vertiefung sollte ein Drittel der fünf Milliliter Lösung erhalten. Geben Sie jeweils etwa ein Milliliter Waschmedium in die verbleibenden Vertiefungen. Stellen Sie die Platte auf Eis, bis Sie bereit sind, Ihr isoliertes Gewebe zu verdauen.Schneiden Sie anschließend die Spitze einer P-20-Pipettenspitze knapp unterhalb der abgeschrägten Kante mit einer sterilen Rasierklinge ab. Tauchen Sie die Spitze in Waschmedium, damit Embryonen und Gewebestücke nicht an den Spitzen haften bleiben, während sie zwischen Lösungen überführt werden.Gleichermaßen mit der Spitze einer P-1000 von einer zeittypisierten Paarung verfahren. Entfernen Sie die Gebärmutter von der Mutter. Führen Sie die Dissektion in steriler DPBS durch.Sterilisieren Sie Ihre Dissektionswerkzeuge mit einer beliebigen Methode, wie beispielsweise der Hitzesterilisation. Falls das DPBS trüb wird, überführen Sie das Embryo mit der abgeschnittenen P1000 in eine neue Schale mit sterilen DPBS, beginnend am geschnittenen Gewebe. Lösen Sie das Uterusgewebe vorsichtig von der Decidua. Entfernen Sie anschließend vorsichtig das Embryo aus der Decidua. Die Lage des Embryos wird hier mit einer Zeichnung veranschaulicht. Nach der Isolierung eines 9,5 Tage post coitum alten Embryos entfernen Sie vorsichtig die Dottersack mit Insulin-Nadeln.Wenn Genotypisierung ein notwendiger Bestandteil Ihres Protokolls ist, waschen Sie den Dottersack und jegliches verbleibende embryonale Gewebe in sauberem, sterilen DPBS. Geben Sie das Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis Sie bereit sind, die DNA zu isolieren. Orientieren Sie sich an der Anatomie des Embryos.Sie werden im mittleren OTIC-PLA-Code in den SOMITEN vier 16 und 22 schneiden. Sie müssen den Fokus Ihres Mikroskops anpassen, um die Somiten zu zählen. Führen Sie den ersten Schnitt am mittleren Otic-PLA-Code durch.Verwenden Sie die Nadeln wie die Klingen einer Schere, ohne den Rest des Neuralrohrs zu beschädigen. Führen Sie den zweiten Schnitt nach Somit 4 aus. Schneiden Sie danach bis Somit 15 und direkt danach ab.Führen Sie den letzten Schnitt nach dem Somit 22 oder dem letzten Somit durch, falls das Embryo entwicklungsbiologisch früher steht. Dieses Gewebe enthält die Rumpf-Neuralröhre, um das Gewebe zu isolieren, das die vagale Neuralröhre enthält.Schneiden Sie das Herz vom Gewebe zwischen der mittleren otischen Platte und dem vierten Somit ab. Achten Sie auf den Größenunterschied zwischen den isolierten Gewebestücken. Das Stück, das das vagale Neuralrohr enthält, ist breiter als das andere.Diese physikalische Unterscheidung ermöglicht es Ihnen, die beiden Teile gemeinsam zu verarbeiten. Verwenden Sie die abgeschnittene P20, um den Neuralrohr in den Collagenase-DIS-Raum zu überführen. Das verbleibende Gewebe kann zur Genotypisierung aufbewahrt werden.Wie zuvor erwähnt, geben Sie die Stücke des isolierten Gewebes in eine der Mulden mit Kollagenase dis space. Nun bei Raumtemperatur. Lassen Sie es 10 Minuten lang stehen.Während der 10-minütigen Inkubation können Sie mit der Dissektion des nächsten Embryos beginnen. Nach 10 Minuten entfernen Sie das isolierte Gewebe vom Kollagenase-Dig-Raum und waschen es, indem Sie es mehrmals mit dem Waschmedium auf- und abpipettieren. Geben Sie das digerierte Gewebe in DPBS. So sollte das Gewebe nach der Digestion aussehen.Der nächste Schritt beinhaltet das Entfernen des nicht-neuralen Keimblatts und des Mesoderms. Zunächst wird das nicht-neurale Keimblatt vom Neuralrohr abgehoben. Anschließend kann das Mesoderm vom Neuralrohr entfernt werden.Um die Entfernung des nicht-neuralen Ektoderms und Mesoderms zu demonstrieren, konzentrieren wir uns auf das vagale Neuralrohr. Derselbe Vorgang kann mit dem trunkalen Neuralrohr durchgeführt werden. Beginnen Sie damit, das nicht-neurale Gewebe mit einer Nadel festzuhalten.Verwenden Sie das andere Werkzeug, um vorsichtig das nicht-neurale Mesoderm zu entfernen. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Somiten, die neben dem Neuralrohr liegen, um Reste von nicht-neuralem Gewebe vollständig zu beseitigen. Wiederholen Sie den Vorgang vorsichtig mit der abgeschnittenen Spitze einer P-20-Pipette.Spülen Sie den Neuralrohr zweimal mit Waschmedium. Geben Sie den Neuralrohr in Selbstvermehrungsmedium und pipettieren Sie ihn dann in eine vorbereitete Vierer-Vertiefungsplatte.Stellen Sie die Vierer-Platte in eine Hypoxiekammer. Stellen Sie sicher, dass die Kammer dicht verschlossen ist. Schließen Sie ein Sauerstoff-Analysengerät an und schalten Sie die Quelle für das Gasgemisch ein.Verwenden Sie eine Mischung aus 1 % Sauerstoff, 6 % Kohlendioxid und 93 % Stickstoff. Beaufschlagen Sie die Hypoxiekammer mit dem Gasgemisch, bis ein Sauerstoffgehalt von 3 % erreicht ist. Schalten Sie das Gasgemisch ab, und stellen Sie die Hypoxiekammer auf 37 Grad Celsius.24 Stunden später. Betrachten Sie das Neuralrohr-Explantat. Neuralleistenzellen sollten aus dem mit der durchgezogenen Linie markierten Neuralrohr ausgewandert sein, um eine Kontamination mit nicht zur Neuralleiste gehörendem Gewebe zu vermeiden; schneiden Sie daher außerhalb des Neuralrohrs mit einer Insulin-Nadel.Entfernen Sie anschließend den Neuralrohr vom Explantat und alle verbleibenden nicht-neuralen Crest-Zellen. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Selbsterneuerungsmedium und stellen Sie die Platten zurück in die Hypoxiekammer. Befüllen Sie die Kammer und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius. Nach 24 Stunden in Kultur wandern die Neuralleistenzellen vom Neuralrohr weg. Der Umfang des Auswuchses ist mit einer gestrichelten Linie dargestellt. Dieser durch Pfeile markierte Auswuchs der Neuralleiste ist etwa zu 96 % rein, und die Zellen exprimieren P 75, SOX 10 und Fox D drei.Zu den Experimenten, die mit diesen kultivierten Zellen des Neuralleistengewebes durchgeführt werden können, gehören unter anderem die folgenden. Manchmal ergeben weniger geeignete Kulturen keine effizienten Auswüchse; falls dies der Fall ist, sollten die hypoxischen Bedingungen, die Fibronectinkonzentrationen sowie die Dauer der Gewebeverdauung in Kollagenase überprüft werden. DYS Space Heute habe ich die Grundlagen der Kultivierung der Neuralleiste aus dem Neuralrohr erläutert.Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung von neuroprecursors aus den Entwicklungsländern Kortex embryonaler Mäuse verwendet. Das Verfahren zur Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter, sezieren die kortikale Gewebe und verdauen die isolierten Hirnrinde dargestellt.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Hier zeigen wir unsere Methode zur Maus epidermalen Neuralleiste Stammzellen (EPI-NCSC) zu isolieren. Technik beinhaltet Mikro-Sezieren Whisker Follikel, die Isolierung des Bulge und Silber reflektiert sie in Gewebekultur. EPI-NCSC beginnen mit Ausbuchtung Explantate auf das Substrat innerhalb von 3 auswandern - 4 Tage.

