Name: Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Isolation von Langerhans-Inseln aus der Mauspankreas mit gereinigtem Kollagenase-Neutral-Protease-Gemisch. Diese Methode maximiert die Ausbeute und verbessert die Morphologie für endokrinologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse R01 DK060581, R01 DK083583 (beide RGM) unterstützt.

A. Benötigte Materialien: Siehe Tabelle 1 (Reagenzien) vor der Zubereitung <ol><li> HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% Penicillin / Streptomycin (im Kühlschrank gelagert oder auf Eis gelagert). </li><li> 20% BSA Lager wird in Wasser hergestellt und aliquotiert und bei -20 ° C. </li><li> HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA endgültige Konzentrationen von 0,3%) </li><li> Islet-Medium: RPMI + 10% FBS + 1% Glutamin + 1% Penicillin / Streptomycin </li><li> Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque 1077 + 200 ml Histopaque </li><li> 4-0 Suture (McKesson): in 2 ¾ Zoll-Stücke geschnitten und in einer 10 cm Petrischale </li><li> Instrumente: Beugen Sie die Zange von Fine Science Tools, um 90 °, und feilen Sie den gezackten Zähnen aller drei Paare der Zange. Das Ziel ist es langweilig die Zähne, nicht um sie zu entfernen. </li><li> Kanüle zur Verabreichung von Kollagenase / Protease Mischung: 27G ½ in. Nadel, 30 ½ in.Nadel, PE50 Schlauch in 12 in. Stücke schneiden. Datei beider Nadeln auf eine glatte abgerundete Ende die keine scharfen Kanten aufweist. Legen des 27G Nadel in ein Ende eines 12 Zoll Stück PE50-Schlauch. Entfernen Sie die 30G Nadel aus dem Gehäuse durch die Zerschlagung der Gehäuse mit einer Zange, Drehen des Gehäuses ¼ Drehung jeder Zeit. Entfernen Sie die Nadel mit der Zange aus dem Gehäuse und legen Sie sie in das andere Ende des PE50 Rohre unter einem Dissektionsmikroskop. Achten Sie darauf, nicht knicken Sie den Schlauch, wie Sie die Nadel legen in den PE50 Rohre. Die 27G Nadel ist das Ende, dass Sie die Spritze von Kollagenase befestigen. </li><li> Collagenase (CI zyme MA) und Neutral Protease (CI zyme BP). Lösen Sie das TDE den Anweisungen des Herstellers. Finden Sie auf der chargenspezifischen Zertifikat für Analyse, um die Enzymaktivität Konzentration zu berechnen. Übertragen insgesamt 350.000 Kollagen abbauenden Aktivität (CDA) Einheiten der rekonstituierten Kollagenase und 100.000 neutrale Protease Einheiten der reconstitausgeschüttet BP Protease in eine konische Röhre und verdünnter bis 15 ml Gesamtvolumen in HBSS (P / S) </li></ol> B. Step-by-Step-Protokoll Ein. Inflation der Bauchspeicheldrüse mit Collagenase / Protease Mischung <ol><li> Euthanize Maus durch zervikale Dislokation, sättigen die Maus Torso mit 70% EtOH, offene Bauchhöhle vollständig vom Anus bis Membran mit irgendwelchen Dissektion Schere und Pinzette. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf der Plattform eines Dissektionsmikroskop. </li><li> Ziehen Sie das Caecum und Colon ascendens aus und setzen Sie sie außerhalb der Körperhöhle zu Ihrer Linken. Siehe Abbildung 1 für eine Zusammenfassung der folgenden Schritte aus. </li><li> Positionieren der Lappen der Leber gegen das Diaphragma, sie sollten dort verbleiben, wenn die Körperhöhle offen ist weit genug. Finden Sie die Leberarterie, Pfortader und Gallengänge Bündel führt in der Leber durch Ergreifen des Duodenums mit gebogenen Pinzette. Mit einem anderen Paar von gekrümmten Pinzette unter der Arterie, Vene zu erreichen, und Kanal bundle und ziehen ein 2 ¾ in. Stück 4-0 Naht unter der Arterie, Vene, Gallengang und binden Sie es einmal