Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, PCR-fähige Nukleinsäuren und immunreaktive Proteine aus einer Probe zu isolieren, ohne auf Strom oder Laborinfrastruktur angewiesen zu sein. Die Isolierung von Nukleinsäuren in Proteinen beginnt mit dem Mischen der Probe mit Guanidin und Thiocyanat, um die Probe aufzulysieren, und dem Durchlaufen der Mischung über das Sorbens in der Extraktionspipette. Fünfmal nach dem fünften und letzten Durchlauf über das Sorbens wird die Mischung in Puffer für die Proteinaufreinigung gegeben und zur Isolierung des immunreaktiven Proteins beiseitegestellt.

Anschließend werden das Sorbens und die daran gebundenen Nukleinsäuren gewaschen, indem 95 % Ethanol über das Sorbens geleitet wird. Mehrfach wird das Sorbens samt den gebundenen Nukleinsäuren anschließend getrocknet, indem fünf Minuten lang Umgebungsluft über das Sorbens geleitet wird. Der letzte Schritt zur Gewinnung PCR-fähiger Nukleinsäuren besteht darin, die Nukleinsäuren mithilfe von 250 Mikrolitern Tris oder einer anderen ähnlichen wässrigen Lösung vom Sorbens zu eluieren, um das immunreaktive Protein zu isolieren.

Nach dem Mischen der Probe und des Proteinaufschlusspuffers verwenden Sie eine zweite Extraktionspipette und lassen die Mischung 15-mal über das Sorbens laufen. Im nächsten Schritt wird das Sorbens mit gebundenem Protein gewaschen, indem mehrmals 95 % Ethanol über das Sorbens geleitet wird. Anschließend werden das Sorbens und das daran gebundene Protein getrocknet, indem fünf Minuten lang Umgebungsluft über das Sorbens geleitet wird.

Der letzte Schritt des Protokolls besteht darin, das Protein aus dem Sorbens zu eluieren. Letztendlich ermöglicht die in diesem Verfahren verwendete Extraktionspipette die elektrizitätsfreie Isolierung von PCR-fertigen Nukleinsäuren und immunreaktiven Proteinen. Hallo, mein Name ist Dave Pawlowski.

Ich bin leitender Wissenschaftler bei Kubrick Incorporated in Buffalo, New York, und heute werden wir eine Methode kennenlernen, mit der sowohl Proteine als auch Nukleinsäuren inline isoliert werden können, ohne dass vor der Probelyse eine Zentrifuge, ein Vortex oder sonstige zusätzliche Laborgeräte benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass die Proben in flüssiger Form vorliegen. Falls die Probe fest ist, beispielsweise Lebensmittel oder Stuhl, sollte sie in einem flüssigen Medium wie Wasser oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert werden.

Mischen Sie 500 Mikroliter der Probe mit 500 Mikrolitern sechs molarer Guanin-Thiocyanat in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Danach drücken Sie den Kolben einer Extraktionspipette zusammen, wodurch die umgebende Luft verdrängt wird. Ziehen Sie die gesamte ein Milliliter Probe durch das absorbierende Material in die Extraktionspipette, indem Sie den Kolben langsam expandieren lassen.

Drehen Sie das Extraktionswerkzeug um, sodass die Sorbensperlen und die Probe in die Birnette abfließen. Mahlen Sie die Sorbensperlen mit der Probe in der Birnette, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht aus der Extraktionspipette herauszupressen.

Drehen Sie die Extraktionspipette um und geben Sie die Probe in das ursprüngliche 1,5-Milliliter-Röhrchen ab. Ziehen Sie die gesamte einkippige Milliliter-Probe in die Extraktionspipette, wobei Sie die Säule mit moderater Geschwindigkeit durchlaufen lassen. Achten Sie darauf, dass die Säule im Hals der Extraktionspipette verbleibt, und drücken Sie die gesamte Probe durch Betätigen des Balgs in das 1,5-Milliliter-Röhrchen ab.

Wiederholen Sie diesen Vorgang und führen Sie die Probe insgesamt fünfmal über die Säule, wobei die Probe noch vier weitere Male über die Säule gegeben wird. Nach dem fünften Durchlauf über die Säule wird die gesamte Probe von einem Milliliter in vier Milliliter Puffer zur Proteingewinnung in einem 15-Milliliter-Konizglas ausgepresst. Mischen Sie das Gefäß durch mehrmaliges Umstülpen, verschließen Sie es anschließend und stellen Sie es für später bereit.

Waschen Sie die isolierten Nukleinsäuren, indem Sie ein Milliliter 95 %igen Ethanol dreimal über die Säule laufen lassen und das Ethanol in seinen ursprünglichen Behälter zurückführen. Führen Sie nach dem letzten Durchlauf die Waschung dreimal mit einem zweiten Milliliter 95 %igem Ethanol-Waschpuffer durch. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Säule zu trocknen, da die Rückgewinnung der Nukleinsäuren am besten funktioniert, wenn die Säule trocken ist.

