Herstellung und Verwendung von Mikroumgebung Microarrays (MEArrays)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen unterschiedlicher Mikroumgebungen auf zelluläre Funktionen adhärenter Zelltypen zu messen, indem diese parallel einer vielfältigen Sammlung von Combinator-Mikroumgebungen ausgesetzt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Drucksubstrate hergestellt werden, die die Absorption von Mischungen mikroumgebungsbezogener Proteine ermöglichen. Anschließend werden Masterplatten mit mikroumgebungsbezogenen Proteinen vorbereitet, die verwendet werden, um ME-Arrays mittels eines Mikroarray-Druckroboters mit Füllfeder oder Kapillarpin zu drucken.

Als Nächstes werden Hauptplatten mit mikroumgebungsbezogenen Proteinen hergestellt. Anschließend werden adhärente Zellen auf dem ME-Array kultiviert, wobei die Zellanzahl begrenzt werden kann. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen den Einfluss der verschiedenen Mikroumgebungen auf zelluläre Funktionen wie Differenzierung oder Proliferation, basierend auf der Immunfluoreszenzanalyse.

Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir die Auswirkungen von Gewebemikroumgebungen auf das Zell-Schicksal von menschlichen Gedächtnis-Stammzellen quantifizieren wollten, doch dann wurde uns bewusst, dass die Arbeit in vivo unmöglich ist. Mittlerweile, da die Methode weiterentwickelt ist, bietet sie zahlreiche Anwendungen in der Zellbiologie, der Forschung und der Wirkstoffentdeckung. PDMS wird als Substrat verwendet, das steifere Gewebe nachahmt, da es kostengünstig, einfach in der Herstellung und leicht bedruckbar ist.

Allerdings kann die Hydrophobizität von PDMS bei der Arbeit mit PDMS-Chips mit einigen Zelllinien unverträglich sein. Nichtlatex-Handschuhe verwenden, da Latex die PDMS-Polymerisation hemmen kann. Um zu beginnen, in einem Einweg-Kunststoffbecher die Silikonelastomer-Grundmasse Sylgard 184 mit dem Härter im Verhältnis 10 zu 1 mischen und kräftig mit einem Holz- oder Plastikspatel verrühren.

Als Nächstes entgasen Sie die Mischung 30 Minuten lang in einer Vakuumglocke bei Raumtemperatur. Zentrieren Sie nun einen standardmäßigen Objektträger auf der angetriebenen Vakuumspannvorrichtung einer Spin-Coater-Maschine, geben Sie 0,5 Milliliter des gemischten Elastomer-Polymers in die Mitte der Oberfläche des Objektträgers und beschichten Sie durch Schleudern bei 6.000 U/min für 60 Sekunden. Aushärten Sie die mit PDMS beschichteten Objektträger bei 70 Grad Celsius für vier Stunden bis über Nacht.

Die Objektträger können luftdicht bei Raumtemperatur mehrere Monate lang gelagert werden. PA ist ein Hydrogel, das weichere Gewebe im Bereich nachahmen kann; PA-Zellen heften sich nur an Stellen an, an denen Proteine vorhanden sind, die die Zelladhäsion unterstützen. Beginnen Sie damit, die Objektträger mit Natriumhydroxid zu ätzen.

Legen Sie die Objektträger auf einen Heizblock bei 80 Grad Celsius. Geben Sie einen Milliliter 0,1 normale Natronlauge auf jeden Objektträger. Achten Sie darauf, die gesamte Oberfläche des Objektträgers zu bedecken, andernfalls schlägt die PA fehl.

Lassen Sie das Natriumhydroxid verdunsten, wodurch ein weißer Belag zurückbleibt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, falls die Oberfläche nicht vollständig bedeckt ist. Der Objektträger kann bei Bedarf mehrere Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.

Als Nächstes beschichten Sie die Objektträger mit einem PES in einem Abzug. Legen Sie die Objektträger in eine 15-Milliliter-Schale und geben Sie 300 Mikroliter eines PES auf jeden mit Natriumhydroxid geätzten Objektträger.