und ziehen Sie es fest, wie die Leber wie möglich zu schließen. </li><li> Mit zwei Paaren gekrümmter Pinzette vorsichtig greifen den Zwölffingerdarm und finden den Gallengang an den Zwölffingerdarm an der Papille. Verwenden Sie eine Zange der Zange durch die Bauchspeicheldrüse und Bindegewebe direkt unter dem Gallengang in der Nähe der Papille stecken. Stecken Sie Ihre Pinzette schnell durch das Organ, um ein Loch zu machen und dann legte beide Zangen Zangen durch und greifen noch 2 ¾-Zoll-Stück von 4-0 Faden durch und binden Sie es einmal und ziehen Sie es auf einen kleinen Kreis, aber NICHT festziehen. </li><li> Wechseln Sie in den 90 °-Zange und den Superfine Vannas Schere. Mit den 90 ° Pinzette vorsichtig kneifen und ziehen Sie den Dünndarm bis zum Gallengang ist straff. Machen einer horizontalen Schnitt über die Papille mit der Schere von stechenden die offenen Schere in den Darm und dann das Schneiden mit einer Bewegung. Versuchen Sie, nur one geschnitten über die Papille ohne Lösen des Gallengang aus der Papille. </li><li> Halten Sie den Darm mit den 90 °-Zange, die Kanüle in den Gallengang bis zur Hälfte der Länge der Gallengang, und dann ziehen Sie den Faden fest um die Kanüle. </li><li> Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit 2,0 ml Collagenase / Proteasegemisch und injizieren in die Kanüle in einem langsamen, konstanten Tempo. </li><li> Nach dem Aufblasen der Bauchspeicheldrüse abgeschlossen ist, entfernen Kanüle aus Gallengang und verwenden Sie die gebogenen Pinzette und gekrümmte Feder Schere, um die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse ab dem absteigenden Dickdarm und Schnippeln des Bindegewebes, wie Sie den Darm ziehen zu entfernen. Weiterhin die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm zu entfernen, bis Sie den Gallengang zu erreichen, entfernen Sie dann die Bauchspeicheldrüse aus der Milz, dann den Magen und dann aus dem Eingeweide der Bauchhöhle. Fertig Entfernen von Schnippeln entfernt die Nähte. Fügen Sie die Bauchspeicheldrüse zu einer 50-ml-Tube mit 5 ml HBSS(P / S). Dieses Rohr sollte auf Eis sein. </li><li> Wiederholen Sie den oben beschriebenen Vorgang für jedes Tier bis zu vier Tiere. Für optimale Ergebnisse distanzieren nur vier Pankreata auf einmal. Typischerweise, während die ersten vier in der 37 ° C warmen Wasserbad sind, blasen wir vier weitere Pankreata. </li></ol> 2. Pancreas Dissoziation <ol><li> Platzieren Sie die 50 ml Röhrchen mit dem Pankreas in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. </li><li> Schütteln Sie den Schlauch und überprüfen Gewebedissoziation, lesen Gewebe kommt leicht auseinander, dann wirbeln die Rohre 12 Mal, während Sie halten den Schlauch durch den Deckel. </li><li> Fügen Sie nicht mehr als 30 ml HBSS (BSA) (dies kann eine geringere Menge, je nachdem, wie viel benötigt wird, um die Rohre für den Zentrifugationsschritt auszugleichen) und Zentrifuge bei 290 xg für eine min. </li><li> Anzusaugen Überstand vorsichtig und lassen eine kleine Menge des Überstandes (2-3 ml) am Boden, um so nicht stören die Zellpellet. </li><li> Mit einem 30-ml-Spritze attached bis 14G Nadel, fügen Sie nicht mehr als 10 ml HBSS (BSA) und saugen die Aussetzung nach oben und unten 2 mal. </li><li> Filtern das Zellgemisch durch ein Kunststoffrohr Teesieb in ein 50 ml Röhrchen und spülen mit weiteren 10 ml HBSS (BSA). </li><li> Zentrifuge bei 330 xg für 2 min. </li><li> Dekantieren und invertieren Rohre auf einem saugfähigen Papiertuch für 1 min abtropfen lassen. </li><li> Resuspendieren jedes Rohr in 10 