A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Migration von adulten neuralen Vorläuferzellen in Gegenwart eines elektrischen Gleichstromfeldes sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst subependymale neurale Vorläuferzellen aus der adulten Maus isoliert und kultiviert werden. Der nächste Schritt besteht darin, die Galvan Axxis Kammern vorzubereiten und die neuralen Vorläuferzellen auf die Kammern zu übertragen.

Der letzte Schritt besteht darin, ein elektrisches Gleichstromfeld über die Galvan Axxis-Kammer zu legen und eine Zeitrafferbildgebung durchzuführen, um die Migration der Neurovorläufer zu beobachten. Letztendlich erfasst die Zeitraffer-Bildgebungsmikroskopie die Galvan-taktischen Eigenschaften von Neurovorläufern in ihrem differenzierten und undifferenzierten Zustand. Obwohl diese Methode Einblicke in die Galvanoase von Neurovorläuferzellen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. ein Mausschlagmodell für die Rekrutierung von Neurovorläufern an Läsionsstellen, um die Neuroreparatur zu verbessern.

Das Verfahren wird von Rob Pilley Post, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Zu Beginn dieser Prozedur müssen die NPCs sieben Tage lang in Kultur gewesen sein, damit die frei schwebenden primären Neurosphären bereit sind, geerntet zu werden. Beginnen Sie bei Bedarf mit der Vorbereitung von drei Galvan Axxis Kammern, indem Sie drei quadratische Gläser platzieren.

Nummer eins, decken Sie eine Flasche mit sechs normalen Salzsäure über Nacht ab. Richten Sie das Matra-Gel früh am nächsten Tag so ein, dass es langsam auf dem Eis auftaut. Nach vier Stunden ist es bereit, die Kammer zu bauen.

Schneiden Sie zunächst mit einem Glasschneider mit Diamantspitze sechs rechteckige Glasstreifen aus dem neuen Quadrat aus. Nummer eins, Deckblätter. Übertragen Sie die säuregewaschenen quadratischen und rechteckigen Schlicker in eine Laminar-Flow-Haube.

Waschen Sie die Glasstreifen mit 70 % Ethanol, gefolgt von Autoklavenwasser in Gewebekulturqualität. Lassen Sie sie an der Luft trocknen oder trocknen Sie sie auf fusselfreiem Papier. Tragen Sie anschließend Vakuumfett auf den Umfang einer Oberfläche jedes quadratischen Glasobjektträgers auf und versiegeln Sie sie mit der Basis aus 60 Millimeter starkem Kunststoff.

Petrischale. Tragen Sie auf eine Seite der rechteckigen Glasstreifen Vakuumfett auf und versiegeln Sie diese an den gegenüberliegenden Kanten des Quadrats. Glasschieber, um Quadrate mit einer zentralen Wanne in der Mitte jeder Schale zu bilden.

UV-sterilisieren Sie diese modifizierten Glasquadrate oder -kammern für mindestens 15 Minuten in einer Haube. Anschließend pipettieren Sie 250 bis 300 Mikroliter Polyollysin in die zentrale Wanne der Kammern. Inkubieren Sie die Kammern dann zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, etwa 15 Minuten, bevor die Inkubation endet.

Bereiten Sie die Matri-Gel-Lösung nach zwei Stunden vor, aspirieren Sie das Polyol-Lysin und waschen Sie die zentralen Tröge mit einem Milliliter Autoklavenwasser. Pipettieren Sie dann 250 bis 300 Mikroliter Matri-Gellösung auf die zentralen Tröge und inkubieren Sie die Kammern eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation die Matrigellösung ansaugen.

Waschen Sie dann die zentralen Tröge vorsichtig mit ein bis zwei Millilitern SFM. Pipettieren Sie nun 100 Mikroliter E-F-H-S-F-M oder F-B-S-S-F-M in die zentralen Tröge, um die kultivierten Zellen vorzubereiten. Als nächstes pipettieren Sie vier bis fünf Milliliter der Neurosphäre, die die Kultur enthält, in eine neue 60-Millimeter-Petrischale.

Stellen Sie dann die Petrischale auf den Tisch des Zählmikroskops unter das Fünffach-Sichtobjektiv. Mit einer P 10-Pipette fünf bis acht ganze Neurosphären vorsichtig in die zentrale Wanne jeder Kammer übertragen. Bis zu vier.

Neurosphären können sofort übertragen werden, dissoziieren sie aber nicht mit den Neurosphären in den zentralen Trögen. Verteilen Sie sie vorsichtig, ohne das Matrigelsubstrat zu beschädigen. Geben Sie dann weitere 150 Mikroliter E-F-H-S-F-M oder F-B-S-S-F-M auf die zentralen Tröge.

Nun kultivieren sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator. Nach 17 bis 20 Stunden in der Kultur sind undifferenzierte NPCs nach 69 bis 72 Stunden verfügbar. In der Kultur werden differenzierte NPCs verfügbar sein.