Lassen Sie das A PES fünf Minuten lang genau mit den Natriumhydroxid-Plättchen reagieren. Nicht länger. Spülen Sie das A PES gründlich zwei bis drei Mal beidseitig der Plättchen mit entionisiertem Wasser aus.

Andernfalls wird es im nächsten Schritt zu einer braunen Ablagerung auf den Objektträgern oxidieren. Nun alle Lösungen von den Oberflächen der Objektträger in jede Schale absaugen. 25 Milliliter 0,5 % Glutaraldehyd in PBS hinzufügen.

Stellen Sie die Objektträger im Dunkeln und warten Sie 30 Minuten. Nach 30 Minuten saugen Sie die gesamte Glutaraldehydlösung von der Oberfläche der Objektträger ab. Danach trocknen Sie die Objektträger vorsichtig mit fusselfreiem Reinigungspapier ab.

Die Objektträger können nun bei Bedarf über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Nachdem die PA-Gemische hergestellt und entgast wurden, stellen Sie sie auf Eis, um die Polymerisation zu verlangsamen. Unmittelbar vor der Herstellung der Objektträger geben Sie zu jedem Gemisch auf Eis Ammoniumpersulfat und TEMED zu und pipettieren diese fünf bis zehn Sekunden lang.

Pipettieren Sie nun die PA-Mischung auf die Objektträgerflächen. Die Menge an PA variiert je nach erforderlicher Gelhärte. Anschließend legen Sie Deckgläser ohne Druck auf das PA, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.

Lassen Sie das PA-Gel zwei Stunden lang polymerisieren und entfernen Sie anschließend die Deckgläser unter destilliertem Wasser. Waschen Sie die PA-Gel-Objektträger über Nacht in großen Coplin-Gläsern mit Wasser. Um am nächsten Tag die nicht reagierenden Acrylamide zu entfernen, trocknen Sie die Objektträger, bis das PA-Gel vollständig ausgehärtet ist.

Die Objektträger können anschließend für einen Monat bei vier Grad Celsius in einer verschlossenen Objektträgerbox aufbewahrt werden. Zunächst wird eine Kunststoffkammer verwendet, um das gedruckte Array von einer Zweikammer-Objektträgerplatte zu umschließen. Entfernen Sie die Kammern und schneiden Sie sie mit einem Rasiermesser in zwei Hälften.

Verwenden Sie eine Pipettenspitze mit einem Milliliter, um eine dünne Perle aus Aquariensilikon auf die Kante einer Kammer aufzutragen, und drücken Sie diese auf die Oberfläche eines Emmy-Arrays. Vermeiden Sie es, das Silikon mit irgendwelchen Bestandteilen der Array-Strukturen in Berührung zu bringen. Eine sichere Befestigung der Kulturkammern am Emmy-Array ist entscheidend, da Undichtigkeiten an den Befestigungsstellen ein Austreten des Kulturmediums aus den Kammern ermöglichen, was zu einem weitverbreiteten Zelltod führen kann.

Für PDMS-beschichtete Objektträger die Objektträger durch 15-minütiges Inkubieren unter Vakuum in wässriger 1%iger F 108 für beide Geltypen blockieren, die Arrays dreimal für jeweils fünf Minuten mit Zellkulturmedium mit Antibiotika waschen. Dadurch werden nichtreaktive Monomere entfernt, die im Fall von PA-Gelen für die Zellen toxisch sein können. Nach dem dritten Waschgang eine zusätzliche 30-minütige Inkubation im Medium zulassen, um das Gel erneut mit Feuchtigkeit zu versorgen.

Platzieren Sie nun vier bis fünf Arrays in eine sterile Petrischale mit 15 cm Durchmesser. Geben Sie der Schale die Hälfte des endgültigen Mediumvolumens mit den Zellen der gewünschten Art in der für die Anwendung erforderlichen Konzentration hinzu. Die ME-Arrays sollten in einen Inkubator gestellt werden, der für die Aufrechterhaltung des verwendeten Zelltyps geeignet ist.

Überprüfen Sie alle 15 bis 20 Minuten unter dem Mikroskop die gleichmäßige Anheftung der Zellen an die gedruckten Strukturen. Schütteln Sie die ME-Arrays vorsichtig, um angeheftete und schwimmende Zellen zu unterscheiden. Die Anheftungszeit variiert, ist jedoch typischerweise innerhalb von zwei Stunden auf einem PA-codierten ME-Array abgeschlossen.