ml kaltem 1100 HISTOPAQUE. </li><li> Überlagern die HISTOPAQUE mit 10 ml HBSS (BSA) und zentrifugieren bei 900 xg für 18 min. </li><li> Entfernen Sie die gesamten 20 ml Überstand mit einer großen Bohrung 25 ml Pipette und die überstehende durch eine invertierte 70 um-Filter. </li><li> Spülen Sie die Inseln in eine 10 cm Petrischale durch Pipettieren 10 ml Insel media durch den Filter, während es rechts oben über der Schüssel. </li><li> Kultur der Inseln in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator bis bereit für Experimente. Typischerweise werden Inselchen handverlesen und zählte vor experimentation. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Islet Erträge, Morphologie und Qualität sind die allgemeinen Parameter verwendet werden, um den Erfolg der Inselisolierung beurteilen. In unseren Händen sind islet Erträge aus dem durchschnittlichen C57BL / 6 Maus im Bereich von 150-250 Inselchen dieses Protokoll verwenden (siehe Tabelle 2), und sind vergleichbar mit erhaltenen Daten mit optimierten Sigma XI Kollagenase. Allerdings können Ausbeuten variieren in Abhängigkeit von dem Mausstamm verwendet und dem Alter der Maus. Die meisten der Tiere, die wir verwenden, sind in der 8-16 Wochen Altersgruppe Dieses Protokoll auf mehreren Mausstämmen wurde getestet, darunter C57BL / 6 (180-250 Inseln / Maus), CD1 (200-300 Inseln / Maus), 129 / B6 (200-300 Inseln / Maus), BLKS-db/db (120-200 Inseln / Maus), NOD (10 Wochen alt, 100-150 Inseln / Maus) und NOD-SCID (100-150 Inseln / Maus ). Typische islet Morphologie ist in Abbildung 2 dargestellt, bei der Inselchen eine runde Gestalt mit relativ einheitlicher Größe länglich haben (obgleich Größe unif.ormity kann von Stamm zu variieren) belasten. Abbildung 3 zeigt unsere typische Analyse von Glukose-stimulierte Insulinsekretion aus C57BL / 6 Maus Inseln isoliert unter Verwendung von gereinigten TDES vs Sigma XI Kollagenase. Typischerweise wird ein hoher Qualität islet Zubereitung führt zu einer Insulinstimulation bei 25 mM Glukose, 6-20 mal größer als die mit 2,5 mM Glucose beobachtet wird. Andere Anwendungen können auch verwendet werden, um die Qualität von isolierten Inseln zu testen, und diese schließen Verwendung perifusion Techniken, Ca 2 +-Imaging (mit Fura2) und Reverse-Transkriptase-PCR, unter anderem 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Eine Zusammenfassung der Kanülierung der Gallengang. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Typische Erscheinungsbild von C57BL / 6 Inselchen bei 24 Stunden nach der Isolierung. Bilder wurden auf einem in erworbenenumgewandelt Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Glukose-stimulierte Insulinsekretion von C57BL / 6 Inselchen. Nach 24 h nach der Isolierung wurden 100 Inselchen in einer 12-Well-Platte für 1 h bei 37 ° C in Krebs-Ringer-HEPES-gepufferten Lösung, enthaltend 2,5 mM Glucose inkubiert. Inseln wurden dann mit Krebs-Ringer-HEPES bei 2,5 mM Glucose für eine zusätzliche Stunde, wonach der Überstand für Insulin-Messung gesammelt übertragen wurde unter Verwendung eines Two-Site immunspezifische enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) (Kristall Chem). Dieselben Inseln wurden anschließend Krebs-Ringer-HEPES-gepufferten Lösung, die 25 mM Glucose überführt und Insulinfreisetzung in das Medium wurde durch ELISA nach 1 Stunde Inkubation gemessen.

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</ol>

NDS, SAT, und RGM haben nichts zu offenbaren. Autor AGB wird durch VitaCyte beschäftigt. Autor RCM hat eine Beteiligung an VitaCyte.

