Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease
September 7th, 2012
Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, erfolgreich Ösen aus einer Bauchspeicheldrüse der Maus zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Bauchspeicheldrüse vom umgebenden Gewebe isoliert wird. Als nächstes wird der Gallengang kanüliert, so dass die Bauchspeicheldrüse mit dem Kollagenase-Protease-Gemisch aufgebläht werden kann.
Nach dem Aufblasen wird die Bauchspeicheldrüse entfernt und die Ösen vorsichtig dissoziiert. Schließlich werden die isolierten Ösen gefiltert und für die zukünftige Verwendung plattiert. Letztendlich wird diese Methode der Ösenisolierung mit gereinigter Kollagenase und neutraler Protease verwendet, um eine maximale Ösenausbeute und eine optimale Ösenmorphologie zu erzielen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der Ösenisolierung besteht darin, dass wir die Variabilität von Charge zu Charge durch die Verwendung von gereinigten Enzymen eliminiert haben. Darüber hinaus haben wir einige Protokolle geändert oder verbessert, um die Ösenmorphologie zu verbessern. Bedecken Sie nach der Euthanasation den Oberkörper mit 70%igem Ethanol, bevor Sie die Bauchhöhle vom Anus bis zum Zwerchfell vollständig öffnen.
Platzieren Sie dann die Maus auf der Plattform eines Präpariermikroskops. Ziehen Sie den Blinddarm und den aufsteigenden Dickdarm heraus und platzieren Sie sie außerhalb der Körperhöhle nach links, verschieben Sie die Leberlappen gegen das Zwerchfell. Wenn sie nicht von selbst dort verbleiben, vergrößern Sie die Öffnung der Körperhöhle.
Fassen Sie den Zwölffingerdarm mit einer gekrümmten Pinzette und lokalisieren Sie die Pfortader der Leberarterie und das Gallengangsbündel, die zur Leber führen. Mit einer weiteren gebogenen Pinzette. Legen Sie eine Naht unter die Arterienvene und das Gangbündel und ziehen Sie sie so nah wie möglich an der Leber fest.
Fassen Sie mit zwei Paaren gebogener Pinzetten vorsichtig den Zwölffingerdarm und finden Sie den Gallengang, der an der Papille befestigt ist. Verwenden Sie eine Zange der Pinzette, um durch die Bauchspeicheldrüse und das Bindegewebe direkt unter dem Gallengang und in der Nähe der funktionierenden Papille zu stechen. Führen Sie die Pinzette schnell durch das Loch und legen Sie eine Naht ein. Locker. Binden Sie die Naht um den Gallengang, um mit einer 90-Grad-Pinzette einen kleinen Kreis zu bilden.
Ziehen Sie am Dünndarm, bis der Gallengang tau ist. Machen Sie mit einer superfeinen Schere einen horizontalen Schnitt über die Papille, ohne den Gallengang von der Papille zu lösen, während Sie den Darm halten. Führen Sie eine Kanüle in den Gallengang ein und ziehen Sie dann die Naht vorsichtig fest um die Kanüle.
Füllen Sie anschließend eine Drei-Milliliter-Spritze mit 2,0 Millilitern Kollagenase-Protease-Mischung. Injizieren Sie diese Mischung in einem langsamen, gleichmäßigen Tempo in die Kanüle. Nachdem das Aufblasen der Bauchspeicheldrüse abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kanüle aus dem Gallengang.
Beginnend am absteigenden Dickdarm schneiden Sie das Bindegewebe ab und ziehen den Darm nach oben, bis der Gallengang erreicht ist. Trennen Sie als Nächstes die Bauchspeicheldrüse von der Milz und dem umgebenden Gewebe. Zum Schluss schneidest du die Nähte ab und entfernst die Bauchspeicheldrüse.
Legen Sie die Bauchspeicheldrüse nach der Entnahme in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern HBSS auf Eis. Sobald alle Proben entnommen sind, legen Sie alle 50-Milliliter-Röhrchen mit Bauchspeicheldrüsengewebe in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Schaukeln Sie den Schlauch 15 Minuten lang vorsichtig und prüfen Sie, ob das Gewebe dissoziationiert ist.
Stellen Sie sicher, dass sich das Taschentuch leicht lösen lässt und den Schlauch am Deckel hält. 12 Mal schwenken, um das Gewebe weiter zu dissoziieren. Fügen Sie nicht mehr als 30 Milliliter HBSS hinzu und zentrifugieren Sie.
Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und lassen Sie eine kleine Menge Überstand am Boden, um die Zellpalette nicht zu stören. Mit einer 30-Milliliter-Spritze, die an einer 14-Gauge-Nadel befestigt ist, nicht mehr als 10 Milliliter HBSS hinzufügen und die Suspension zweimal auf und ab aspirieren. Filtrieren Sie das Zellgemisch durch ein T-Sieb aus Kunststoff in ein 50-Milliliter-Röhrchen.
Spülen Sie mit weiteren 10 Millilitern, HBSS und Zentrifuge. Dekantieren Sie den Überstand und drehen Sie die Schläuche um, um sie eine Minute lang auf einem saugfähigen Papiertuch abtropfen zu lassen. Suspendieren Sie jedes Röhrchen in 10 Millilitern.