Wählen Sie unter Abrechnungsmikroskop die Kammer mit den besten Zellen für die Migrationsanalyse von lebenden Zellen aus. Die Zellen sollten rund sein, fast vollständig von ihren Neurosphären losgelöst und haben noch keine oder gerade erst begonnen, Prozesse in einer Haube zu bilden. Bereiten Sie eine Kammerabdeckung vor.

Waschen Sie einen quadratischen Glasdeckglas mit 70 % Ethanol, dann mit autoklaviertem Wasser und tragen Sie einen Streifen Vakuumfett auf zwei parallele Kanten auf. Decken Sie nun die Kammer ab. Zuerst wird das Nährmedium aus der zentralen Wanne abgesaugt, dann schnell der Deckel versiegelt und wie ein Dach auf die rechteckigen Wände geschoben.

Laden Sie anschließend mit Kapillarwirkung 100 Mikroliter Frischmedium in die zentrale Wanne. Verwenden Sie nun Vakuumfett, um Ränder für Pools mit Nährmedien zu erstellen. An jedem Ende des zentralen Trogs am Lebendzell-Bildgebungssystem haben Sie Agros-Gel-Röhrchen, Silber-, Silberchlorid-Elektroden und zwei 60-Millimeter-Petrischalen zur Verwendung vorbereitet.

Lassen Sie die Kammern als Reservoire für Nährmedien 20 bis 30 Minuten lang in der 37 Grad Celsius warmen Umgebung mit 5 % Kohlendioxid ruhen. Bereiten Sie während dieser Zeit die Deckel der beiden leeren Petrischalen und den Deckel der Galvan Axxis Kammer-Petrischale vor, indem Sie mit einer Dremel- oder Werkzeugpipette Löcher in sie bohren, 1,5 bis zwei Milliliter Medium auf jede Seite der zentralen Wanne bohren und sieben bis acht Milliliter SFM in jede leere Petrischale geben. Platzieren Sie eine Petrischale auf jeder Seite des zentralen Trogs der Kammer und platzieren Sie eine Elektrode in jede Schale.

Überbrücken Sie den Spalt zwischen der Kammer und den Petrischale, um die elektrische Kontinuität herzustellen. Schließen Sie mit den Agros-Gelbrücken die Elektroden an eine externe Stromversorgung an, wobei ein M-Messgerät in Reihe geschaltet ist, um den elektrischen Strom zu messen und die Stromversorgung einzuschalten. Verwenden Sie ein Volumenmessgerät, um die Stärke des elektrischen Feldes direkt über der zentralen Wanne zu messen.

Passen Sie die Leistung des Netzteils nach Bedarf an. Starten Sie nun das Zeitraffer-Modul auf dem Imaging-System. Wählen Sie in der Axio Vision Software Multidimensionale Erfassung aus und klicken Sie auf Sehen.

Wählen Sie für Kanäle Kanal sechs aus, und klicken Sie auf T für Zeitraffer. Legen Sie die Einstellungen für das Zeitrafferintervall auf eine Minute fest, legen Sie die Dauer auf acht Stunden fest. Wählen Sie in den Feldern "Einstellungen vor", "Nach dem Zeitpunkt" den Zeitpunkt vor und nach dem Zeitpunkt aus. Klicken Sie nun auf Start und lassen Sie das Experiment nach Abschluss des Assays für die gewünschte Zeit laufen, fahren Sie mit der IHC-Analyse fort.

Die kinematische Analyse zeigte, dass in Gegenwart eines DCEF-Wertes von 250 Millivolt pro Millimeter undifferenzierte NPCs bei dieser Feldstärke eine stark gerichtete und schnelle galvanische Axxis in Richtung Kathode zeigten, während mehr als 98% der undifferenzierten NPCs für die gesamten sechs bis acht Stunden, für die sie abgebildet wurden, migrierten. In Ermangelung von A-D-C-E-F. Es wurde eine zufällige Bewegung der Zellen beobachtet.

Da abgestorbene Zellen nicht wandern, deutet dies darauf hin, dass sie in dieser Zeit lebensfähig bleiben. In Abwesenheit oder Gegenwart von A-D-C-E-F erfuhren differenzierte Phänotypen eine vernachlässigbare Migration, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von A-D-C-E-F-Untergruppen differenzierter Zellen. Ausgedehnte Prozesse, die dazu neigten, sich senkrecht zur Richtung des DCEF auszurichten, aber keine auffällige Zellkörpertranslokation wurde beobachtet.

Die Immunfärbung bestätigte, dass NPCs nach sechsstündiger DC EF-Exposition eine positive Expression des neuralen Vorläufermarker-Nests beibehielten. In den Assays mit NPCs, die dazu angeregt wurden, sich in reife Phänotypen zu differenzieren, exprimiert die Mehrheit der Zellen nach sechsstündiger DCEF-Exposition den reifen Astrozytenmarker Gliafibrilläres saures Protein oder GFAP. Nach diesem Verfahren kann man mit Hilfe genetischer Knockout-Modelle Einblicke in die zellulären Mechanismen gewinnen, die an der Umwandlung des elektrischen Gleichstromfeldes in die Zellmotilität beteiligt sind.

Oder Sir, ein zum Beispiel.