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

Um Neuralleiste Stammzellen (NCSC) in vitro zu kultivieren, ist ein spezielles Medium (NCSCM) erforderlich. Wesentlicher Bestandteil der NCSCM ist Hühnerembryo-Extrakt (CEE). Wir beschreiben hier genaue Techniken, um eine maximale Menge an reinem und hochwertigem CEE, einschließlich Details wie die Isolierung, Mazeration, Zentrifugation und Filtration zu produzieren.

Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Murine Neural Crest Stem Cells

Dieser Artikel stellt eine robuste Protokoll zur Isolierung und Kultivierung der Neuralleiste Stammzellen aus menschlichen Haarfollikeln.

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Dieses Video veranschaulicht eine Technik zur Isolierung von kranialen Nervenfalten aus der Mittelhirnregion von Hühnerembryonen. Es wird ein detaillierter Präparierungsprozess der Neuralfalten, ihre Platzierung und Befestigung auf Fibronektin-beschichteten Deckgläsern vorgestellt, gefolgt von der Beobachtung der Migration von Neuralleistenzellen aus den Neuralfalten.

Isolierung von schädelförmigen Nervenfalten aus einem Kükenembryo für eine Zellkultur der Neuralleiste

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Zerlegung und Kultur von kranialen neuralen Kammzellen aus Mausmodellen, in erster Linie für die Untersuchung der Zellmigration. Wir beschreiben die verwendeten Live-Bildgebungstechniken und die Analyse von Geschwindigkeits- und Zellformänderungen.

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dieses vielseitige Protokoll beschreibt die Isolierung von primären Neuralleistenzellen (NCCs) durch die Exzision von kranialen Neuralfalten aus Hühnerembryonen. Nach der Beschichtung und Inkubation entstehen wandernde NCCs aus neuronalen Faltenexplantaten, was eine Beurteilung der Zellmorphologie und -migration in einer vereinfachten 2D-Umgebung ermöglicht.

Präparation und morphologische Analyse von Küken-Schädel-Neuralleistenzellkulturen

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Migrationsexperiment, das für die funktionelle Analyse der Moleküle geeignet ist, die an der in vivo Migration von Neuralleistenzellen in die hyaluronsäurereiche extrazelluläre Matrix beteiligt sind.

In vitro Untersuchung der Auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix auf die Migration von Neuralleistenzellen

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Wir präsentieren ein dreidimensionales (3D) in vitro Differenzierungsprotokoll, das Neurosphären von reproduzierbarer Größe erzeugt, um kraniale Neuralleistenzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus herzustellen. Wir zeigen, dass diese Methodik die Variabilität im Vergleich zu früheren Protokollen reduziert und wie sie für Multiplex-Assays zur Untersuchung der Entwicklung von kranialen Neuralleistenzellen verwendet werden kann.

Dreidimensionales In-vitro-Differenzierungsprotokoll für kraniale Neuralleistenzellen für Multiplex-Assays

Erfahren Sie die Isolierung und Kultivierung von Neuralleistenzellen aus embryonalen murinen Neuralrohr. Diese Methode liefert hochreine Zellpopulationen ohne FACS oder Fütterzellschichten für Entwicklungsbiologie.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

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