Eine optimierte Methode für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Isolierung von Autonomic neuralen Vorläuferzellen aus inneren Organen des Fötus Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Population von gereinigten neuronalen Vorläuferzellen aus Ganglien des peripheren Nervensystems abzuleiten. Dies wird erreicht, indem zuerst das Organ oder bestimmte Ganglien von Interesse von fötalen Mäusen präpariert werden. Die Gewebe werden dann teilweise dissoziiert, um die einzelnen Zellen in das umgebende Medium freizusetzen.

Anschließend wird die Zellsuspension filtriert, um Gewebeklumpen oder große Aggregate zu entfernen. Schließlich wird die Zellsuspension flusssortiert, um die interessierende Population basierend auf der Expression eines fluoreszierenden Reporters in dieser Zellpopulation zu isolieren. Letztendlich können Genexpressionsmuster zwischen Vorläuferzellen verglichen werden, die in verschiedenen Entwicklungsstadien isoliert wurden, oder zwischen gereinigten Populationen verschiedener neuronaler Zelltypen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Isolierung von Zellpopulationen auf der Grundlage der Antikörpermarkierung besteht darin, dass Immunreagenzien oft nicht verfügbar sind. Durch die Markierung von Zellen, die ein bestimmtes Gen exprimieren, ermöglichen gentechnisch veränderte Linien von Mäusen, die fluoreszierendes Protein in diskreten neuronalen Untergruppen produzieren, die Isolierung dieser Zellpopulationen. Während wir diese Methode für die Isolierung von neuralen Vorläuferzellen aus dem Darm und der Neurogenspur des Mundes demonstrieren, kann sie auch auf andere Modellsysteme angewendet werden, die fluoreszierende Reporter exprimieren.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da sie dazu neigen, das Quellgewebe zu überverdauen, was zu einem Verlust der Zelllebensfähigkeit führt. Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, betrachten Sie die Embryonen durch Hellfeldbeleuchtung, um sicherzustellen, dass die relevanten Strukturen scharf sind. Identifizieren Sie dann die transgenpositiven Embryonen, indem Sie mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop auf Expression des fluoreszierenden Reporters untersuchen.

Nach der Einschläferung beginnen die Embryonen damit, eine minimale Menge PBS in die Sezierschale zu geben, damit der Embryo nicht schwimmt, während das Gewebe präpariert wird. Öffnen Sie die Haut des Embryos entlang der Seiten des Körpers und quer über den Bauch auf Höhe der Leber. Rollen Sie den Embryo auf den Rücken und befestigen Sie ihn mit einer feinen Pinzette.

Führen Sie auf Höhe der Vordergliedmaßen eine weitere Pinzette auf Höhe des Zwerchfells ein, und dann zügig. Ziehen Sie die inneren Organe nach unten zum Schwanz und weg von der dorsalen Körperwand, um die Eingeweide von der Leber bis hinunter zum Genitaltuberkel zu entfernen. Wenn Organe aus der Brusthöhle, wie z. B. das Herz oder die Lunge, an den Eingeweiden befestigt sind, entfernen Sie diese, bevor Sie fortfahren.

Sobald die Baucheingeweide vom Kadaver getrennt sind, führe eine Pinzette unterhalb der Leber in der Nähe des Magens ein und ziehe die Leber vorsichtig vom Darm weg. Präparieren Sie dann vorsichtig den Hinterdarm von der dorsalen Harnröhre weg und entfernen Sie den Darm aus dem Urogenitaltrakt. Zum Schluss drehst du den Darm um, so dass die Milz unter dem Magen sichtbar ist.

Entfernen Sie die Milz und die Bauchspeicheldrüse. Ziehe die Darmschlingen auseinander, indem du das Mesentar festhältst. Entfernen Sie dann das Mesentar und das begleitende Gefäßsystem vom Darm, indem Sie vorsichtig am Mesentar ziehen.

Vermeiden Sie es, den Darm direkt mit der Pinzette zu halten. Wenn der Darm bricht, legen Sie die einzelnen Stücke einfach in der Dissoziationsphase zusammen. Fassen Sie jeden Gewebetyp in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen zusammen, das eiskaltes HBSS enthält, je nach Gewebetyp und Embryo-Phänotyp.

Nach der Pelletierung aspirieren die subpräparierten Gewebe so viel HBSS wie möglich. Anschließend resuspendieren Sie das Gewebepellet in einem bis mehreren Millilitern ACU max. Wechseln der Pipettenspitzen zwischen jeder Probe.

Um eine Kreuzkontamination von Gewebetypen zu vermeiden, legen Sie die Röhrchen für 20 bis 45 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Je nach Stadium des zu isolierenden Gewebes ist die Dissoziation und Filterung des Gewebes der schwierigste Teil des Verfahrens, um eine offene Dissoziation des Gewebes zu verhindern. Und als Folge davon eine geringe Zellviabilität.

Begrenzen Sie die Dissoziationszeit und versuchen Sie nicht, alle Gewebestücke auf halbem Weg vollständig zu dissoziieren. Und am Ende der Dissoziationszeit brechen Sie das Gewebe manuell auf, indem Sie den Schlauch kräftig gegen die Seite des Wasserbades schlagen und den Schlauch mit einer schnappenden Bewegung des Handgelenks nach unten schleudern. Bewegen Sie nun die dissoziierten Proben auf Eis und geben Sie sofort einen Milliliter frisch zubereiteten Quench mit einer neuen Pipettenspitze für jede Probe in jedes Röhrchen, indem Sie die Probe auf und ab bewegen, bis das Gewebe fast vollständig dissoziiert ist.

