Name: Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Lernen Sie die stromfreie Isolation von PCR-geeigneten Nukleinsäuren und immunreaktiven Proteinen aus Proben mittels Festphasenextraktion in einer Pipette. Diese Methode ermöglicht die Probenvorbereitung ohne Laborinfrastruktur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Mittel für die Entwicklung der Extraktion Pipette wurde zum Teil von einer internen Forschung und Entwicklung Zuschuss für DRP zur Verfügung gestellt.

1. Probenlyse <ol><li> Die Proben sollten in flüssiger Form vorliegen. Wenn Probe ist solide, zum Beispiel Lebensmittel oder Stuhl, sollte die Probe in einem flüssigen Medium wie Wasser oder Phosphat ausgesetzt werden Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Mischen Sie 500 ul der Probe mit 500 ul 6M Guanidinthiocyanat (pH 6,5) in einer 1,5-ml-Tube. </li><li> Drücken Sie den Kolben der Pipette ein Extraktionsverfahren, die Vertreibung der Umgebungsluft. </li><li> Ziehen Sie den ganzen 1 mL Probe in die Pipette Extraktion, über dem Sorptionsmaterial, indem sie die Glühbirne langsam zu erweitern. </li><li> Kehren Sie die Extraktions-Werkzeug, so dass die Perlen Sorbens und Probe Drain in der Birne. </li><li> Schleifen Sie die Sorbens-Kügelchen, die mit der Probe in der Glühbirne darauf achten, daß die Probe aus der Extraktion zu vertreiben Pipette. </li></ol> 2. Nukleinsäure-Extraktion (Abbildung 1, Teil A) <ol><li> Kehren Sie die Extraktion Pipette (Öffnung nach unten) und zu vertreiben, die Probe in der ursprünglichen 1,5 ml Tube. </li> &lt;li&gt; Ziehen Sie den ganzen 1 mL Probe in die Extraktion Pipette, die über das Sorbens, mit mäßiger Geschwindigkeit, dabei darauf achten, das Sorbens in den Hals der Pipette Extraktion zu halten. </li><li> Vertreibt die gesamte Probe in das 1,5 ml Tube durch Drücken der Glühbirne. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2 und 2.3, vorbei an der Probe über den Sorptionsmittel vier weitere Male für insgesamt 5 Durchgängen. </li><li> Nach dem fünften Durchlauf über das Sorbens, vertreiben die gesamte 1 mL Probe in 4 ml der Protein-Extraktions-Puffer (in einem 15 ml konischen Röhrchen), schließen Sie das Rohr, und beiseite stellen für die spätere Verwendung. </li><li> Waschen der isolierten Nukleinsäuren, indem 1 ml 95% Ethanol in den Sorbens dreimal Rücksendung der Ethanol in seine ursprüngliche Röhre auf letzte Passage. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,6 unter Verwendung einer zweiten 1 mL, 95% Ethanol waschen. </li><li> Drücken Sie kurz die Lampe für 5 Minuten, vorbei an der Luft in die Pipette, um die Extraktion von Nukleinsäuren / Sorbensbett trocknen. Wischen restliche Ethanol von der Spitze der Pipette Extraktion usingen ein Kimwipe. </li><li> Wiederherstellen der Nukleinsäuren, indem 250 ul 10 mM Tris (pH 6,8) über die Sorbens fünfmal. Die Tris-Puffer kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung, wie PBS ersetzt werden. Die resultierende Lösung enthält die extrahierten Nukleinsäuren. </li></ol> 3. Protein-Extraktion (Abbildung 1, Teil B) <ol><li> Mischen Sie die Probe-und Protein-Extraktionspuffer Rohr von 2,5 Schritt durch Umdrehen und gehen etwa zwei bis drei Milliliter dieser 5 ml Probe über dem Sorbens Extraktion eines neuen Pipette. </li><li> Austreiben des gesamten Probe in der gleichen 15 ml konischen Röhrchen darauf achten, das Sorptionsmittel in den Hals der Extraktion Pipette zu halten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2, vorbei an der Probe über den Sorptionsmittel 15-mal. </li><li> Waschen des Sorbens und das gebundene Protein, indem 1 ml 95% Ethanol über das Sorptionsmittelbett dreimal Ausstoßen der Ethanol in seiner ursprünglichen Rohres. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3,4 unter Verwendung einer zweiten 1 mL, 95% Ethanol waschen. </li><html><li> Drücken Sie kurz die Lampe für 5 Minuten, vorbei an der Luft in der Gewinnung Pipette, um das Protein / Sorbensbett trocknen. Wischen restliche Ethanol von der Spitze der Pipette unter Verwendung der Extraktion einem Kimwipe. </li><li> Recover, die das Protein, indem man 250 ul PBS über die Sorbens fünfmal. Der PBS-Puffer kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung, wie 10 mM Tris (pH 6,8) ersetzt werden. Die resultierende Lösung enthält, die das Protein der Probe. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="1A" /> Abbildung 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Inhalt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5.