Nach Erreichen der Anheftungssättigung oder einer zeitlichen Begrenzung saugen Sie die nicht gebundenen Zellen ab und füllen die Schale auf das endgültige Volumen auf PDMS-beschichteten ME-Arrays auf. Das vollständige Entfernen des gesamten Mediums würde die Zellen abtöten. Führen Sie deshalb bei allen Mediumwechseln auf diesen Arrays nacheinander einen halben Mediumvolumenaustausch durch und füllen Sie die Schale anschließend auf das endgültige Volumen auf.

Das Kultivieren kann über mehrere Tage unter normalen Mediumwechseln fortgesetzt werden. Gängige Fixiermittel wie Paraform, Aldehyd und Methanol-Aceton sind mit den Emmy-Array-Systemen kompatibel. Vergessen Sie nicht, dass ME-Arrays auch bei der Färbung von PDMS-beschichteten Arrays stets feucht gehalten werden müssen.

Fahren Sie daher mit der Technik des halbvolumigen Austauschs fort, um Objektträger der gefärbten ME-Anordnungen herzustellen. Entfernen Sie die Kammer mit einem Rasiermesser und montieren Sie die Deckgläser mit Flora. Das Montage-G-Protein wurde mittels quadratisch abgeschlossener Siliziumnadeln auf einer Quill-Nadel auf einem bedruckten PDMS-codierten ME-Array abgeschieden.

Die Deposition verschiedener Proteine durch einen Mikroarray-Druckroboter wurde mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern überprüft. Die Verdünnungen der Proteidlösungen in der Masterplatte spiegelten die Menge wider, die auf der Drucksubstratoberfläche abgeschieden wurde; Zellen hefteten sich auf offensichtliche, gemusterte Weise an die gedruckten Strukturen. Ebenso tritt dasselbe offensichtliche Muster der Zelladhäsion auf, wenn ein Emmy-Array im Maßstab von 40.000 Durchgängen gedruckt wird.

Zwei Proteine der Mikroumgebung in PA-Gelen induzierten konzentrationsabhängige Keratin-Expressionsprofile in einer humanen multipotenten Brustepithel-Vorläuferzelllinie. Das Log-Verhältnis der Keratin-acht-Signale zu den Keratin-14-Signalen veranschaulicht die Variation und Reproduzierbarkeit des Signals. Nach 24-stündiger Kultur werden nicht gebundene Zellen in einer Analyse von 12 Me-Arrays weggespült.

Es wurden standardmäßige statistische Analysen verwendet, um zu bestimmen, ob die verschiedenen Verdünnungen von Typ-I-Kollagen und rekombinantem menschlichem p-Cadherin Kostenänderungen in der Keratinexpression verursachen. Zunächst zeigte sich keine Abweichung vom Mittelwert bei den Zellen auf den Strukturen unmittelbar nach der Anheftung. Nach 24 Stunden führten jedoch hohe Konzentrationen von Typ-I-Kollagen zu einer signifikant stärkeren Expression von Keratin 8.

Während hohe PCA-Konzentrationen hierin ein starkes Keratin-14-Signal hervorriefen. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Berichten über bipotente Gedächtnis-Progenitorzellen überein. Aufgrund der dynamischen und wechselseitigen Natur dieser Wechselwirkungen zwischen Zellen und Mikroumgebung können die Zellen selbst die Zusammensetzung der gedruckten Mikroumgebungen verändern.

Daher sollte die Expositionszeit, um die akuten Auswirkungen der von Ihnen gedruckten Mikroumgebungen zu verstehen, 48 Stunden nicht überschreiten. Nach dieser Vorgehensweise kann jeder messbare Vorgang, fluoreszenz- oder farblich detektierbar, als Funktion der Mikroumgebung genutzt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie verändern unterschiedliche Mikroumgebungen die Arzneimittelreaktionen in Krebslinien? Dies geschieht hauptsächlich durch Veränderungen in Apoptose und Proliferation.

Oder wie verändern Mikroumgebungen die Differenzierung von Vorläuferzellen.