Name: A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Lernen Sie die Galvanotaxis-Analyse neuronaler Vorläuferzellen aus dem adulten Maushirn in einem Gleichstromfeld. Diese Methode ermöglicht Zeitrafferbildgebung der Zellmigration für Neurowissenschaften.

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Diese Arbeit wird durch die Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant # 249669 und # 482986) und Heart and Stroke Foundation of Canada (Grant # 485508) gefördert. Die Autoren danken Youssef El-Hayek und Dr. Qi Wan für ihre Unterstützung bei der Entwicklung der experimentellen Protokolle.

Alle Verfahren, die Behandlung der Tiere wurden von der University of Toronto Animal Care Committee in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts (Protokoll Nr. 20.009.387) zugelassen. Die folgenden Methoden sollten unter Verwendung steriler Instrumente und Techniken in einer Sterilbank, soweit zutreffend. Im Protokoll-Text bezieht sich der Ausdruck &quot;EFH-SFM&quot; zu serumfreiem Medium mit epidermalen Wachstumsfaktor, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Heparin ergänzt. EFH-SFM wird verwendet, wenn die Untersuchung der Galvanotaxis undifferenzierter NPCs, weil diese Mitogene NPCs in ihrem undifferenzierten Zustand 4 zu halten. Bei der Untersuchung der Galvanotaxis NPC-induzierte zu reifen Zelltypen differenzieren, &quot;FBS-SFM&quot; bezieht sich auf serumfreiem Medium mit 1% fötalem Rinderserum ergänzt. FBS fördert die Differenzierung von NSCs in reife neuronale Phänotypen 5. Ein. Isolation und Kultur von neuralen Vorläuferzellen (Nichtdargestellt im Video) <ol><li> Betäuben ein CD1-Maus (6-8 Wochen alt) mit Isofluran und Opfer über Genickbruch. </li><li> Begießen den Kopf in 70% Ethanol und enthaupten das Tier mit scharfen Dissektion Schere. </li><li> Halten Sie den Kopf mit chirurgischen Pinzette die Haut auf der dorsalen Oberfläche, um den Schädel freizulegen. </li><li> Mit einem Skalpell und nein. 11 Blättern, erzielt das Schädels an der Stirnhöhle entlang der mediolateralen Achse und auch entlang der Sagittalnaht im rostrokaudalen Richtung. </li><li> Schälen Sie die Scheitelbeinen vom Kopf ohne. 7 gebogene Pinzette, dabei nicht zu durchbohren das Hirngewebe. </li><li> Führen Sie einen dünnen Spatel unterhalb des Gehirns ab unter dem Kleinhirn und Weiterentwicklung in Richtung der Riechkolben. Halten Sie den Schädel an Ort und Stelle mit einer Pinzette, ziehen das Gehirn aus dem Schädel und sofort legen Sie sie in eiskaltem künstlichen Liquor (siehe Rezepte unten). </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, mit sterilenDissektion Schere und Pinzette geschnitten das Gehirn in der Hälfte entlang der Mittellinie. Drehen Sie jeden Hemisphäre, so dass die mediale (cut) Oberfläche nach oben zeigt. </li><li> Wählen Sie eine Halbkugel, und mit der medialen Oberfläche nach oben, suchen Sie die Splenium des Corpus callosum (hinteren Bereich des Corpus callosum). </li><li> Einen Einschnitt von der Oberfläche der Hirnrinde der Splenium des Balkens entlang der dorsoventralen Achse. </li><li> Peel die eingeschnittene Kortex zu der Riechkolben, die medialen und lateralen Wände des lateralen Ventrikel freizulegen. </li><li> Rotieren die Halbkugel so dass der dorsale Oberfläche nach oben zeigt, und mit gekrümmten Mikroschere zum Ausschneiden und sammeln die freiliegenden medialen und lateralen Wänden, die den Bereich, in dem periventrikulären NPCs aufzuhalten 6 enthalten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,8-1,11 für die andere Hemisphäre. </li><li> Pipettieren der isolierten Gewebe in 7 ml Trypsin-Lösung (siehe Rezept unten) in einem 15 ccm Rohr, und legen Sie das Rohr auf einer Wippe in einem 37 ° CInkubator für 25 min. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min, den Überstand aspirieren und resuspendieren das Gewebe in 2 ml Trypsin-Inhibitor-Lösung (siehe Rezept unten). </li><li> Gently verreiben das Gewebe mit einer kleinen Bohrung Pasteurpipette 30-50 mal vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min, den Überstand aspirieren und resuspendieren in 1-2 ml SFM (Rezept siehe unten) durch Verreiben das Pellet 3-5 mal. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 3 min, saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 1 ml SFM + EFH. </li><li> Zählen leben Zelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in einer T25-Kulturkolben in einer Dichte von 10 Zellen pro ul in SFM + EFH. </li><li> Lassen Sie die Kultur für 7 Tage ungestört frei schwebenden primäre Neurosphären von NPCs zusammen ergeben wachsen. </li></ol> 2. Galvanotaxis Chamber Vorbereitung <ol><li> Platz 3 quadratischen Glas-Nr. 1 Deckgläschen (22 x 22 x 0,17 mm) ina Flasche 6N Salzsäure über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag, mit einem Diamant-Spitze Glasschneider bis 6 rechteckigen Streifen (22 x 5 x 0,17 mm) aus Glas vom Quadrat nicht geschnitten. 1 Deckgläser. </li><li> Übertragen Sie die acid-washed Platz rutscht und rechteckige rutscht in eine laminare Strömung Kapuze. Waschen Sie die rechteckige und quadratische Streifen zunächst mit 70% Ethanol, dann mit Gewebekultur-grade autoklavierten Wasser, und lassen Sie sie auf einem Kim trocknen Wischen (für zusätzliche Sterilität, kann das Glas an der Luft trocknen erlaubt sein). </li><li> Anwenden Vakuumfett an dem Umfang der einen Fläche der quadratischen Glasobjektträgern und verschließt diese an der Basis von 60 mm Petrischalen aus Kunststoff. </li><li> Anwenden Vakuumfett entlang der langen Achse der einen Oberfläche der rechteckigen Glasstreifen, und schließt diesen an gegenüberliegenden Kanten der quadratischen Glasobjektträgern (derart, dass sie parallel zueinander sind), um eine zentrale Mulde zu schaffen. </li><li> UV-Sterilisation der Kammern für mindestens 15 min in der Sterilbank. </li><li> Pipette 250-300 ul von Poly-L-Lysine auf den zentralen Mulde der Kammern hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden. </li><li> Etwa 15 Minuten vor dem Ende der Inkubationszeit, bereiten die Matrigel-Lösung (siehe Rezept unten). </li><li> Saugen Sie die Poly-L-Lysin, waschen Sie die zentralen Tröge mit 1 ml autoklavierten Wasser, und Pipette 250-300 &amp;mgr; l Matrigel Lösung auf den zentralen Tälern. </li><li> Inkubiere die Kammern bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Saugen Sie die Matrigel-Lösung und vorsichtig waschen die zentralen Tröge mit 1-2 ml SFM. </li><li> Je 100 ul der EFH-SFM oder FBS-SFM auf den zentralen Tälern und übertragen Sie die Galvanotaxis Kammern auf der Bühne eines Zählen Mikroskop. </li><li> Pipette 3-4 ml des Neurosphäre enthaltenden Kultur in eine 60 mm Petrischale und übertragen die Petrischale auf der Bühne des Mikroskops gezählt. </li><li> Bei einer Betrachtung Ziel 5x, verwenden Sie eine P10 Pipette 5-8 gesamten Neurosphären (bis zu vier gleichzeitig) auf den zentralen Mulde jedes Galvanotaxis übertragenKammer ohne distanziert sie, und sorgfältig verteilt die Neurosphären rund um den zentralen Mulde ohne Unterbrechung des Matrigel Substrat. </li><li> Fügen Sie eine weitere 150-200 ul EFH-SFM oder FBS-SFM auf den zentralen Tälern. </li><li> Übertragen der Galvanotaxis Kammern in einem 37 ° C, 5% CO 2, 100% befeuchteten Inkubator für 17 bis 20 h (wenn Analysieren undifferenzierten NPC), damit die Neurospheres, um zu der Matrigel Substrat haften und dissoziieren in einzelne Zellen, wie in Abbildung 1 dargestellt . Wenn Analysieren differenzierten NSCs sollte die Inkubationszeit bis 69-72 h verlängert, um die Differenzierung der Zellen zu ermöglichen. </li></ol> 3. Live Cell Time-Lapse Imaging <ol><li> Lassen Sie das Live Cell Imaging System bei 37 ° C äquilibrieren, 5% CO 2 für mindestens 30 min vor Beginn der Zeitraffer-Aufnahme. </li><li> Schneiden Sie zwei 12 cm lange Stücke von 1 mm Durchmesser Silber Draht, Spule sie von einem Ende, und legen Sie sie in Clorox bLeach für 20 min zu bilden Ag / AgCl Elektroden. </li><li> Übertragen Sie