Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

Ein

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein in vitro Modell zur Untersuchung der Axonregeneration von Säugetieren mit adulten Spinalganglienneuronen oder DRG-Neuronen zu etablieren. Dazu werden zunächst die DRGs von adulten Mäusen herauspräpariert, die dann in einzelne Zellen dissoziiert werden. Dann werden die dissoziierten Neuronen durch Elektroporation transfiziert und für einige Tage kultiviert, um ihre Genexpression genetisch zu manipulieren.

Der letzte Schritt besteht darin, die Neuronen für eine zusätzliche Kultur über Nacht zu resuspendieren und zu resuspendieren. Letztendlich wird die mikroskopiebasierte Axonlängenanalyse verwendet, um das Nachwachsen von Axonen von genetisch manipulierten Neuronen zu untersuchen. Der Hauptvorteil der Zellreanimationssuspension und der Wiederholung des Schritts, der bei dieser Technik verwendet wird, besteht darin, dass sie die Analyse des Axonwachstums von Neuronen ermöglicht, die bereits genetisch manipuliert wurden.

Diese Technik ist besonders nützlich für Funktionsverluststudien, in denen der RNI-Ansatz verwendet wird, um das interessierende Gen herunterzuregulieren, was das Verfahren demonstriert, wird Dr. Sfu, ein Postdoc-Stipendiat aus meinem Labor, sein. Um die Abdeckfolien für die neuronale Kultur vorzubereiten, baden Sie diese zunächst über Nacht in 10%iger Salzsäure. Am nächsten Tag erhitzen Sie sie eine Stunde lang in destilliertem Wasser.

Lagern Sie die gereinigten Deckgläser in drei 20-Minuten-Segmenten in 70%igem Ethanol und lassen Sie sie vor dem Gebrauch an der Luft trocknen. Als nächstes die getrockneten Deckgläser beschichten. Richten Sie eine Multi-Well-Platte mit einem Schlicker und 100 Mikrolitern Beschichtungslösung pro Well ein.

Inkubieren Sie die Platten ohne Rühren für ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Beschichtungslösung und waschen Sie die Einbandslips dreimal mit sterilem XPBS. Nach der Opferung einer vollständig betäubten sechs bis 10 Wochen alten erwachsenen Maus, die nicht auf schmerzhafte Empfindungen reagierte.

Entfernen Sie zuerst die Rückenhaut. Zweitens, schneiden Sie alle Wirbel vom Hals bis zum Schwanz frei, einschließlich des anhaftenden Gewebes. Entfernen Sie abschließend alle inneren Organe, die an der Innenseite des Gewebes befestigt sind.

Spülen Sie die entfernte Wirbelsäule zwei- bis dreimal mit einem XPBS und stecken Sie sie dann mit der Bauchseite nach oben an eine Präparierplatte. Entfernen Sie vorsichtig die Muskeln, um die sensorischen Nerven freizulegen. Die Nerven, die mit den DRGs auf Lendenwirbelsäule verbunden sind, sind am dicksten und leicht zu lokalisieren.

Daher werden bei den meisten Experimenten nur die lumbalen DRGs entnommen. Schneiden Sie mit einer kleinen Schere durch jeden Wirbel entlang der Mittellinie und entfernen Sie vorsichtig die Bandscheiben, um die Wirbel zu isolieren. Beginnen Sie bei L eins, verwenden Sie eine Pinzette, um jeden Wirbel zu spalten und die lumbalen DRGs zu präparieren.

Lokalisieren Sie die DRGs mit einer Pinzette, indem Sie jeden Lendennerv in Richtung Rückenmark verfolgen. Wiederhole diesen Vorgang für L zwei bis L sechs. Schneiden Sie anschließend mit einer Federschere die dorsalen und ventralen Wurzeln des peripheren Nervs von den isolierten DRGs ab.

Lagern Sie die DRGs in einem gekühlten 1,5-Milliliter-Zündrohr, das bei Bedarf mit em EM-Medium gefüllt ist. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um DRGs aus anderen Wirbelsäulenebenen zu gewinnen. Nachdem Sie alle DRGs gesammelt haben, ersetzen Sie das MEM-Medium durch einen Milliliter, kollagenasieren Sie eine Lösung und inkubieren Sie die DRGs 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Ersetzen Sie anschließend die Kollagenase-A-Lösung durch 500 Mikroliter einer x triple E Express-Aufschlusslösung und stellen Sie die Röhrchen nach dem zweiten Aufschluss für weitere 15 bis 20 Minuten in den Inkubator zurück. Waschen Sie die DRGs, indem Sie die Lösung durch einen Milliliter vorbereitetes Medium mit 5 % FBS ersetzen, schwenken Sie die DRGs und lassen Sie sie absetzen. Wiederholen Sie diese Wäsche.

