Microdialysis Ethanol während operante Ethanol Selbstverwaltung und Ethanol Bestimmung durch Gaschromatographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Ethanolspiegel im Hirndialysat während einer Ethanol-Selbstverabreichungssitzung zu überwachen. Um diese Maßnahme mit synchronen Selbstverabreichungsverhaltensweisen zu vergleichen, wird dies zunächst durch die chirurgische Implantation einer Mikrodialyseanleitung, einer Kanüle und eines Haltebolzens erreicht und dann die Ratten darauf trainiert, sich operativ selbst Ethanol zu verabreichen. Der zweite Schritt besteht darin, die Ratten an das Kopfstadium zu gewöhnen, damit die Selbstverabreichung von Ethanol während der Mikrodialyse nicht behindert wird.

Dann wird die Mikrodialyse während einer Ethanol-Selbstverabreichungssitzung durchgeführt, bei der ein Teil des Dialats für die Ethanolanalyse vorbereitet wird. Anschließend werden die Dialatproben mit einem Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektion auf Ethanolkonzentration analysiert. Letztendlich zeigen die erhaltenen Ergebnisse den zeitlichen Verlauf des Erreichens von Ethanol in die interessierende Gehirnregion während einer Ethanol-Selbstverabreichungssitzung

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Schwanz- oder Stammvenenpunktion besteht darin, dass dieses Verfahren zum Zeitpunkt der Probenentnahme nur minimal störend ist und eine Medikamentenmessung im Laufe der Zeit in der interessierenden Gehirnregion ermöglicht, während das Tier eine Verhaltensaufgabe ausführt. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie eine Reihe von spezialisierten Fähigkeiten erfordert, von denen viele nur durch wiederholtes Üben oder Erleben erworben werden können. Jeffrey Dilley, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in unserem Labor, wird das Verfahren ebenfalls demonstrieren.

Alle gezeigten Tierverfahren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas genehmigt und befolgen alle Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die University of Texas in Austin ist eine ALAC-akkreditierte Einrichtung. Gut behandelte lange Evans-Ratten, die chirurgisch mit einer 21-Gauge-Kanüle über der interessierenden Gehirnregion implantiert wurden, werden für diese Verhaltensmikrodialyse-Experimente verwendet. Alle Tiere sollten mindestens eine Woche postoperative Pflege und Genesung erhalten und gesund sein, bevor sie mit den folgenden Eingriffen beginnen.

Setzen Sie die Ratte in eine operante Kammer von med associates, die mit einem einziehbaren Lichterhebel und einem Kipprohr ausgestattet ist, und trainieren Sie sie, den Hebel zu drücken, um Zugang zu einer 10%igen Saccharoselösung zu erhalten. Nachdem die Ratte darauf trainiert wurde, auf die Saccharoselösung zu reagieren, beginnen Sie sie mit einem geeigneten Trainingsplan, bei dem Ethanol in der Nacht vor der vorletzten operanten Sitzung über mehrere Trinksitzungen hinweg allmählich in die Lösung gegeben wird. Nachdem Sie das Tier betäubt und den Grad der Sedierung überprüft haben, befestigen Sie die Haltefeder an der Haltebolzen am Kopftisch der Ratte, um sie an das Gerät zu gewöhnen, das aus einem Gegengewichtshebel, einem Arm, einem Drehseil, einer Feder und einem Ringständer besteht.

Lassen Sie die Ratte die Nacht im Operantenraum in ihrem Heimkäfig mit Ad Lido, Futter und Wasser verbringen und absolvieren Sie dann die Trainingseinheit am nächsten Tag mit der Leine und den Begleitgeräten, die am Tag vor dem Mikrodialyseexperiment an Ort und Stelle sind. Nach der Betäubung der Ratte mit Isof-Fluor ist die Sedierung zu überprüfen, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen und eine Mikrodialysesonde einführen, die mit künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit durchblutet ist. Befestigen Sie die Sonde entsprechend und stellen Sie dann die Durchflussrate der Sonde auf 0,2 Mikroliter pro Minute ein.

Setzen Sie die Ratte in ihren Heimkäfig im operanten Raum, um die Nacht mit allen Dialysegeräten zu verbringen, und fügen Sie Lib, Futter und Wasser hinzu. Drehen Sie die Sonde am Tag nach dem Einsetzen der Sonde mindestens zwei Stunden vor Beginn des Experiments auf ihre Arbeitsdurchflussrate auf. Prüfen Sie mit einer Hamilton-Spritze, ob die Durchflussrate der Sonde konstant ist und mindestens 90 % der eingestellten Durchflussrate beträgt.

Bei der Bewertung von Neurotransmittern in den Dialyseproben ist in allen Phasen des Experiments Proben zu entnehmen. Beginnen Sie mit der Entnahme von Dialyseproben, während sich das Tier in seinem häuslichen Käfig befindet. Lagern Sie die Proben für eine spätere Analyse in geeigneter Weise.

Bringen Sie die Ratte vorsichtig in die operante Kammer und starten Sie das operante Programm, das die Kammer steuert. Fahren Sie mit der Probenentnahme fort, während die Ratte darauf wartet, dass der Hebel zwei Proben in die Kammer hineinragt, bevor sich der Hebel ausfährt. Beginnen Sie mit der Entnahme eines Teils jeder Dialysatprobe für die Ethanolanalyse, indem Sie ein geeignetes Aliquot Dialysat in ein Zwei-Milliliter-Glasfläschchen pipettieren und das Fläschchen mit einem luftdichten Septum verschließen, pipettieren und die Ethanolproben schnell verschließen.