die Galvanotaxis Kammern auf der Bühne eines Zählen Mikroskop und auswählen, welche Kammer wird für Live-Cell-Imaging Migration Analyse auf Grundlage der folgenden Kriterien verwendet werden: i) die Neurosphären sollte fast vollständig dissoziiert in einzelne Zellen und ii) die Zellen besitzen sollte Runde Morphologien mit wenig bis keine Prozesse sich von den Zellkörper. </li><li> Übertragen des ausgewählten Galvanotaxis Kammer in einer Sterilbank, zusammen mit einem getrennten quadratischen Nr. 1 Deckglas und Vakuum Fett. </li><li> Waschen der Deckel erste rutschen mit 70% igem Ethanol, dann mit autoklaviertem Wasser und Anwendung eines Streifens aus Vakuumfett an zwei parallelen Kanten des Deckglases. </li><li> Absaugen Kulturmedien von der zentralen Rinne der Kammer, dann schnell platzieren das Deckglas (Fett-Seite nach unten) auf die Kammer derart, dass das Fett Streifen auf den beiden parallelen rechteckigen Glasstreifen, effektiv eine Dachan die Kammer. </li><li> Je 100 ml frisches EFH-SFM oder FBS-SFM in den zentralen Mulde durch Kapillarwirkung. </li><li> Verwenden Vakuumfett um Grenzen für Pools von Kulturmedien auf jedem Ende der zentralen Rinne zu schaffen, wie in 2 gezeigt. </li><li> Schneiden Sie zwei 15 cm Stücke von PVC-Schlauch, und verwenden Sie einen 10-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel sorgfältig injizieren Agarose-Lösung in den Schlauch, wodurch keine Blasen bilden in den Rohren, und lassen Sie das Gel für 5 min zu festigen. </li><li> Übertragen der Galvanotaxis Kammer zu der lebenden Zellen System, zusammen mit dem Agarosegel Rohren, Ag / AgCl-Elektroden, und ein Paar von leeren 60 mm Petrischalen, die als Reservoire Kulturmedien verwendet werden und wird die Ag / AgCl-Elektroden enthalten. Lassen Sie die Galvanotaxis Kammer innerhalb des 37 ruhen ° C, 5% CO 2-Umgebung für 20-30 min. </li><li> Während dieser Zeit bereiten die Deckel der 2 leere Petrischalen und den Deckel der Petrischale des Galvanotaxis Kammer die durch Bohren von Löchernin sie mit einem Dremel oder ein ähnliches Werkzeug, wie in Abbildung 3 gezeigt. </li><li> Pipette 1-1,5 ml EFH-SFM oder FBS-SFM auf beiden Seiten der zentralen Rinne und 7-8 ml SFM in jedes leere Petrischale. Legen Sie eine Petrischale auf jeder Seite des Galvanotaxis Kammer der zentralen Mulde und Ort ein Ag / AgCl-Elektrode in jede Schale. Die Lücke zwischen der Kammer und den Galvanotaxis Petrischalen auf elektrische Kontinuität mit den Agarosegel Brücken zu schaffen, wie in Abbildung 4 dargestellt. </li><li> Schließen Sie die Ag / AgCl-Elektroden mit einem externen Netzteil, mit einem Amperemeter in Reihe, um elektrischen Strom zu messen, und schalten Sie die Stromversorgung. Mit einem Voltmeter, um die Stärke des elektrischen Feldes direkt auf der zentralen Mulde zu messen, und den Ausgangspegel der Stromversorgung bis die gewünschte elektrische Feldstärke erreicht ist (die Assays in diesem Labor durchgeführt nutzen eine dcEF Stärke von 250 mV / mm mit elektrischer Strom zwischen 1 und 1,5 mA). </li><li> Initiate der Zeitraffer-Modul auf dem Live Cell Imaging System und ermöglichen das Experiment, um die gewünschte Menge an Zeit laufen. Nach Abschluss des Tests, fixieren die Zellen in 4% Paraformaldehyd für Standard Immunfärbung Analyse. </li></ol>

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<li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> The FASEB Journal. , (2002).</li>
<li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li>
<li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Cell+Behavior+Electrically%3A+Current+Views+and+Future+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Subependymal+Neural+Precursors%2C+but+Not+Differentiated+Cells%2C+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808(2011).</li>
<li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li>