Bei diesem Protokoll, haben wir unserem Verfahren zur Kanülierung, Collagenase Perfusion und Dissoziation des murinen Pankreas beschrieben, mit dem Ziel der Isolierung der Langerhans-Inseln. Technisch unserer Methode einmal gemeistert, sollte für Pankreas Isolierung innerhalb von 4 min euthanizing das Tier ermöglichen, und durch 1 Stunde sollte bei der Isolierung von Inselzellen aus einem einzigen Tier führen. Die Schnelligkeit der Technik erlaubt es uns, kleine Inseln aus bis zu 12 Mäusen in einem typischen Dehnung zu isolieren, wodurch die Isolation bis zu 3.000 Inselchen. Im Gegensatz zu anderen Protokollen, die rohen Zubereitungen von Kollagenase zu verwenden, bietet unser Protokoll die Verwendung von gereinigten Proteasen, CI Enzym Collagenase MA und CI Enzym Protease BP. Variationen in der Konsistenz von TDE Zubereitungen, die im Handel erhältlich sind, erfordert, dass jede Partie einzeln getestet und optimiert werden vor den allgemeinen Gebrauch. Diese Ware-zu-viel Variabilität führte uns zu nutzen puri betrachtenFied TDES von VitaCyte. Diese hochreinen TDES werden durch mehrere Verfahren, einschließlich der Verwendung von Fluoreszenz-markierten Substrat empfindlichen Assays charakterisiert. Die Fluoreszenz CDA Assay ist empfindlicher auf verschiedenen molekularen Formen von Kollagenase, die unterschiedliche Kinetik haben abbauenden nativen Kollagen. Historische Peptidsubstrat Assays bieten eine unvollständige Beurteilung der Kollagenase. Charakterisierung Kollagenase durch mehrere Methoden sorgt für mehr Enzymaktivität zwischen Lose. Basierend auf unseren in-house-Tests mit einer Vielzahl von Kollagenase Präparate im Handel erhältlich, fanden wir, dass die gereinigten Enzymkombinationen reproduzierbare lot-to-lot Ergebnisse erzielt. Die wichtigsten Vorteile der Verwendung von hoch gereinigten und konsequent gekennzeichnet TDES in dieser Anwendung einmal die optimale Enzymzusammensetzung definiert ist, wird das Los zu Los Leistung Konsistenz gewährleistet. Diese Konsistenz entfällt die arbeitsintensive Prozess der Partie Qualifikation normalerweise erforderlichfür Rohöl oder angereicherter Kollagenase Produkte. Gereinigtes TDES ermöglichen auch zusätzliche Modifikationen der Zusammensetzung auf den Ertrag und die Qualität der Inseln aus verschiedenen Mausstämmen wieder zu verbessern. Berichterstattung optimale Enzymzusammensetzungen zur Isolierung von Inselzellen aus verschiedenen Stämmen von Mäusen kann besser kommuniziert werden. Dies wiederum führt zu einer besseren Nutzung der Ressourcen und eine verbesserte Flexibilität in der experimentellen Design. Es gibt viele wichtige Schritte, die das Ergebnis von Insel Isolierungen mit unserem Protokoll beeinflussen können. Die erste ist die Notwendigkeit, einen wirksamen Aufblasens des Pankreas während der Perfusion der Enzymzubereitung erreicht. Es ist wichtig, um die Inflation mit sanfter Gewalt auf die Spritze zu starten, und erhöhen Sie die Kraft der Bauchspeicheldrüse aufbläst. Es ist hilfreich, um den Darm zu bewegen und heben die Bauchspeicheldrüse während der Inflation, so dass die Kollagenase durchblutet das gesamte Organ. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Kraft, mit der ein schüttelt die Rohre after Inkubation bei 37 ° C (Schritt 2.2). Wir haben festgestellt, dass Schütteln der Bauchspeicheldrüse hart gegen die Kappe der Röhre zu einer Aufsplitterung des Inselchen, aber ohne jegliche Form von mechanischen Dissoziation bei diesem Schritt Insel Erträge drastisch sinken. Es ist auch wichtig, dass während der Dissoziationsschritt mit der Spritze (Schritt 2.5), einer mittleren Ebene Kraft während des Auf-und Abbewegung mit dem Kolben angelegt wird, das eine ausreichende Gewebedissoziation vor dem Filterschritt (2,6), bei denen sehr kleine Gewebe sollte auf dem Teesieb Filter zurückgehalten werden. Schließlich ist der letzte Schritt, um genau zu befolgen das Streben der gesamten 20 ml der HISTOPAQUE fraktionierten Inselchen. Obwohl Inselzellen sind typischerweise an der Grenzfläche des HISTOPAQUE und HBSS haben wir gefunden, dass wir, wenn wir Inselchen verlieren, nur die Schnittstelle zu entfernen versucht, sondern wir jetzt entfernen gesamten 20 ml unter Verwendung einer großen Bohrung 25 ml Pipette. Wir fügten die Filtration durch das invertierte Filter 70 um (Schritt 2.11), die Notwendigkeit zu beseitigen, centrifuge die Inseln wieder abzuwaschen dem HISTOPAQUE.