Da Ethanol flüchtig ist und das Probenvolumen klein ist, führt eine inkonsistente oder langsame Probenvorbereitung zu ungenauen Ergebnissen. Bewahren Sie den Rest für die Neurotransmitteranalyse auf. Die 20-minütige Trinkperiode beginnt, nachdem das Computerprogramm von Med Associates den Hebel in die Kammer ausfährt und die Ratte ihn drückt, um Zugang zu einer Flasche mit Trinklösung zu erhalten.

Entnahme von Proben während der gesamten Trinkperiode Nach der Trinkperiode zieht das Computerprogramm die Flasche aus der Kammer zurück. Lassen Sie das Tier am Ende des Mikrodialyseexperiments weitere 20 Minuten nach dem Trinken in der Kammer. Nachdem Sie die Ratte betäubt haben, entfernen Sie die Sonde.

Wenn das Tier nicht sofort auf humane Weise eingeschläfert wird, ersetzen Sie den Obterator, um die Sichtbarkeit des Sondentrakts zu gewährleisten. Sammeln Sie das Gehirn innerhalb von drei Tagen nach dem Experiment. Analysieren Sie die Proben zusammen mit externen Ethanolstandards mit einem Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektor, einem auf 50 Grad Celsius erhitzten Headspace-Autos-Probenehmer und einer Kapillarsäule mit Helium als mobiler Phase.

Verwenden Sie für die Aufzeichnung und Analyse der Chromatogramme eine Chromatographie-Workstation-Software, um das System für die Ethanolanalyse vorzubereiten. Verwenden Sie ein Umlaufwasserbad, um die Probenehmerplatte des Autos zu erhitzen und die Luft- und Wasserstofftanks zu öffnen. Starten Sie als Nächstes das Startprogramm.

Wenn es fertig ist, initiieren Sie eine 20-minütige Verbrennung, die die Faser dekontaminiert. Mit einem 100-Milliliter-Messkolben werden 238 Mikroliter 95%iges Ethanol mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 Millilitern verdünnt. Verwenden Sie eine serielle Eins-zu-Eins-Verdünnung, um Standards zu erstellen.

Pipettieren Sie die Standards in Glasfläschchen und verschließen Sie sie genau so, wie die Proben vorbereitet wurden. Stellen Sie sicher, dass Sie einen Wasserblank zusammen mit Ihren Standards laufen lassen. Legen Sie die Standards und Proben in die Probenehmerschale und erhitzen Sie sie, bis das gesamte flüssige Aliquot verdampft ist.

Um die Standards und Proben auszuführen, erstellen Sie eine Beispielliste, in der Sie angeben, welche Probe sich in welchem Slot des Autosamplers befindet, und dass jede Probe durchstochen werden soll. Nachdem Sie die Datendateien an einen ausgewählten Ordner weitergeleitet haben, wählen Sie eine Methode Ihrer Wahl für die Beispiele aus, und beginnen Sie mit der Ausführung. Nachdem das System die Samples durchlaufen hat, überprüfen Sie, ob das Programm jeden Peak korrekt integriert hat.

Plot, die Peakhöhe in Abhängigkeit von jedem bekannten externen Standard. Ethanol-Konzentration. Verwenden Sie die lineare Funktion, die durch die Punkte gegeben ist, um die Ethanolkonzentration jeder Dialysatprobe zu interpolieren.

Diese Abbildung zeigt Beispiel-Chromatogramme für drei Konzentrationen von Ethanolstandards und eine für eine Rattendialysatprobe, die am Ende der Ethanol-Selbstverabreichungssitzung entnommen wurde. Ethanol-Peaks sollten relativ symmetrisch sein, konsistente Retentionszeiten und ein Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als 10 haben. Die Nichterfüllung dieser Kriterien bedeutet, dass das System gewartet, qualitativ hochwertige Chromatographie benötigt und korrekt Standards erstellen eine lineare Standardkurve, die zur Berechnung der Ethanolkonzentration von Dialysatproben verwendet wird, die von Tieren entnommen wurden, die sich selbst Ethanol verabreicht haben, im Laufe ihrer Selbstverabreichung.

Die abgeleiteten Dialysat-Ethanol-Konzentrationen sind nicht für die In-vivo-Sondengewinnung korrigiert und betragen nur einen Bruchteil der Ethanol-Gewebekonzentration im Gehirn. Wenn eine quantitative Mikrodialyse von Ethanol erforderlich ist, wird die Extraktionsfraktion von Ethanol, die aus dem extrazellulären Raum in die Sonde diffundiert, experimentell bestimmt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Dies hängt von der Länge der Verhaltenssitzung ab. Der erfolgreiche Abschluss der Mikrodialysephase des Experiments hängt stark von der Qualität der Vorbereitungsphasen ab. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sicherzustellen, dass Ihre Ratten gut behandelt werden und dass Sie sie an möglicherweise störende Reize gewöhnt haben, die während des Dialyseexperiments auftreten könnten, damit das Selbstverabreichungsverhalten des Tieres nicht beeinträchtigt wird.