<li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll wurde von den etablierten Methoden der früheren Studien 7-9 angepasst. Galvanotactic Kammern kann unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen Techniken, einschließlich der Errichtung eines separaten Glas gut für Einschluss Zellaussaat oder mit Hilfe von CO 2-Laser-Ablation zur Mikrofabrikation des zentralen Rinne 10,11 werden. Einige Techniken können mehr mühsam oder kostspieliger als andere. Wir haben eine einfache und kostengünstige Konstruktion eines Assays für ...

<table border="1"><tbody><tr><td height="44"> Bezeichnung des Gegenstands </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Neuronale Vorläuferzellen Isolation </td></tr><tr><td> 2 M NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> 11,688 g in 100 ml dH 2 O gelöst </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 7,456 g in 100 ml dH 2 O gelöst </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> 20,33 g in 100 ml dH 2 O gelöst </td></tr><tr><td> 155 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td> 1,302 g in 100 ml dH 2 O gelöst </td></tr><tr><td> 0,5 M Glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> 9,01 g gelöst in 100ml dH 2 O </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,59 g in 100 ml dH 2 O gelöst </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderpankreas Trypsin </td><td> Sigma </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> Sheep Hoden Hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Kynurensäure </td><td> Sigma </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> Ovomucoid Trypsininhibitor </td><td> Worthington </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> 30% Glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td> 23,83 g in 100 ml dH 2 O gelöst </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Invitrogen </td><td> PMG8041 </td><td> Rekonstituieren in 1 ml Hormon-Mix und Aliquote in 20 ul Einheiten. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0226 </td><td> Rekonstituieren in 0,5 ml Hormon-Mix und Aliquote in 20 ul Einheiten. </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-Transferrin </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 3188-AT </td><td> 0,1 g in 4 ml dH 2 0 gelöst </td></tr><tr><td> Putrescin </td><td> Sigma </td><td> P7505 </td><td> Auflösen 9,61 mg in Apo-Transferrin solution </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Sigma </td><td> I5500 </td><td> 25 mg in 0,5 ml 0,1 N HCl und fügen Sie 3,5 ml dH 2 0 </td></tr><tr><td> Selen </td><td> Sigma </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> Standard Dissection Werkzeuge </td><td> Fine Science Tools </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Stemi 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Galvanotaxis Chamber Vorbereitung </td></tr><tr><td> Platz Glasabdeckung Dias </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> 6N Salzsäure </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> Hochvakuumfett </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 mm Petrischalen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td> Tauwetter und Aliquot in 150 ul-Einheiten </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td><td> Nur verwenden, wenn induzieren NPC Differenzierung, ansonsten SFM + EFH Kulturmedien wie oben angegeben </td></tr><tr><td> Zählen Mikroskops </td><td> Olymp </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Live Cell Time-Lapse Imaging </td></tr><tr><td> Silberdraht </td><td> Alfa Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> Hitze Inactivated FBS </td><td> Sigma </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> PVC-Schlauch </td><td> Fisher Scientific </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;ID x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> Bleichmittel </td><td> Clorox </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10-ml-Spritze </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 18-Gauge-Nadel </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Bohrmaschine </td><td> Dremel </td><td> Modell 750 </td><td></td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop mit befeuchteten, bebrütete Kammer ausgestattet </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert-200M </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Rezepte <table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> 2 M NaCl </td><td> 6,2 ml </td></tr><tr><td>1M KCl </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0,32 ml </td></tr><tr><td> 155mm NaHCO 3 </td><td> 16,9 ml </td></tr><tr><td> 1M Glucose </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,09256 ml </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Wasser autoklaviert </td><td> 74 ml </td></tr></tbody></table> Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit <table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Volumen oder Masse </td></tr><tr><td> Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit </td><td> 30 ml </td></tr><tr><td> Rinderpankreas Trypsin </td><td> 40 mg </td></tr><tr><td> Sheep Hoden Hyaluronidase </td><td> 22,8 mg </td></tr><tr><td> Kynurensäure </td><td> 5 mg </td></tr></tbody></table> &lt;strong&gt; Trypsin-Lösung <table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Volumen oder Masse </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Ovomucoid Trypsininhibitor </td><td> 10 mg </td></tr></tbody></table> Trypsininhibitorlösung <table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Wasser autoklaviert </td><td> 37 ml </td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 30% Glucose </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO 3 </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Transferrin, Putrescin-Lösung </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> 25 mg Insulin-Lösung </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Selen </td><td> 100 &amp; mu; L </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> Hormone Mix (100 ml insgesamt bei -20 ° C) <table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Wasser autoklaviert </td><td> 37,5 ml </td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 (3:1) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 30% Glucose </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO 3 </td><td> 0,75 ml </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 0,25 ml </td></tr><tr><td> Hormone mix </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Serum Free Media EFH-SFM: add 10 ul EGF, 10 ul FGF und 3,66 ul Heparin FBS-SFM: 0,5 ml FBS <talich border = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Artikel </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3,6 ml </td></tr></tbody></table> Matrigel Lösung Matrigel Aliquot sollte in einer Box von Eis gelegt werden und langsam auftauen über 4-5 Stunden, um eine viskose Flüssigkeit vor dem Mischen mit SFM bilden. Dadurch wird die Bildung einer glatten Schicht aus Matrigel Substrat. Wenn nicht aufgetaut langsam, wird das resultierende Substrat enthalten Klumpen von Matrigel, möglicherweise behindern Zellmigration. <table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Volumen oder Masse </td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> 300 mg in 10 ml ddH 2 0 </td></tr><tr><td> SFM Hitzeinaktiviertem FBS </td><td> 8 ml 2 ml </td></tr></tbody></table> MatrigelLösung Mix 8 ml SFM mit 2 ml hitzeinaktiviertem FBS in einer 15 cc Falcon-Röhrchen. Mischung Agarose mit 10 ml ddH 2 0 in einem Erlenmeyerkolben und Hitze in einer Mikrowelle für 30 sec. in 10-sec Intervallen, wodurch die Lösung aus der Mikrowelle zu entfernen, nachdem jedes 10-Sekunden-Intervall und gründlich zu mischen. Nach dem abschließenden 10-sec Mikrowelle Zeitraum mischen die Agarose-Lösung mit der SFM / FBS-Lösung und an einem 57 ° C Wasserbad. </td></tr></tbody></table>

a galvanotaxis assay für die analyse von neuralen vorläuferzellen cell migration kinetics in einem von außen angelegten direct current electric field