<ol><li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries%2C+1984-2005%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li>
<li>Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample%5BTitle%5D)+AND+%22United+States+Patent+and+Trademark+Office%22%5BJournal%5D)">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li>
<li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li>
<li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li>
<li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+Genetic+Switch%3A+Phage+Lambda+Revisited%22">A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited</a>. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).</li>
<li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Werkzeug-, Chemie-und Protokoll in diesem Bericht beschriebenen repräsentieren die erste bekannte Beispiel eines Strom-frei, Multi-Extraktion Makromolekül, das in Feld-basierte Point-of-Care-Anwendungen genutzt werden können. Beide Typen können Makromolekül eine Reihe von nachgeordneten diagnostische oder analytische Vorrichtungen angewendet werden. Zum Beispiel sind die isolierten Nukleinsäuren PCR Qualität (2 und 3), während die Protein-Komponente der Probe immunreaktiv ist (Abbildung 4). Die Verwendung dieser Absauganlage in herber oder Ressource begrenzte Bereiche der Welt könnte drastisch reduzieren die Belastung durch Krankheiten auf die dort lebenden Bevölkerungen. Diese Extraktion System könnte auch in Krankheitsüberwachung Programme in der ganzen Welt zu helfen, indem sie eine robuste und dennoch schnelle und kostengünstige Methode zur Probenaufbereitung in herber oder entfernten Standorten. Ein wichtiger Aspekt der oben beschriebenen Extraktionsverfahren ist, dasses kann vom Benutzer geändert werden. Zum Beispiel in Fällen, wo die Probe eine Größe größer oder kleiner als die ersten 500 μLs (Schritt 1.2), kann der Benutzer das Volumen der Reagenzien entsprechend. Das heißt, das volumetrische Verhältnis der Reagenzien zu der Probe Größe sollte konstant bleiben, während die absoluten Mengen geändert werden kann. Außerdem können Anpassungen in der Anzahl der Durchgänge über die Sorbens auch nach Ermessen des Benutzers erfolgen. Zum Beispiel, wenn ein größeres Probenvolumen verwendet wird, wobei das Gas in den Sorbens öfter als aufgeführt (Schritte 2.4 und 3.3) erhöht die Wahrscheinlichkeit des Makromoleküls Typ (Nucleinsäure oder Protein) Kontaktieren des Sorbens. Der Anstieg der Passagen sollten erhöhen die Effizienz zu erfassen, bis Sorbens Sättigung erreicht ist. Wir haben festgestellt, dass der Extraktions-Werkzeug und die damit verbundenen chemischen einige Einschränkungen, die bedeutendste davon, dass die Protein-Extraktions-Chemie ineffizient für die Verwertung von hochglykosylierte ist habenProteine. Für den Fall, dass der stromabwärtige Diagnose eines glykosylierten Proteins abzielt, kann dieses System nicht ideal für die Identifizierung. Darüber hinaus werden die oberen und unteren Grenzen für die Gewinnung für entweder Nukleinsäuren oder Proteine ​​noch bestimmt wird, und die Optimierung im Gange, um Rückgewinnung zu maximieren. Die weitere Entwicklung des Werkzeugs wird der Überwindung dieser aktuellen Wissenslücken.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Guanidinthiocyanat </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-Propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109.827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