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td></td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> jeder </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 Naht 100 m Rolle </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g stumpfen Ende Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Vannas Superfine Sche </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Curved Federschere </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Zange (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Pinzette (bei 90 °) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 Zoll Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G 1/2 Zoll-Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Schlauch </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP Protease </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Spritze </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml Spritze </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um-Filter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 Petrischale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Plastic Teesieb </td><td> Jede Küche Versorgung </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Reagenzien und Geräte </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma XI (L010M8618) </td><td> MA (100.615) BP (110.329) </td><td> MA (081.104) BP (100.823) </td><td> MA (091.211) BP (101.109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 2. Durchschnitt islet Ausbeuten (± Standardabweichung) unter Verwendung unterschiedlicher TDE Lose * * Daten stellen Durchschnittswerte Insel Ausbeuten von mindestens 10 Mäusen. Lot Zahlen in Klammern </td></tr></tbody></table>

maus islet der langerhans isolation durch eine kombination von gereinigtem collagenase und neutral protease

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Die Vernehmung der Beta-Zellen die Genexpression und Funktion in vitro hat direkt über die Jahre aus der Studie von Nagetier tumorigenen Zelllinien zur Untersuchung von isolierten Nager Inseln verschoben. Primäre Inseln bieten den entscheidenden Vorteil, dass sie mehr getreues Bild der Biologie der intrazellulären Signalwege und sekretorischen Antworten. Während das Verfahren Inselisolierung mit gewebespezifischen dissoziierenden Enzyms (TDE) Zubereitungen ist gut in vielen Laboratorien etablierten 1-4, begrenzen Variationen in der Konsistenz von Inselzellen Ausbeute und Qualität von jedem beliebigen Stamm Nagetier das Ausmaß und die Machbarkeit der primären islet Studien. Diese Schwankungen treten häufig als Folge der teilweise gereinigten rohen TDES im Inselisolierung Verfahren verwendet; TDES zeigen häufig viel zu Charge Schwankungen in der Aktivität und erfordern oft Anpassungen der Dosis des eingesetzten Enzyms. Eine kleine Anzahl von Berichten verwendet gereinigten TDES für Nagerzelle Isolierungen 5, 6 </sup&gt;, aber die Praxis ist nicht trotz der routinemäßigen Einsatz und Vorteile von gereinigtem TDES für den menschlichen Inselzellen Isolierungen verbreitet. In Zusammenarbeit mit VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), entwickelten wir eine veränderte Maus Inselisolierung Protokoll auf, dass durch Gotoh 7, 8, in dem die TDES direkt in den Pankreasgang von Mäusen perfundiert, durch rohe Gewebe Fraktionierung durchgezogen beschriebenen Basis einen Histopaque Gradienten 9 und Isolierung des gereinigten Inselchen. Ein signifikanter Unterschied in unserem Protokoll ist die Verwendung von gereinigten Collagenase (CI Enzym MA) und neutrale Protease (CI Enzym BP) Kombination. Die Collagenase wurde durch die Verwendung eines 6-Fluoreszenz Kollagen abbauenden Aktivität (CDA)-Assay, Fluoreszenz-markierten löslichen Kalbshaut Fibrillen als Substrat 6 Verwendete ist. Dieses Substrat ist prädiktiven der Kinetik der Kollagen-Abbau in der Gewebe-Matrix, da es auf natives Kollagen setzt als Substrat. Die Protease war characterized mit einem Fluoreszenzfarbstoff kinetischen Assay 10. Mit Hilfe dieser verbesserten Assays zusammen mit mehr traditionellen biochemischen Analyse ermöglichen die TDE konsequenter hergestellt werden, was zu einer verbesserten Leistung Konsistenz zwischen Lose. Die hier beschriebene Protokoll wurde für maximale Ausbeute und Inselzellen optimale islet Morphologie mit C57BL / 6 Mäuse optimiert. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden mehrere Kombinationen von Kollagenase und neutrale Proteasen bei verschiedenen Konzentrationen untersucht, und die endgültige Verhältnis von Collagenase: neutralen Protease von 35:10 darstellt Enzymleistung vergleichbar Sigma Typ XI. Da signifikante Variabilität im Durchschnitt Insel Erträge aus verschiedenen Stämmen von Mäusen und Ratten berichtet worden, sollten zusätzliche Modifikationen der TDE Zusammensetzung hergestellt, um den Ertrag und die Qualität von Inseln aus verschiedenen Arten und Stämme wieder zu verbessern.

Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.

Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

Die Untersuchung der Genexpression und Funktion von Betazellen in vitro hat sich über die Jahre hinweg deutlich von der Untersuchung tumorigener Zelllinien von Nagetieren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Inseln aus der Bauchspeicheldrüse einer Maus erfolgreich zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Bauchspeicheldrüse vom umgebenden Gewebe abgetrennt wird. Anschließend wird der Gallengang kaniert, um die Bauchspeicheldrüse mit der Kollagenase-Protease-Mischung aufzublasen.Nach dem Aufblasen wird die Bauchspeicheldrüse entfernt und die Inseln vorsichtig dissoziiert. Abschließend werden die isolierten Inseln filtriert und für die spätere Verwendung ausgeplattet. Letztendlich dient diese Methode der Inselisolierung mit gereinigtem Kollagenase und neutraler Protease dazu, eine maximale Inselausbeute und optimale Inselmorphologie zu erzielen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der Augenmuskel-Isolierung liegt darin, dass wir die Lot-zu-Lot-Varianz durch die Verwendung gereinigter Enzyme eliminiert haben. Außerdem haben wir einige Protokolle verändert oder verbessert, um die Morphologie der Augenmuskeln zu optimieren. Nach der Tötung den Torso mit 70 %igem Ethanol bedecken, bevor die Bauchhöhle vollständig vom Anus bis zum Zwerchfell geöffnet wird.Stellen Sie die Maus anschließend auf das Podest eines Dissektionsmikroskops. Ziehen Sie das Zäkum und den aufsteigenden Dickdarm heraus und legen Sie sie außerhalb der Körperhöhle nach links. Verschieben Sie die Leberlappen gegen das Zwerchfell. Bleiben sie nicht von selbst an dieser Position, vergrößern Sie die Öffnung der Körperhöhle.Greifen Sie das Duodenum mit einer gekrümmten Pinzette und lokalisieren Sie das aus Arteria hepatica, Vena portae und Ductus choledochus bestehende Bündel, das zur Leber führt. Führen Sie mit einer weiteren gekrümmten Pinzette einen Faden unter das Arterien-Venen-Gang-Bündel ein und ziehen Sie ihn so nah wie möglich an der Leber fest.Unter Verwendung von zwei Paar gebogenen Pinzetten den Duodenum vorsichtig fassen und den an der Papille befestigten Ductus choledochus finden. An der Papille mit einer Zange der Pinzette durch die Bauchspeicheldrüse und das darunterliegende Bindegewebe direkt unterhalb des Ductus choledochus und nahe der Papille stechen. Schnell die Pinzette durch die Öffnung führen und eine Naht einführen. Die Naht locker um den Ductus choledochus legen, um mit einer 90-Grad-Pinzette