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Die Entdeckung von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (kollektiv als neuralen Vorläuferzellen) (NPC) im erwachsenen Gehirn von Säugetieren ist an einem Körper der Forschung auf die Nutzung der multipotenten und proliferativen Eigenschaften dieser Zellen für die Entwicklung von Strategien neuroregenerative gerichtet geführt. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Mobilisierung von NSC Richtung einer Läsionsstelle nach Transplantation oder exogene, um die Reaktion der endogenen Vorstufen, die in der periventrikulären Region des ZNS gefunden werden verbessern. Dementsprechend ist es wichtig, die Mechanismen, die zu fördern leiten, und verbessern NPC Migration verstehen. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Nutzung von Gleichstrom elektrische Felder (dcEFs) zu fördern und zu direkten NPC Migration - ein Phänomen, das als Galvanotaxis bekannt. Endogenen physiologischen elektrischen Feldern funktionieren als kritische Hinweise für die Zellwanderung während der normalen Entwicklung und Wundheilung. Pharmakologische Unterbrechung dertrans-Neuralrohr Potenzial Axolotl Embryonen verursacht schweren Entwicklungsstörungen Fehlbildungen 1. Im Rahmen der Wundheilung, wird die Rate der Reparatur der verwundeten Hornhaut direkt mit der Größe der Wunde epithelialen Potential, das nach der Verletzung auftritt korreliert, als durch pharmakologische Verstärkung oder Störung dieses dcEF 2-3 gezeigt. Wir haben gezeigt, dass adulte subependymale NPCs rasche und gerichteten Migration kathodenseitigen in vitro durchlaufen, wenn sie einem von außen angelegten dcEF ausgesetzt. In diesem Protokoll beschreiben wir unser Labor die Techniken für die Schaffung eines einfachen und effektiven Galvanotaxis Assay für hochauflösende, langfristige Beobachtung der Regie Zellkörper Translokation (Migration) auf einer Ebene einzelner Zellen. Dieser Assay wäre geeignet für die Untersuchung der Mechanismen, dcEF Transduktion in zelluläre Motilität regulieren durch die Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäuse, short interfering RNA oder spezifischen Rezeptor Agonisten / Antagonisten.

Kinematische Analyse zeigt, daß in Gegenwart von 250 mV / mm dcEF, undifferenzierte NPCs sehr gerichtet und rasche Galvanotaxis Richtung der Kathode (5A, Kinofilm 1) aufweisen. In Abwesenheit eines dcEF wird zufällige Bewegung der Zellen beobachtet (5B, Film 2). Zu dieser Feldstärke&gt; 98% von undifferenzierten NSCs für die gesamte 6-8 h, für die sie abgebildet migrieren, und da tote Zellen nicht migrieren dies legt nahe, dass sie lebensfähig bleiben während dieses Zeitraums in Abwesen...

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Migration von adulten, abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen in Gegenwart eines Gleichstrom-Elektrikfelds sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst subependymale neuronale Vorläuferzellen aus der erwachsenen Maus isoliert und kultiviert werden. Der nächste Schritt besteht darin, Galvan Axxis-Kammern vorzubereiten und die neuronalen Vorläuferzellen auf die Kammern zu übertragen.Der letzte Schritt besteht darin, ein elektrisches Gleichfeld über die Galvan Axxis-Kammer anzulegen und eine Zeitrafferaufnahme durchzuführen, um die Migration der neuronalen Vorläuferzellen zu beobachten. Letztendlich erfasst die Zeitraffermikroskopie die galvanotaktischen Eigenschaften neuronaler Vorläuferzellen in ihrem differenzierten und undifferenzierten Zustand. Obwohl diese Methode Einblicke in die Galvanotaxis neuronaler Vorläuferzellen ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise auf ein Maus-Modell eines Schlaganfalls zur Rekrutierung neuronaler Vorläuferzellen an Läsionsstellen, um die neuronale Reparatur zu fördern.Den Ablauf wird Rob Pilley, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Zum Beginn dieses Verfahrens müssen die NPCs sieben Tage lang in Kultur gewesen sein, damit freischwimmende primäre Neurosphären zur Gewinnung bereitstehen. Falls erforderlich, bereiten