strom-free, sequential nukleinsäure-und protein isolation

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditionelle und entstehende Krankheitserreger wie Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, oder Prion-basierten Krankheiten sind von großem Interesse für Regierungen, Industrie und medizinische Fachkräfte weltweit. Zum Beispiel sind EHECs, mit Shigella kombiniert, verantwortlich für den Tod von etwa 325.000 Kinder pro Jahr und sind besonders häufig in den Entwicklungsländern, wo Labor-basierte Identifikation, gemeinsam in den Vereinigten Staaten, nicht verfügbar ist 1. Die Entwicklung und den Vertrieb von Low-Cost, konnte Feld-basierte Point-of-Care-Tools, um bei der schnellen Identifizierung und / oder Diagnose von Krankheitserregern oder Krankheitsmarker helfen dramatisch verändern Krankheitsverlauf und die Prognose der Patienten. Wir haben ein Werkzeug, um Nukleinsäuren und Proteinen aus einer Probe durch Festphasenextraktion (SPE) zu isolieren, ohne Elektrizität oder assoziierten Laborgeräte 2 entwickelt. Die isolierten Makromoleküle können für die Diagnose verwendet werdensis entweder in einem Labor oder nach vorne über das Feld-basierte Punkt-of-Care-Plattformen. Wichtig ist, bietet diese Methode für den direkten Vergleich von Nukleinsäuren und Proteinen Daten aus einer ungespalteten Probe und bietet ein Vertrauen durch Bestätigung der Genom-und Proteomanalyse. Unsere Isolation Werkzeug verwendet den Industriestandard für die Festphasen-Isolierung von Nukleinsäuren, die BOOM-Technologie, die von Nukleinsäuren aus einer chaotropen Salzlösung, in der Regel Guanidinisothiocyanat, durch Bindung an Siliciumdioxid basierende Teilchen oder Filter 3 isoliert. CUBRC proprietären Festphasenextraktion Chemie wird verwendet, um Protein aus chaotropen Salzlösungen zu reinigen, in diesem Fall aus dem Abfall oder Durchflussgefäße nach Nukleinsäure-Isolierung 4. Durch die Verpackung Chemikalien in eine kleine, kostengünstige und einfache Plattform gut charakterisierten, haben wir ein tragbares System zur Nukleinsäure-und Protein-Extraktion, die unter einer var durchgeführt werden können, erzeugtiety von Bedingungen. Die isolierten Nukleinsäuren sind stabil und können zu einer Position, zur Verfügung steht für die PCR-Amplifikation transportiert werden, während der Proteingehalt kann sofort der Hand gehalten oder anderen immunologischen-basierten Assays analysiert werden. Die rasche Identifizierung von Krankheiten Marker im Bereich erheblich verändern könnte der Patient Ergebnis, indem er den richtigen Verlauf der Behandlung in einem früheren Stadium des Fortschreitens der Krankheit. Das Werkzeug und ein Verfahren beschrieben, eignen sich zur Verwendung mit nahezu jeder Erreger und bieten dem Anwender die Redundanz der Multi-Makromolekül-Typ-Analysen bei gleichzeitiger Reduzierung der logistischen Aufwand.