Ich weiß, dass dieser Schritt mühsam ist. Wenn Sie diesen Schritt jedoch innerhalb des empfohlenen Zeitrahmens abschließen, werden Ihre Ergebnisse besser sein. Drücken und lösen Sie die Birne fünf Minuten lang.

Leiten Sie Umgebungsluft durch die Extraktionspipette, um die Nukleinsäuren und die Sorbentenschicht zu trocknen, und entfernen Sie restliches Ethanol von der Spitze der Extraktionspipette. Gewinnen Sie die Nukleinsäuren mithilfe eines Kim-Tuchs zurück, indem Sie 250 Mikroliter einer 10-Millimolar-Triss-Lösung fünfmal über das Sorbent laufen lassen. Die Triss-Pufferlösung kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung wie PBS ersetzt werden.

Die resultierende Lösung enthält die extrahierten Nukleinsäuren. Um zuerst die Proteine zu extrahieren, mischen Sie die Probe in dem zuvor beiseitegestellten Puffer für die Proteinaufreinigung, indem Sie etwa zwei bis drei Milliliter dieser fünf Milliliter Probe über das Sorbens einer neuen Extraktion geben. Pipettieren Sie die gesamte Probe in das gleiche kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen ab. Achten Sie dabei darauf, das Sorbens im Hals der Extraktionspipette zu belassen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang. Führen Sie die Probe 15-mal über die Säule. Waschen Sie die Säule und das gebundene Protein, indem Sie ein Milliliter 95 % Ethanol dreimal über die Säule laufen lassen, und entsorgen Sie das Ethanol in das ursprüngliche Reaktionsgefäß. Waschen Sie dreimal erneut unter Verwendung eines zweiten Milliliter 95 % Ethanol.

Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, das Sorbens erneut zu trocknen. Wie bei Nukleinsäuren erfolgt die Proteinrückgewinnung am besten, wenn das Sorbens getrocknet ist. Für einen längeren Zeitraum.

Drücken Sie die Birne für fünf Minuten und lassen Sie sie dann los, um Umgebungsluft durch die Extraktionspipette zu leiten. Um die Proteinsorbentschicht zu trocknen, wischen Sie das restliche Ethanol von der Spitze der Extraktionspipette ab. Gewinnen Sie das Protein, indem Sie mit einem Kim-Tuch 250 Mikroliter PBS fünfmal über den Sorbenten leiten.

Der PBS-Puffer kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung ersetzt werden, beispielsweise 10 Millimolar Tris, pH 6,8. Die resultierende Lösung enthält den Proteingehalt der Probe. Die mit dem enterohämorrhagischen Escherichia coli-Stamm O157:H7 assoziierten Shiga-Toxin-Gene der Stammvariante EDL 933 wurden mittels der Extraktionspipette aus einem Nukleinsäure-Protein-Extraktionsverfahren amplifiziert.

Die Shiga-Toxin-Gene, Shiga-Toxin 1 und Shiga-Toxin 2, befinden sich auf temperenten, lambdaähnlichen Bakteriophagen und defekten Bakteriophagen unter Kontrolle des PR-Promotors. Die Aktivierung der SOS-Antwort in E. coli führt zur Induktion des Prophagen und/oder zur Toxinproduktion. In diesem Fall kommt es zu einem starken Anstieg der Amplifikation des Shiga-Toxin-2-Gens, wenn die SOS-Antwort durch Mitomycin C induziert wird, verglichen mit der unbehandelten Kontrolle.

Dies deutet auf eine Prophageninduktion und Replikation des Phagen-Genoms hin. Das aus den im Video beschriebenen Nukleinsäure-Protein-Isolationsversuchen gewonnene Protein ist immunreaktiv. Die isolierte Proteinfraktion wurde auf schnelle Teststreifen für den E. coli-O157-Lateralflussassay aufgetragen.

Die Kontrollen zeigen eine positive Identifizierung in allen Proben, die E. coli O157 enthalten, mit oder ohne Shiga-Toxin-Induktion, wie durch das Vorhandensein von zwei roten Banden sichtbar gemacht wird. Die Daten zeigen außerdem positive Ergebnisse für diejenigen Proben, die E. coli O157 enthalten und bei denen Nukleinsäuren und Proteine mittels der Extraktionspipette aufgearbeitet wurden. Diese Daten zeigen, dass das isolierte Protein aus jeder Probe immunaktiv ist und somit eine positive Reaktion auslöst.

Das isolierte Protein eignet sich für die Elektrophorese, wie hier in einem kumasigefärbten 8 %igen Acrylamidgel dargestellt, das mit BSA beladen wurde, das aus sechs molarem Gudina-Isothiocyanat isoliert wurde. Mithilfe der Extraktions-, Pipettier- und zugehörigen Protokollschritte entspricht die elektrophoretische Mobilität des isolierten Proteins derjenigen der Kontrollproben. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in weniger als 20 Minuten durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein klares Verständnis dafür haben, wie man Proteine und Nukleinsäuren aus dem einfachen Gerät isoliert. Vielen Dank, dass Sie sich die Zeit genommen haben, unser Video anzusehen.