Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Inseln aus der Bauchspeicheldrüse einer Maus erfolgreich zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Bauchspeicheldrüse vom umgebenden Gewebe abgetrennt wird. Anschließend wird der Gallengang kaniert, um die Bauchspeicheldrüse mit der Kollagenase-Protease-Mischung aufzublasen.

Nach dem Aufblasen wird die Bauchspeicheldrüse entfernt und die Inseln vorsichtig dissoziiert. Abschließend werden die isolierten Inseln filtriert und für die spätere Verwendung ausgeplattet. Letztendlich dient diese Methode der Inselisolierung mit gereinigtem Kollagenase und neutraler Protease dazu, eine maximale Inselausbeute und optimale Inselmorphologie zu erzielen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der Augenmuskel-Isolierung liegt darin, dass wir die Lot-zu-Lot-Varianz durch die Verwendung gereinigter Enzyme eliminiert haben. Außerdem haben wir einige Protokolle verändert oder verbessert, um die Morphologie der Augenmuskeln zu optimieren. Nach der Tötung den Torso mit 70 %igem Ethanol bedecken, bevor die Bauchhöhle vollständig vom Anus bis zum Zwerchfell geöffnet wird.

Stellen Sie die Maus anschließend auf das Podest eines Dissektionsmikroskops. Ziehen Sie das Zäkum und den aufsteigenden Dickdarm heraus und legen Sie sie außerhalb der Körperhöhle nach links. Verschieben Sie die Leberlappen gegen das Zwerchfell. Bleiben sie nicht von selbst an dieser Position, vergrößern Sie die Öffnung der Körperhöhle.

Greifen Sie das Duodenum mit einer gekrümmten Pinzette und lokalisieren Sie das aus Arteria hepatica, Vena portae und Ductus choledochus bestehende Bündel, das zur Leber führt. Führen Sie mit einer weiteren gekrümmten Pinzette einen Faden unter das Arterien-Venen-Gang-Bündel ein und ziehen Sie ihn so nah wie möglich an der Leber fest.

Unter Verwendung von zwei Paar gebogenen Pinzetten den Duodenum vorsichtig fassen und den an der Papille befestigten Ductus choledochus finden. An der Papille mit einer Zange der Pinzette durch die Bauchspeicheldrüse und das darunterliegende Bindegewebe direkt unterhalb des Ductus choledochus und nahe der Papille stechen. Schnell die Pinzette durch die Öffnung führen und eine Naht einführen. Die Naht locker um den Ductus choledochus legen, um mit einer 90-Grad-Pinzette einen kleinen Kreis zu bilden.

Ziehen Sie den Dünndarm, bis der Gallengang straff ist. Führen Sie einen horizontalen Schnitt über die Papille mit äußerst feiner Schere durch, ohne den Gallengang von der Papille zu lösen, während Sie den Darm halten. Führen Sie eine Kanüle in den Gallengang ein und ziehen Sie dann den Faden vorsichtig fest um die Kanüle.

Füllen Sie als Nächstes eine Drei-Milliliter-Spritze mit 2,0 Millilitern der Kollagenase-Protease-Mischung. Injizieren Sie diese Mischung langsam und gleichmäßig in die Kanüle. Nachdem die Aufblähung der Bauchspeicheldrüse abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kanüle aus dem Gallengang.

Beginnend beim Descendens des Kolons, durchtrennen Sie das Bindegewebe, während Sie den Darm nach oben ziehen, bis der Ductus choledochus erreicht ist. Trennen Sie anschließend die Bauchspeicheldrüse von der Milz und dem umgebenden Gewebe. Schneiden Sie abschließend die Nähte durch und entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse.

Nach der Entnahme das Pankreas in ein 50-Milliliter-Gefäß mit fünf Millilitern HBSS auf Eis geben. Sobald alle Proben gesammelt sind, alle 50-Milliliter-Gefäße mit Pankreasgewebe in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius stellen. Das Gefäß 15 Minuten lang sanft schütteln und auf eine Gewebedissoziation prüfen.

Stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe leicht löst, indem Sie das Röhrchen am Deckel halten. Wirbeln Sie 12-mal, um das Gewebe weiter zu dissoziieren. Geben Sie nicht mehr als 30 Milliliter HBSS hinzu und zentrifugieren Sie.

Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand und lassen Sie eine kleine Menge des Überstands am Boden zurück, um die Zellpalette nicht zu stören. Fügen Sie mit einer 30-Milliliter-Spritze, die an eine 14-Gauge-Nadel angeschlossen ist, nicht mehr als 10 Milliliter HBSS hinzu und aspirieren Sie die Suspension zweimal auf und ab. Filtern Sie das Zellgemisch durch ein plastisches T-Sieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie mit weiteren 10 Milliliter HBSS und zentrifugieren Sie. Gießen Sie das Überstandsvolumen ab und stellen Sie die Röhrchen zum Abtropfen auf ein saugfähiges Papiertuch umgedreht für eine Minute. Resuspendieren Sie jedes Röhrchen in 10 Milliliter.

Kalt 1100. Seine opake Überlagerung, die opake mit 10 Milliliter HBSS und Zentrifuge. Entfernen Sie die gesamten 20 Milliliter Überstand mit einer großbohrigen 25-Milliliter-Pipette und leiten Sie den Überstand durch einen umgekehrten 70-Mikron-Filter.

Filtern Sie die Augen direkt in eine Petrischale und spülen Sie sie durch Pipettieren von 10 Milliliter Augen-Medium durch die Filterkultur. Bewahren Sie die Augen im Gewebebrutinkubator auf, bis sie für Experimente bereit sind. Die Ausbeute, Morphologie und Qualität der Augen sind die allgemeinen Parameter, die zur Beurteilung des Erfolgs der Augenisolierung herangezogen werden.

Hier ist die typische Augenlöcher-Morphologie dargestellt. Die Augenlöcher weisen eine runde bis längliche Form mit relativ einheitlicher Größe auf. Hier wurden isolierte Augenlöcher hinsichtlich der Glukose-stimulierten Insulinsekretion analysiert.

Die Insulinstimulation war vergleichbar zwischen Augenringen, die mit Sigma Type 11 hergestellt wurden, und solchen, die mit ci zyme TM, MABP präpariert wurden, was auf eine hohe Qualität der Augenring-Präparation hinweist. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man einen murinen Gallengang katheterisiert. Arbeiten Sie mit zyme Kollagenase und neutro Proteasen, um Ihre Augenlider für jeden beliebigen Test zu isolieren.