Nukleinsäure-Isolierung: Isolierte Nukleinsäuren sind PCR-amplifizierbare und frei von Protein Verunreinigungen. Beispiel 1: Die gewonnenen Nukleinsäuren sind für die Verwendung in PCR-basierte Anwendungen. Zum Beispiel zeigt 2 die Verstärkung des Shiga-Toxin-Gene mit enterohämorrhagischen E. zugeordnet coli O157: H7-Stamm EDL-933 (ATCC # 35.150) von einer Nukleinsäure / Protein-Extraktionsverfahren unter Verwendung der Extraktion Pipette. Die Shiga-Toxin-Gene stx 1 und stx 2 sind auf gemäßigten Bakteriophagen Lambda-like und defekten Bakteriophagen in diesem und anderen enterohämorrhagische E. gefunden coli-Stämme unter der Kontrolle des P R Promotors 5 6 7 8. Die Aktivierung des SOS-Reaktion in E. coli führt zur Induktion und / oder Toxinproduktion 9 Prophagen. Wir haben eine modifizierte Version des Multiplex-PCR-Assay von Feng et al genutzt werden. 11 zur Identifizierung des stx 1 und stx 2 Gene sowohl in Kultur und Spike Abwasserproben. Die Spuren A und B in 2 zeigen die Ergebnisse einer PCR-Amplifikation eines unverarbeiteten Kulturprobe (Spur A) und einer verarbeiteten Kulturprobe (Spur B). Diese Ergebnisse sind praktisch identisch Sinn gibt es keinen Verlust der Treue in der verarbeiteten oder isolierten Nukleinsäuren. Wir nächste Stachelwalze Rohabwasser (Spur D) oder isolierten Nukleinsäuren aus dotierten Abwasser (Spuren E &amp; F) verstärkt. Diese Daten zeigen, dass die isolierten Nucleinsäuren in größere Verstärkung im Vergleich zu den nicht isolierten Nukleinsäuren aus dotierten Abwasserproben geführt. Wir schließen daraus, dass entweder PCR-Inhibitoren natürlich im Abwasser nach der Isolierung vor der Aufhebung oder dass die Nukleinsäuren wurden nach der Isolierung eingeengt. Eine Kombination dieser beiden Hypothesen ist ebenfalls möglich. UV-Spektroskopie wurde als nächstes verwendet werden, um zu zeigen, dass die isolierten Nukleinsäuren relativ frei waren of Mengen an Protein. Abbildung 3 zeigt die UV-Spektren von zwei E. coli O157: H7-Nukleinsäure-Extraktionen markierten Isolierung ein und Isolierung b, im Vergleich zu der normalisierten Spektrums der Bakterienkultur, markierten prä-Isolation. Die UV-Spektren der isolierten Nukleinsäuren ähnelt der Spektren reiner Nukleinsäuren, mit einem berechneten Verhältnis der Extinktion zwischen 260 nm und 280 nm 1.8 10 nähert. Diese Daten zeigen, dass es eine sehr kleine Mengen an Protein in der Nukleinsäure-Fraktion gewonnen unter Verwendung der Technik beschrieben. Proteinisolierung: gewonnene Protein aus der Nukleinsäure / Protein Isolationsexperiment immunreaktiv ist und elektrophoretisch identisch reines Protein. Beispiel 2: Das isolierte Protein-Fraktion wurde in der RapidChek E. angewendet coli O157 Lateral-Flow-Assay-Streifen (SDIX, Inc.). Kontrollen zeigen eine positive Identifikation in allen Proben beherbergt, E. coli<html> O157, mit oder ohne STX Induktion (Abbildung 4, Spuren B bzw. C). Die Daten in Abbildung 4 zeigen auch positive Ergebnisse für die Proben, beherbergen E. coli O157, die für Nukleinsäuren und Proteine ​​dann mit der Pipette Extraktion verarbeitet wurden. Diese Daten zeigen, dass das isolierte Protein von jeder Probe immunreaktiv ist damit das Auslösen einer positiven Resonanz. PCR-Amplifikation (wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde auf die Protein-Proben durchgeführt, um zu zeigen, dass das isolierte Protein-Fraktion frei von kontaminierenden Nukleinsäuren war. Die Ergebnisse für diese Experimente waren alle durch Gelelektrophorese negativ. Daraus schließen wir, dass der Proteingehalt der Probe von kontaminierenden Nukleinsäuren wurde abgetrennt. Diese Ergebnisse, im Ganzen mit denen für die Nukleinsäure-Isolierung Schritt zeigen, dass die Nukleinsäuren-und Protein-Gehalt in separaten Fraktionierung Schritte werden beschrieben isoliert genommen. t &quot;&gt; Beispiel 3:. Das isolierte Protein geeignet ist für die Elektrophorese 10 Abbildung 5 zeigt eine Coomassie gefärbt 8% Acrylamid-Gel mit BSA (5, Spuren A und C) und BSA geladen aus 6 M