Führen Sie zwei Schritte aus, bevor Sie fortfahren. Nachdem Sie die letzte Wäsche entfernt haben, fügen Sie 600 Mikroliter Nährmedium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um das Gewebe zu tripieren. Tun Sie dies 20 bis 30 Mal mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze, nachdem Tri das nicht dissoziierte Gewebe auf den Boden des Mikrofuge-Röhrchens abgesetzt hat.

Geben Sie nur die Zellsuspension in ein steriles 10-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie weitere 600 Mikroliter Kulturmedium hinzu. Wiederholen Sie den Tri-Schritt, bis die meisten Gewebe dissoziiert sind. Die Suspension enthält sowohl Neuronen als auch nicht-neuronale Zellen.

In der Regel werden etwa 50.000 Zellen von sechs dgs gesammelt, die für eine Elektroporationsreaktion ausreichen, die dissoziierten Zellen von sechs dgs zentrifugiert und so viel Überstand wie möglich verworfen. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Transfektionslösung, die DNA-Plasmid oder SI-RNA enthält, mit drei bis vier sanften Bewegungen durch eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze. Übertragen Sie die Suspension in eine Elektroporation, vetieren und elektroporieren Sie die Zellen nach der Elektroporation.

Geben Sie sofort 500 Mikroliter warmes Kulturmedium, das FBS enthält, in die Vete. Für die meisten Experimente, die eine Resus-Suspensions- und Replattierungskultur erfordern, werden die Neuronen auf einer Kunststoffkulturschale bei 10 bis 20.000 Zellen pro Vertiefung gehalten. Um das Axonwachstum jedoch direkt nach der Elektroporation zu untersuchen, können die Neuronen direkt auf beschichtete Glasdeckgläser mit drei bis 5.000 Zellen pro Vertiefung plattiert werden.

Nach vier Stunden Zellkultur haben sich die Neuronen an das Substrat anheftet. Ersetzen Sie das mit Transfektionslösung verunreinigte Medium vorsichtig durch 500 Mikroliter frisch erwärmtes Medium und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Die Analyse der Genexpression aus DNA-Plasmiden ist bereits wenige Stunden nach der Elektroporation möglich.

Um jedoch die Herunterregulierung der Genexpression im neuen axonalen Wachstum zu analysieren, ist eine längere Kultivierungszeit erforderlich. Nach drei Tagen Kultur auf den Platten mit hoher Dichte ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter vorgewärmtes frisches Medium und spülen Sie die Neuronen mit sechs bis 10 sanften Pipettenbewegungen in Lösung. Dann bleiben nicht-neuronale Zellen an der Platte haften, übertragen die resuspendierten Neuronen auf eine Mikroröhre und t-T sie sanft 10 bis 15 Mal, um die Zellklumpen zu dissoziieren.

Um eine einfachere Anwendung der Suspension des angehängten Neurons nach drei Tagen in Kultur zu gewährleisten, ist die Beschichtung der Kulturschale vor der ersten Kultur auf nur 1, 2, 3 Stunden begrenzt. Während der S-Aufhängungsschritte kontrollieren wir die Zellen in der Regel ständig unter einem inversen Mikroskop, um zu beobachten, ob sich die Zellen von der Kulturschalenplatte gelöst haben. Die Neuronen auf neu präparierten Deckfolien mit geringer Dichte am nächsten Tag analysieren die neuen axonalen Wucherungen.

In Abwesenheit von zugesetzten extrazellulären Wachstumsfaktoren beginnen die adulten DRG-Neuronen in der Regel mit dem Wachstum von Axonen. 48 Stunden nach der ersten Beschichtung zeigen die Axone oft verzweigte Morphologien. Im Gegensatz dazu beginnen die plattierten Neuronen nur wenige Stunden nach der Plattierung mit der Verlängerung der Axone und die Axone verlängern sich mit reduzierter Verzweigung.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass plattierte Neuronen ähnliche Eigenschaften aufweisen wie regenerierende Neuronen in vivo. Unter Verwendung dieses Ansatzes wurde eine Funktionsverluststudie verwendet, um die Rolle von Axonregenerations-assoziierten Transkriptionsfaktoren zu untersuchen. siehe JU beim Axonwachstum von adulten DRG-Neuronen. In vitro.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Elektroporation einer Gruppe von vier verschiedenen Irna, die auf verschiedene Regionen von cgen abzielen, die Proteinspiegel von cgen in adulten DRG-Neuronen deutlich reduziert. Drei Tage nach der Transfektion, als die Neuronen über Nacht neu plattiert und kultiviert wurden, war das Axonwachstum von cgen-Knockdown-Neuronen signifikant reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass kultivierte adulte DRG-Neuronen ein nützliches Modellsystem zur Untersuchung des Axonwachstums von adulten Neuronen darstellen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Sezieren, Transfektieren und Kultur durchführt. Erwachsene müssen auch Ganglienneuronen wurzeln, um die Regeneration von Membranunfällen in vitro zu untersuchen.