einen kleinen Kreis zu bilden.Ziehen Sie den Dünndarm, bis der Gallengang straff ist. Führen Sie einen horizontalen Schnitt über die Papille mit äußerst feiner Schere durch, ohne den Gallengang von der Papille zu lösen, während Sie den Darm halten. Führen Sie eine Kanüle in den Gallengang ein und ziehen Sie dann den Faden vorsichtig fest um die Kanüle.Füllen Sie als Nächstes eine Drei-Milliliter-Spritze mit 2,0 Millilitern der Kollagenase-Protease-Mischung. Injizieren Sie diese Mischung langsam und gleichmäßig in die Kanüle. Nachdem die Aufblähung der Bauchspeicheldrüse abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kanüle aus dem Gallengang.Beginnend beim Descendens des Kolons, durchtrennen Sie das Bindegewebe, während Sie den Darm nach oben ziehen, bis der Ductus choledochus erreicht ist. Trennen Sie anschließend die Bauchspeicheldrüse von der Milz und dem umgebenden Gewebe. Schneiden Sie abschließend die Nähte durch und entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse.Nach der Entnahme das Pankreas in ein 50-Milliliter-Gefäß mit fünf Millilitern HBSS auf Eis geben. Sobald alle Proben gesammelt sind, alle 50-Milliliter-Gefäße mit Pankreasgewebe in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius stellen. Das Gefäß 15 Minuten lang sanft schütteln und auf eine Gewebedissoziation prüfen.Stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe leicht löst, indem Sie das Röhrchen am Deckel halten. Wirbeln Sie 12-mal, um das Gewebe weiter zu dissoziieren. Geben Sie nicht mehr als 30 Milliliter HBSS hinzu und zentrifugieren Sie. Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand und lassen Sie eine kleine Menge des Überstands am Boden zurück, um die Zellpalette nicht zu stören. Fügen Sie mit einer 30-Milliliter-Spritze, die an eine 14-Gauge-Nadel angeschlossen ist, nicht mehr als 10 Milliliter HBSS hinzu und aspirieren Sie die Suspension zweimal auf und ab. Filtern Sie das Zellgemisch durch ein plastisches T-Sieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie mit weiteren 10 Milliliter HBSS und zentrifugieren Sie. Gießen Sie das Überstandsvolumen ab und stellen Sie die Röhrchen zum Abtropfen auf ein saugfähiges Papiertuch umgedreht für eine Minute. Resuspendieren Sie jedes Röhrchen in 10 Milliliter.Kalt 1100. Seine opake Überlagerung, die opake mit 10 Milliliter HBSS und Zentrifuge. Entfernen Sie die gesamten 20 Milliliter Überstand mit einer großbohrigen 25-Milliliter-Pipette und leiten Sie den Überstand durch einen umgekehrten 70-Mikron-Filter.Filtern Sie die Augen direkt in eine Petrischale und spülen Sie sie durch Pipettieren von 10 Milliliter Augen-Medium durch die Filterkultur. Bewahren Sie die Augen im Gewebebrutinkubator auf, bis sie für Experimente bereit sind. Die Ausbeute, Morphologie und Qualität der Augen sind die allgemeinen Parameter, die zur Beurteilung des Erfolgs der Augenisolierung herangezogen werden.Hier ist die typische Augenlöcher-Morphologie dargestellt. Die Augenlöcher weisen eine runde bis längliche Form mit relativ einheitlicher Größe auf. Hier wurden isolierte Augenlöcher hinsichtlich der Glukose-stimulierten Insulinsekretion analysiert.Die Insulinstimulation war vergleichbar zwischen Augenringen, die mit Sigma Type 11 hergestellt wurden, und solchen, die mit ci zyme TM, MABP präpariert wurden, was auf eine hohe Qualität der Augenring-Präparation hinweist. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man einen murinen Gallengang katheterisiert. Arbeiten Sie mit zyme Kollagenase und neutro Proteasen, um Ihre Augenlider für jeden beliebigen Test zu isolieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Erfahren Sie die Isolation von Langerhans-Inseln aus der Mauspankreas mit gereinigtem Kollagenase-Neutral-Protease-Gemisch. Diese Methode maximiert die Ausbeute und verbessert die Morphologie für endokrinologische Forschung.

Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

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