Guanidin-Isothiocyanat-Extraktion unter Verwendung der Pipette und zugehörigen isoliert Protokoll. Die elektrophoretische Mobilität des isolierten Proteins ist identisch mit der Kontrollproben. Wir schließen daraus, dass das Extraktionsverfahren ändert nichts an der kovalenten Struktur des isolierten Proteins. <img alt="Abbildung 1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> Abbildung 1, Teil A: Darstellung eines typischen Nukleinsäure Extraktionsverfahren Die Probe wird mit 6 M Guanidin-Thiocyanat in das Probenröhrchen vermischt und in den Sorbens fünfmal.. Nach dem letzten Durchgang, wird die Probe auf der Protein-Puffer zugegeben. Die Sorptionsmittel und gebundenen Nukleinsäuren werden zweimal mit Ethanol gewaschen. Die Probe wird dann Luft dRied und eluiert aus dem Sorbens. <img alt="Abbildung 1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> Abbildung 1, Teil B: Darstellung eines typischen Protein-Extraktions-Verfahren wird die Probe mit Proteinisolierung Puffer aus Schritt 1, Abbildung 1, Abbildung A über das Sorbens von einer zweiten Extraktion Pipette 15 Mal übergeben wird gemischt.. Der Rest des Verfahrens ist identisch mit der Nukleinsäure-Extraktion-Protokoll. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> 2:. Negatives Bild eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel Multiplexsignal Shiga-Toxin 1 und 2-Gen-Amplifikation wurde unter Verwendung Kulturproben (Bahnen A und B) oder Rohabwasser Proben mit E. versetzt coli O157: H7 (Spuren D, E und F). Die Proben wurden entweder direkt an ein PCR-Gefäß (Bahnen A und D) oder den Proben zugegeben wurden unter Verwendung der Isolation-Verarbeis und die extrahierten Nukleinsäuren wurden zur PCR-Reaktionsgefäß (Proben B, E und F) zugegeben. Das PCR-Protokoll ist eine Modifikation des einen von Feng et al 11 beschrieben. Unsere Modifikation nur die von der STX-1 (unteres Band) und stx 2 (oberes Band) Primerpaare amplifiziert gezielten Ausstieg aus alle anderen Primerpaare. Lane C ist die 1 Kb Leiter von BioRad. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> Abbildung 3: UV-Spektroskopie Ergebnisse von E. coli O157: H7 Nukleinsäuren isoliert mit der Extraktion berichtet Pipette Die isolierten Nukleinsäuren markiert sind, eine Trennung und Isolation. b. Das UV-Spektrum der Probe wurde auch vor Nukleinsäureextraktion getestet und markierten prä-Isolation. Die Spektren wurden unter Verwendung eines Hitachi U3010 Spektrophotometer und der zugehörigen Software-Paket. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt;. Abbildung 4: Farbfoto von RapidChek Teststreifen Der Proteingehalt der Proben in Abbildung 2 verwendet wurde unter Verwendung des Pipetten-Extraktion und getestet für Immun-Reaktivität von Lateral-Flow-Assay. AC Lanes sind unverarbeitete Kontrollen, das heißt, Zellkultur wird auf den Teststreifen wurde ohne Nukleinsäure oder ein Protein Extraktion zugegeben. Ein Lane ist E. coli BL21 DE3 pLysS als negative Kontrolle, Spuren B und C zeigen, E. coli O157: H7, die unbehandelt (B) oder mit Mitomycin C für 4 Stunden (C) behandelt worden war. Lanes D bis H zeigen die Ergebnisse der Addition der extrahierten Proteins auf die Lateral-Flow-Teststreifen. Lanes D und E wurden sondiert mit Proteinextrakt aus E. coli BL21 DE3 pLysS entweder ohne (D) oder mit Mitomycin C behandelt (E) als negative Kontrollen. Lanes FH zeigen die Ergebnisse, wenn das extrahierte Protein aus E. coli O157: H7 verwendet. Das Protein wurde von unbehandelten (F), oder 2 Stunde (G) oder 4 Stunden (H) Mitomycin C behandelten Kulturen extrahiert.Positive Ergebnisse produzieren eine doppelte rote Linie. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> Bild 5:. Fotografie eines mit Coomassie gefärbten SDS-PAGE BSA wurde von der Lösung unter Verwendung der Extraktion Pipette und beschriebenen Protokollen isoliert. Lanes A und C sind Kontrollbahnen von 250 ug / ml und 500 pg / ml. Spuren B und D zeigen gewonnen BSA aus Lösungen, die die gleichen Konzentrationen wie ihre jeweiligen Steuerelemente.