Platzieren Sie nun mit einer mit Ethanol sterilisierten Pinzette eine drei Quadratzentimeter große 38-Mikron-Nylonnetzmembran über die Öffnung eines neuen konischen 15-Milliliter-Rohrs. Verwenden Sie dann Spitzen mit schmaler Bohrung, um die einzelne resuspendierte Zelllösung durch das Netz zu filtrieren, indem Sie in die Mitte der Membran pipettieren. Nachdem die Zellsuspension filtriert wurde, spülen Sie das Probenröhrchen mit einem Milliliter Quench eins bis fünf und filtrieren Sie alle verbleibenden Zellen.

Entfernen Sie dann die Membran und achten Sie darauf, dass keine ungefilterten Gewebeproben in das Röhrchen gelangen. Nach dem Pelletieren saugen die Zellsuspensionen den Überstand an und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter Quench eins bis fünf. Filtern Sie dann jede Zellsuspension durch ein Nylonnetz in fünf Milliliter Polystyrolröhrchen, wie gerade gezeigt.

Beginnen Sie damit, ein kleines Aliquot der Fluoreszenzprobe für die EGFP-Kompensationskontrolle zu reservieren. Teilen Sie dann die Wildtyp-Gewebeprobe in zwei Teile auf, wobei nur ein Wildtyp und die anderen sieben nur A und d.Nur gekennzeichnet sind. Füllen Sie nun alle Probenröhrchen mit Quench eins bis fünf und aspirieren Sie nach dem Pelletieren der Proben alle bis auf die letzten 200 Mikroliter Überstand in jedem Röhrchen.

Zum Schluss addieren Sie sieben a a d zu den zu sortierenden Proben und die sieben a a d nur zur Kontrolle. Geben Sie dann 0,75 Milliliter Triazol LS zu 1,5 Milliliter Mikrozentrifuge. Die Probenentnahmeröhrchen beginnen mit der Verwendung der Kontrollproben, um die Kompensationsparameter und Gates einzustellen, um sieben A- bis D-positive tote Zellen zu vermeiden und Zellen mit einer hohen Intensität der GFP-Fluoreszenz zu sammeln.

Nachdem Sie die Kompensationsparameter eingestellt haben, beginnen Sie mit der Sortierung bei geringstmöglichem Druck mit einer Düse mit breiter Bohrung und geringer Durchflussmenge. Sammeln Sie maximal 25.000 Zellen in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, damit das Triol LS nicht zu stark verdünnt wird. Unmittelbar nach dem Sortieren wird jeder Zellschlauch im Triol eingefangen.

In dieser ersten Abbildung ist ein ganzer Genitaltrakt des Mount Euro 15,5 Tage nach dem Koitus ventral unter Hellfeldbeleuchtung zu sehen. Die gleiche Probe wird unter Fluoreszenzbeleuchtung betrachtet, um die Verteilung von EGFP-positiven Zellen in den Nebennieren- und medial gelegenen Zöliakieganglien zu demonstrieren, wie sie durch ihre TH-EGFP-Transgenexpression identifiziert wird. Diese Seitenansicht einer 15,5 Tage nach dem Cotus TH EGFP subpräparierten Blase zeigt die Fluoreszenz der Transgenexpression in den Beckenganglien, der Blasenwand und der Harnröhre.

In dieser dorsalen Ansicht der gleichen EGFP-positiven Zellen ist die Dissoziation des vorderen dorsalen Harnröhrengewebes zur Herstellung von Zellsuspensionen für die Flow-Sortierung ein empfindliches Gleichgewicht zwischen einer adäquaten enzymatischen Verdauung und der Vermeidung einer Überverdauung, die zu geringen Zellvariabilitäten führen kann. Diese mikroskopischen Aufnahmen zeigen das untere Urogenitaltrakt und das Darmgewebe nach der Hälfte der Dissoziationszeit. Wie auf diesen Fotos von entsprechend verdautem Gewebe vor und nach dem manuellen Auftragen zu sehen ist, sind in Geweben, die zu lange oder mit einer zu hohen Enzymkonzentration enzymatisch behandelt wurden, immer noch deutlich drei Stücke von subpräparierten Organen zu sehen.

Die resultierende Suspension enthält jedoch keine verbleibenden großen Gewebestücke, eine angemessene Dissoziation und manuelle Filterung erzeugt Durchflusszytometrieprofile, die typischerweise mehr als 90 % lebensfähige Zellen aufweisen, und die Zellen, die den Reporter in dieser lebensfähigen Population exprimieren, behalten eine hochintensive EGFP-Expression bei. Die schwarze Population besteht aus einzelnen Zellen, die tot sind und durch die Aufnahme von sieben a a d Fluoreszenzsterben markiert sind. Die graue Population besteht aus Singulett-Zellen, die auf Vorwärts- und Seitenstreuung basieren und sieben a bis d ausgeschlossen haben und daher lebensfähig sind.

Die grüne Population stammt aus dem gatten GFP-positiven Bereich und besteht aus einzelnen lebensfähigen Zellen, die sieben A bis d ausgeschlossen haben und EGFP-Fluoreszenz aufweisen. Mit diesem Verfahren können neuronale Vorläuferzellen aus anderen peripheren Geweben wie der sympathischen Kette, der Rückenwurzel, den Ganglien oder der Lunge isoliert werden, um Fragen zu Unterschieden in den Genexpressionsprofilen zwischen Populationen oder zur Entwicklung unterschiedlicher Abstammungslinien zu beantworten.