Kälte 1100. Sein blickdichtes Overlay, das sein undurchsichtiges Overlay mit 10 Millilitern, HBSS und Zentrifuge. Entfernen Sie den gesamten Überstand von 20 Millilitern mit einer 25-Milliliter-Pipette mit großer Bohrung und leiten Sie den Überstand durch einen invertierten 70-Mikron-Filter.
Die Ösen werden direkt in eine Petrischale gefiltert und gespült, indem 10 Milliliter Ösenmedium durch die Filterkultur pipettiert werden. Die Ösen in einem Gewebekultur-Inkubator, bis sie für Experimente bereit sind. Ösenerträge, Morphologie und Qualität sind die allgemeinen Parameter, die zur Beurteilung des Erfolgs der Ösenisolierung herangezogen werden.
Hier ist die typische Ösenmorphologie dargestellt. Die Ösen haben eine runde bis längliche Form mit relativ gleichmäßiger Größe. Hier. Isolierte Ösen wurden auf glukosestimulierte Insulinsekretion untersucht.
Die Insulinstimulation war bei Ösen, die mit Sigma Typ 11 präpariert wurden, ähnlich wie bei ci zyme TM, wobei MABP auf eine hohe Qualität der Ösenpräparation hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Gallengang einer Maus kanüliert. Arbeiten Sie mit Zyme-Kollagenase und Neutroproteasen, um Ihre Augenlider für jeden Assay zu isolieren.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Isolierung von Inselzellen aus einer Mäusepankreas unter Verwendung von in situ Pankreasgangkanülierung und einer Collagenase-Protease-Mischung. Die Methode zielt darauf ab, die Ausbeute und Morphologie der Inselzellen zu verbessern und gleichzeitig die Variabilität zu minimieren.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Endokrinologie
Hintergrund
- Inselzellen sind entscheidend für die Insulinproduktion.
- Traditionelle Isolierungsmethoden können zu Variabilität in den Ergebnissen führen.
- Die Verwendung von gereinigten Enzymen kann die Qualität der isolierten Inselzellen verbessern.
- Verbesserte Protokolle können zu besserer Morphologie der Inselzellen führen.
Zweck der Studie
- Inselzellen aus Mäusepankreas effektiv zu isolieren.
- Die Charge-zu-Charge-Variabilität in Enzympräparationen zu reduzieren.
- Die Morphologie der Inselzellen für Forschungsanwendungen zu optimieren.
Verwendete Methoden
- Isolierung der Mäusepankreas von umgebenden Geweben.
- Kanülierung des Gallengangs zur Enzyminfusion.
- Inflation der Pankreas mit einer Collagenase-Protease-Mischung.
- Filtrierung und Platten von isolierten Inselzellen für Experimente.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Dissoziation und Isolierung von Inselzellen.
- Verbesserte Morphologie der Inselzellen nach der Isolierung beobachtet.
- Hochwertige Inselzellpräparationen, angezeigt durch Insulinsekretionstests.
- Die Methode zeigte eine reduzierte Variabilität im Vergleich zu traditionellen Techniken.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode ist effektiv zur Isolierung von hochwertigen Inselzellen.
- Die Verwendung von gereinigten Enzymen verbessert die Zuverlässigkeit der Ergebnisse.
- Diese Technik kann für verschiedene Assays mit Inselzellen von Vorteil sein.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolation of primary pancreatic islets enables physiologically relevant assessment of beta cell function, which is critical for diabetes target validation and mechanistic de-risking. Variability in enzyme lot performance compromises reproducibility across discovery campaigns, impacting lead identification and predictive confidence. This protocol addresses lot-to-lot inconsistency through purified collagenase and neutral protease, supporting scalable, standardized islet preparation for preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of intracellular signaling pathways and secretory responses in primary islets, improving target hypothesis validation.
- Operational Value: Reduces biological noise from enzymatic variability, increasing confidence in target engagement readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides consistent islet yield and morphology for reliable glucose-stimulated insulin secretion assays.
- Operational Value: Standardized enzyme composition supports assay reproducibility across laboratories and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant beta cell biology for preclinical efficacy and toxicity studies.
- Operational Value: Facilitates cross-strain comparability when enzyme ratios are adjusted for species-specific tissue characteristics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where primary islet function informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation using physiologically relevant human-like islet responses.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of compound effects on insulin secretion.
- Analytics: Generates measurable dependent variables such as insulin secretion levels and islet yield for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase target modulation to preclinical outcomes through preserved islet morphology and function.
- Enterprise Reuse: Purified enzyme lots allow protocol reuse across projects, reducing re-optimization burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in beta cell responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of islet isolation across sites and studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in diabetes programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable islet-derived functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and pancreatic duct cannulation.
- Dependent on access to purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) with characterized activity.
- Necessitates standardization of enzyme ratios (e.g., 35:10 collagenase:protease) for consistent performance.
- Adaptation may be needed for non-C57BL/6 strains or rat models based on tissue density and enzyme accessibility.
- Practical limitation: Manual dissection and inflation steps constrain throughput without automation.