Ein Gerät mit Chemikalien werden beschrieben, um sequentiell Isolierung von Nukleinsäuren durch Proteine ​​aus einer Probe ohne Einsatz von Elektrizität an. Das Werkzeug besteht aus einem Sorptionsmittel innerhalb einer Transferpipette gehalten, während die Isolation Chemie auf Festphasenextraktion Prinzipien beruhen. Die isolierten Makromoleküle durch Immun-basierten und PCR-basierten Assays analysiert werden.

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Traditionelle und neu auftretende Pathogene wie enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis oder Prionenkrankheiten sind von erheblicher Bedeutung ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, PCR-fertige Nukleinsäuren und immunreaktive Proteine aus einer Probe zu isolieren, ohne auf Strom oder Laborinfrastruktur angewiesen zu sein. Die Isolierung von Nukleinsäuren in Proteinen beginnt mit dem Mischen der Probe mit Guanidin und Thiocyanat, um die Probe aufzulysieren, und dem Durchlaufen der Mischung über das Sorbens in der Extraktionspipette. Fünfmal nach dem fünften und letzten Durchlauf über das Sorbens wird die Mischung in Puffer für die Proteinextraktion gegeben und zur Isolierung des immunreaktiven Proteins beiseitegestellt.Anschließend werden das Sorbens und die daran gebundenen Nukleinsäuren durch Überführen von 95 % Ethanol über das Sorbens gewaschen. Mehrfach werden das Sorbens und die gebundenen Nukleinsäuren anschließend getrocknet, indem fünf Minuten lang Umgebungsluft über das Sorbens geleitet wird. Der letzte Schritt zur Gewinnung PCR-fähiger Nukleinsäuren besteht darin, die Nukleinsäuren mithilfe von 250 Mikrolitern Tris oder einer anderen ähnlichen wässrigen Lösung vom Sorbens zu eluieren, um das immunreaktive Protein zu isolieren.Nach dem Mischen der Probe und des Proteinaufschlusspuffers die Mischung mithilfe einer zweiten Extraktionspipette 15-mal über das Sorbens leiten. Anschließend wird das Sorbens mit gebundenem Protein gewaschen, indem mehrmals 95 % Ethanol über das Sorbens geleitet wird. Danach werden das Sorbens und das daran gebundene Protein getrocknet, indem fünf Minuten lang Umgebungsluft über das Sorbens geleitet wird.Der letzte Schritt des Protokolls besteht darin, das Protein aus dem Sorbentienmaterial zu eluieren. Letztendlich ermöglicht die in diesem Verfahren verwendete Extraktionspipette die elektrizitätsfreie Isolierung von PCR-fähigen Nukleinsäuren und immunreaktiven Proteinen. Hallo, mein Name ist Dave Pawlowski.Ich bin leitender Wissenschaftler bei Kubrick Incorporated in Buffalo, New York, und heute werden wir eine Methode kennenlernen, mit der sowohl Proteine als auch Nukleinsäuren inline isoliert werden können, ohne dass vor der Probelyse eine Zentrifuge, ein Vortex oder sonstige zusätzliche Laborgeräte benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass die Proben in flüssiger Form vorliegen. Falls die Probe fest ist, beispielsweise Lebensmittel oder Stuhl, sollte sie in einem flüssigen Medium wie Wasser oder gepuffertem Kochsalzlösung (phosphate buffered saline) suspendiert werden.Mischen Sie 500 Mikroliter der Probe mit 500 Mikrolitern sechs molarer Guanidin-Thiocyanat in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Danach drücken Sie den Kolben einer Extraktionspipette zusammen, um die umgebende Luft zu entlassen. Ziehen Sie das gesamte eine Milliliter umfassende Probenmaterial über das absorbierende Material in die Extraktionspipette, indem Sie den Kolben langsam expandieren lassen.Drehen Sie das Extraktionswerkzeug um, sodass die Sorbentienperlen und die Probe in den Kolben ablaufen. Mahlen Sie die Sorbentienperlen mit der Probe im Kolben, wobei darauf zu achten ist, dass die Probe nicht aus der Extraktionspipette herausgedrückt wird.Drehen Sie die Extraktionspipette um und geben Sie die Probe in die ursprüngliche 1,5-Milliliter-Röhrchen ab. Ziehen Sie die gesamte einkommende Probe von einem Milliliter in die Extraktionspipette, wobei Sie den Sorbentienkolben mit mäßiger Geschwindigkeit passieren. Achten Sie darauf, den Sorbentienkolben im Hals der Extraktionspipette zu halten, und drücken Sie die gesamte Probe durch Betätigen des Balgs in das 1,5-Milliliter-Röhrchen ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Probe insgesamt fünfmal über die Säule laufen lassen, also noch viermal zusätzlich. Nach dem fünften Durchlauf über die Säule geben Sie die gesamte einteilige Probe von einem Milliliter in vier Milliliter Puffer zur Proteingewinnung in ein 15-Milliliter-Konischgefäß ab. Mischen Sie das Gefäß durch mehrfaches Vorsichtig Umstülpen, verschließen Sie es anschließend und stellen Sie es für später beiseite.Spülen Sie die isolierten Nukleinsäuren, indem Sie ein Milliliter 95 %igen Ethanol dreimal über die Säule laufen lassen und das Ethanol