Sie drei Galvan-Axxis-Kammern vor, indem Sie drei quadratische Glasplättchen platzieren.Nummer eins, Deckgläser über Nacht in eine Flasche mit sechs normaler Salzsäure geben. Am nächsten Tag früh den Matra-Gel langsam auf Eis auftauen lassen. Nach vier Stunden ist er gebrauchsfertig, um die Kammer zu bauen.Verwenden Sie zunächst eine Glasschneidplatte mit Diamantspitze, um sechs rechteckige Streifen aus neuen quadratischen Deckgläsern zu schneiden. Überführen Sie die mit Säure gewaschenen quadratischen und rechteckigen Deckgläser in eine laminare Luftströmungshaube.Spülen Sie die Glasstreifen mit 70 % Ethanol und anschließend mit steriler, zellkulturgeeigneter Wasser, das durch Autoklavieren sterilisiert wurde. Lassen Sie sie an der Luft trocknen oder trocknen Sie sie auf fusselfreiem Papier. Tragen Sie danach Vakuumfett auf den Rand einer Oberfläche jedes quadratischen Objektträgers auf und verschließen Sie sie an der Basis von 60 Millimeter großen Kunststoffschalen.Petri-Schalen. Vakuumfett auf eine Seite der rechteckigen Glasstäbe auftragen und diese an gegenüberliegenden Kanten der quadratischen Objektträger befestigen, um Quadrate mit einer zentralen Rille in der Mitte jeder Schale zu erzeugen.UV-sterilisieren Sie diese modifizierten Glasscheiben oder -kammern mindestens 15 Minuten lang in einer Sterilbox. Danach pipettieren Sie 250 bis 300 Mikroliter Poly-L-Lysin in die zentrale Vertiefung der Kammern. Anschließend inkubieren Sie die Kammern zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, etwa 15 Minuten vor Ende der Inkubation. Bereiten Sie die Matri-Gel-Lösung nach zwei Stunden vor, saugen Sie das Polyol-Lysin ab und waschen Sie die mittleren Rillen mit einem Milliliter autoklaviertem Wasser. Danach pipettieren Sie 250 bis 300 Mikroliter Matri-Gel-Lösung auf die mittleren Rillen und inkubieren Sie die Kammer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation saugen Sie die Matrigel-Lösung ab.Spülen Sie dann die zentralen Rillen vorsichtig mit ein bis zwei Milliliter SFM aus. Pipettieren Sie anschließend 100 Mikroliter E-F-H-S-F-M oder F-B-S-S-F-M auf die zentralen Rillen, um die kultivierten Zellen vorzubereiten. Danach pipettieren Sie vier bis fünf Milliliter der Neurosphären enthaltenden Kultur in eine neue 60 Millimeter große Petrischale.Danach die Petrischale auf den Objekttisch des Zählmikroskops unter dem 5×-Betrachtungsobjektiv stellen. Mit einer P-10-Pipette vorsichtig fünf bis acht ganze Neurosphären in die zentrale Rille jedes Kammerabschnitts überführen. Bis zu vier.Neurosphären können sofort übertragen werden, dürfen jedoch nicht zusammen mit den Neurosphären in den zentralen Rillen dissociiert werden. Vorsichtig verteilen, ohne das Matrigel-Substrat zu stören. Anschließend weitere 150 Mikroliter E-F-H-S-F-M oder F-B-S-S-F-M auf die zentralen Rillen geben.Kultivieren Sie die Zellen nun in einem befeuchteten Inkubator. Nach 17 bis 20 Stunden in der Kultur stehen undifferenzierte NPCs nach 69 bis 72 Stunden zur Verfügung. In der Kultur sind differenzierte NPCs verfügbar.Unter dem Rechnungsmikroskop die Kammer mit den besten Zellen für die Live-Zell-Bildgebung zur Migrationsanalyse auswählen. Die Zellen sollten rund sein, nahezu vollständig von ihren Neurosphären dissociiert und noch keine oder erst ansatzweise Ausläufer im Haubenraum gebildet haben. Einen Kammerdeckel vorbereiten.Spülen Sie eine quadratische Glasdecke mit 70 %igem Ethanol und anschließend mit autoklaviertem Wasser, und tragen Sie einen Streifen Vakuumfett auf zwei parallele Kanten auf. Bedecken Sie nun die Kammer. Aspirieren Sie zuerst das Kulturmedium aus der zentralen Rille und verschließen Sie dann schnell die Decke, indem Sie die Decke wie ein Dach auf die rechteckigen Wände aufsetzen.Als Nächstes 100 µL frisches Medium mithilfe der Kapillarwirkung in die zentrale Rinne einfüllen. Nun Vakuumfett verwenden, um Begrenzungen für die Kulturmedien-Pools zu schaffen. An beiden Enden der zentralen Rinne des Live-Cell-Imaging-Systems