jeweils in den ursprünglichen Probengefäß zurückführen. Führen Sie nach dem letzten Durchlauf den Spülvorgang dreimal mit einem zweiten Milliliter 95 %igem Ethanol durch. Der nächste Schritt des Verfahrens ist das Trocknen der Säule; die Rückgewinnung der Nukleinsäuren gelingt am besten, wenn die Säule vollständig trocken ist.Ich weiß, dass dieser Schritt mühsam ist. Wenn Sie diesen Schritt jedoch innerhalb des empfohlenen Zeitraums abschließen, werden Ihre Ergebnisse besser sein. Drücken und lösen Sie die Birne fünf Minuten lang.Umgebende Luft durch die Extraktionspipette leiten, um die Nukleinsäuren und die Sorbentenschicht zu trocknen, und verbleibendes Ethanol von der Spitze der Extraktionspipette abwischen. Mit einem Kim-Tuch die Nukleinsäuren gewinnen, indem 250 Mikroliter 10 Millimolar Triss fünfmal über das Sorbent geführt werden. Der Triss-Puffer kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung wie PBS ersetzt werden.Die resultierende Lösung enthält die extrahierten Nukleinsäuren. Um zuerst die Proteinextraktion durchzuführen, mischen Sie die Probe in dem zuvor beiseitegestellten Proteinextraktionspuffer, indem Sie etwa zwei bis drei Milliliter dieser fünf Milliliter Probe über das Sorbens einer neuen Extraktion pipettieren. Geben Sie die gesamte Probe in denselben 15-Milliliter-Konikalzylinder ab. Achten Sie dabei darauf, das Sorbens im Hals der Extraktionspipette zu belassen.Wiederholen Sie diesen Vorgang. Führen Sie die Probe 15-mal über das Sorbens. Waschen Sie das Sorbens und das gebundene Protein, indem Sie dreimal je ein Milliliter 95 % Ethanol über die Sorbenssäule laufen lassen, und geben Sie das Ethanol in die ursprüngliche Probengefäßröhre ab. Führen Sie anschließend einen weiteren Waschschritt dreimal mit einem zweiten Milliliter 95 % Ethanol durch.Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, das Sorbens erneut zu trocknen. Wie bei Nukleinsäuren wird die Proteinrückgewinnung am besten durchgeführt, wenn das Sorbens getrocknet ist. Für einen längeren Zeitraum.Drücken Sie die Birne für fünf Minuten und lassen Sie sie dann los, um Umgebungsluft durch die Extraktionspipette zu leiten. Um die Proteinsorbentschicht zu trocknen, wischen Sie das restliche Ethanol von der Spitze der Extraktionspipette ab. Gewinnen Sie das Protein, indem Sie mit einem Kim-Tuch 250 Mikroliter PBS fünfmal über das Sorbens geben.Der PBS-Puffer kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung ersetzt werden, beispielsweise 10 Millimolar Tris, pH 6,8. Die resultierende Lösung enthält den Proteingehalt der Probe. Die mit dem enterohämorrhagischen Escherichia coli O157:H7-Stamm EDL 933 assoziierten Shiga-Toxin-Gene wurden aus einem Nukleinsäure-Protein-Extraktionsverfahren mittels der Extraktionspipette amplifiziert.Die Shiga-Toxin-Gene, Shiga-Toxin 1 und Shiga-Toxin 2, befinden sich auf temperenten, Lambda-ähnlichen Bakteriophagen und defekten Bakteriophagen unter Kontrolle des PR-Promotors. Die Aktivierung der SOS-Antwort in E. coli führt zur Prophageninduktion und/oder Toxinproduktion. In diesem Fall kommt es zu einem starken Anstieg der Amplifikation des Shiga-Toxin-2-Gens, wenn die SOS-Antwort durch Mitomycin C induziert wird, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.Dies deutet auf eine Prophageninduktion und die Replikation des Phagen-Genoms hin. Das aus den im Video beschriebenen Nukleinsäure-Protein-Isolierungsversuchen gewonnene Protein ist immunreaktiv. Die isolierte Proteinfraktion wurde auf schnelle Check-e-coli-O-1-57-Lateralfluss-Teststreifen aufgetragen.Die Kontrollen zeigen eine positive Identifizierung in allen Proben, die E. coli O157:H7 enthalten, unabhängig von einer Shiga-Toxin-Induktion, wie durch das Vorhandensein von zwei roten Banden sichtbar gemacht wird. Die Daten zeigen außerdem positive Ergebnisse für diejenigen Proben, die E. coli O157:H7 enthielten und bei denen Nukleinsäuren und Proteine mittels der Extraktionspipette aufgearbeitet wurden. Diese Daten zeigen, dass das isolierte Protein aus jeder Probe immunaktiv ist und somit eine positive Reaktion auslöst.Das isolierte Protein eignet sich für die Elektrophorese, wie hier in einem kumasi-gefärbten 8 %igen Acrylamid-Gel dargestellt, das mit BSA beladen wurde, das aus sechs molarem Gudina-Isothiocyanat isoliert wurde. Mithilfe der Extraktions-, Pipettier- und zugehörigen Protokollschritte entspricht die elektrophoretische Mobilität des isolierten Proteins der Kontrollproben. Sobald die Methode beherrscht ist, kann diese Technik in weniger als 20 Minuten durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein klares Verständnis dafür haben, wie man Proteine und Nukleinsäuren aus dem einfachen Gerät isoliert. Vielen Dank, dass Sie sich die Zeit genommen haben, unser Video anzusehen.

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Isotachophorese (ITP) ist eine robuste elektrokinetischen Trennung und Anreicherungstechnik mit Anwendungen, die von Toxinnachweis zu Probenvorbereitung. Wir prüfen die physikalischen Grundlagen der ITP und die Methodik der Anwendung dieser Technik auf zwei konkrete Anwendungsbeispiele: Trennung und Detektion von kleinen Molekülen und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Zellkultur-Lysat.

On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Quelle: Dembowski, J. A., et al. Aufreinigung viraler DNA zur Identifizierung assoziierter viral bedingter und zellulärer Proteine. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert die Isolierung von Protein–virale DNA-Komplexen aus Zellkernen mithilfe der Click-Chemie und der Reinigung mit magnetischen Bäden. Das Protokoll umfasst die Markierung viraler Genome mit alkinmodifizierten Nukleotiden, die Biotinylierung über eine Click-Reaktion und die Bindung an mit Streptavidin beschichtete...

Isolierung von Proteinen aus viralen DNA-Protein-Komplexen

TruTip ist eine einfache Extraktion von Nukleinsäuren Technologie, bei der eine poröse, monolithische Bindematrix in eine Pipettenspitze eingesetzt ist. Folglich ist die Probenvorbereitung Format kompatibel mit den meisten Liquid Handling Geräte, und kann für viele mittel-bis High-Throughput-klinische Anwendungen und Probe-Typen verwendet werden.

Hochdurchsatz-, Automated Extraktion von DNA und RNA aus klinischen Proben mit TruTip Technologie Gemeinsames Liquid Handling Robots

Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung von Pflanzenviren mit Doppel-Strang DNA Genom. Wir verwenden standard-Methoden zu extrahieren von DNA und RNA aus den infizierten Blättern und Next Generation Sequencing durchzuführen. Bioinformatische Werkzeuge montieren Sequenzen in Contigs, Contigs Vertretung Virus Genome zu identifizieren und Genome taxonomischen Gruppen zuweisen.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Hier wird ein DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen beschrieben, um qualitativ hochwertige DNA-Extraktionen aus Moskitos herzustellen. Diese Extraktionen eignen sich für einen nachgelagerten Next-Generation-Sequencing-Ansatz.

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Pufferkalibrierung von Zellextrakten aus Exonuklease-V-Knockout-Stämmen von Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD und ΔrecB) vorgestellt. Dies ist ein schneller, einfacher und direkter Ansatz für die Expression in zellfreien Proteinsynthesesystemen mit linearen DNA-Vorlagen.

Zellfreie Proteinsynthese aus Exonuklease-defizienten Zellextrakten unter Verwendung linearer DNA-Vorlagen

Ein kurzes Protokoll für Protein-Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in Polyacrylamidgelen wird ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder Essigsäure als in der klassischen Färbeverfahren mit CBB beschrieben.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

Lernen Sie die stromfreie Isolation von PCR-geeigneten Nukleinsäuren und immunreaktiven Proteinen aus Proben mittels Festphasenextraktion in einer Pipette. Diese Methode ermöglicht die Probenvorbereitung ohne Laborinfrastruktur.

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Weitere Videos entdecken