jeweils Agarose-Gel-Röhrchen, Silber-, Silberchlorid-Elektroden und zwei 60-mm-Petri-Schalen bereitstellen.Als Reservoirs für das Kulturmedium lassen Sie die Kammer 20 bis 30 Minuten lang in einer Umgebung mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ruhen. Bereiten Sie währenddessen die Deckel der beiden leeren Petrischalen sowie den Deckel der Petrischale mit den Galvan Axxis-Kammern vor, indem Sie mit einem Dremel oder einer Pipettenspitze Löcher hineinbohren, 1,5 bis zwei Milliliter Medium auf jede Seite der zentralen Rille geben und je sieben bis acht Milliliter SFM in jede leere Petrischale füllen. Stellen Sie eine Petrischale auf jede Seite der zentralen Rille der Kammer und platzieren Sie eine Elektrode in jede Schale.Verbinden Sie die Kammer mit den Petrischalen, um die elektrische Kontinuität herzustellen. Verbinden Sie mit Hilfe der Agaros-Gel-Brücken die Elektroden über ein in Reihe geschaltetes M-Messgerät mit einer externen Stromversorgung, um den elektrischen Strom zu messen, und schalten Sie die Stromversorgung ein. Messen Sie die Stärke des elektrischen Feldes direkt über die zentrale Rinne mit einem Voltmeter.Passen Sie die Ausgabe der Stromversorgung nach Bedarf an. Starten Sie nun das Zeitraffermodul am Bildgebungssystem. Wählen Sie in der Axio-Vision-Software die mehrdimensionale Aufnahme aus und klicken Sie auf „See“.Wählen Sie für die Kanäle Kanal sechs aus und klicken Sie auf T für Zeitraffer. Stellen Sie im Einstellungsmenü die Zeitraffer-Intervalleinstellungen auf eine Minute ein und legen Sie die Dauer auf acht Stunden fest, bevor Sie die Zeitpunkte vor und nach dem Zeitpunkt auswählen. Klicken Sie nun auf Start und lassen Sie das Experiment für die gewünschte Zeitdauer laufen. Nach Abschluss des Assays fahren Sie mit der IHC-Analyse fort.Die kinematische Analyse zeigte, dass undifferenzierte NPCs in Gegenwart eines 250 Millivolt pro Millimeter betragenden DCEF hochgradig gerichtete und schnelle galvanotaktische Bewegungen in Richtung der Kathode aufweisen; bei dieser Feldstärke migrierten mehr als 98 % der undifferenzierten NPCs während der gesamten sechs bis acht Stunden, für die sie aufgezeichnet wurden. In Abwesenheit eines DCEF wurde eine zufällige Zellbewegung beobachtet.Da tote Zellen nicht migrieren, deutet dies darauf hin, dass sie während dieses Zeitraums lebensfähig bleiben. In Abwesenheit oder Anwesenheit von A-D-C-E-F zeigten differenzierte Phänotypen eine vernachlässigbare Migration, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von A-D-C-E-F-Teilmengen differenzierter Zellen. Ausgedehnte Fortsätze, die dazu neigten, senkrecht zur Richtung des DCEF ausgerichtet zu sein, wiesen jedoch keine bemerkenswerte Translokation des Zellkörpers auf.Die Immunfärbung bestätigte, dass NPCs nach sechs Stunden DC-ES-Belastung weiterhin positiv für den neuralen Vorläufermarker Nestin exprimierten. In den Assays mit NPCs, die zur Differenzierung in reife Phänotypen induziert wurden, exprimierte die Mehrheit der Zellen nach sechs Stunden DCEF-Belastung den Marker für reife Astrozyten, das gliale fibrilläre saure Protein oder GFAP. Nach Durchführung dieses Verfahrens können Einblicke in die zellulären Mechanismen gewonnen werden, die an der Umwandlung des Gleichstrom-Elektrikfelds in Zellmotilität beteiligt sind, unter Verwendung genetischer Knockout-Modelle.Oder Sir, ein Beispiel hierfür.

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Forschung

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Neurowissenschaften

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Dieses Protokoll zeigt Methoden verwendet werden, um 2D-und 3D-Umgebungen in speziell angefertigten electrotactic Kammern einzurichten, die Zellen verfolgen...

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A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field (Video) | JoVE Journal

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

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