Name: Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Lernen Sie eine automatisierte High-Content-Assay zur Untersuchung von Entzündungen in Zebrafischlarven. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung immunmodulatorischer Bioaktiva durch Echtzeitbildgebung.

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<p class="jove_content"&gt; Wir danken Nadeshda Wolf, Nadine und Susanne Eschen Delong für hervorragende Tierhaltung. CW wurde durch ein Promotionsstipendium des Helmholtz-Programm &quot;unterstützt<em&gt; BioGrenzflächen</em&gt; International Graduate School &#39;(BIFIGS). Weitere Unterstützung wurde von einem KIT-RISC-Stipendium und durch ein Marie Curie International Reintegration Grants im 7. Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (PIRG07-GA-2010 bis 267552) zu CG zur Verfügung gestellt. Marie Curie Initial Training Network (238821) - AHS wurde von BOLD (Biologie der Leber und der Bauchspeicheldrüse Entwicklung und Krankheit) unterstützt. UL wurde von Dopaminet RP7 (Siebte Rahmenprogramm) (223744) unterstützt.</p&gt;

1. Behandlung der Tiere Für das Kinn Assay Verwendung 3 dpf Larven, die sich aus Gruppe Paarungen zwischen homozygoten doppelt transgenen cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 und AB (Wildtyp-) Fisch. Sammle Embryonen, die durch natürliche Laichen und heben Sie sie bei 29 ° C in E3 Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4 und 0,1% Methylenblau, äquilibriert, um pH 7,0) in Petrischalen. Es ist wichtig, um eine Dichte von Embryonen, die nicht mehr als 50-70 Platte zu halten. 2. Larva Sortierung Überprüfen Sie alle Larven unter einem Fluoreszenz-Stereoskop für fluoreszierenden Reporter Ausdruck, spontane Entzündung und entsprechende altersabhängige Entwicklung. 3. Siebmediums Vorbereitung (immer frisch ansetzen) Planen E3-Medium ohne Methylenblau mit DMSO (1% Endkonzentration) und MS222 (0,05 g / l) ergänzt. 4. CuSO4Vorbereitung (immer frisch ansetzen) Erste abwiegen CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) und bereiten eine 20 mM Stammlösung in dH 2 O. Bereiten 120 uM CuSO 4-Arbeitslösung (von 20 mM Stammlösung) in E3/DMSO (1%) / MS-222. Schützen Sie CuSO 4-Lösung von Licht. 5. 384-Well-Platte Vorbereitung (Greiner 384 Well Mikrotiterplatten) Pre-+ 20 ul E3/DMSO (1%) / MS-222 in jede Vertiefung mit einem umgekehrten Pipette. Eine erhöhte Pipettenspitze Bohrung ist erforderlich, um die Embryonen vorsichtig damit umgehen, ohne jegliche Verletzung zuzufügen, dies wird durch Schneiden Sie die Spitze auf eine 2 mm Bohrung durchgeführt. Übertragen Sie einzelne Larve in 74 ul Medium in jede Vertiefung (84 ul für unbehandelte Kontrolle). Wenn nötig, mit Orientierung Larven in einer lateralen Position innerhalb des auch eine flexible Eppendorf Microloader Pipettenspitze (Eppendorf, 5242 956,003). Führen Sie alle folgenden Schritte Liquid-Handling-Roboter mit einer FlüssigkeitHandling Workstation um eine gleichzeitige Behandlung aller Larven zu gewährleisten. 6. Medikamentöse Behandlung Mischen Verbindungen in Drug Stock Platte 5-mal durch Auf-und Abpipettieren. In 16 ul 7,5-fach Drug Stock Platte in jede Vertiefung und mischen Sie 5-mal. Passen Spitze Position innerhalb Brunnen, um Verletzungen der Larven zu verhindern und verzichten auf das Medium 10 pl / s. Mischen Medium in Wells 4-mal, um eine homogene Verteilung des Arzneimittels innerhalb des Bohrlochs zu gewährleisten. 7. Incubation Inkubieren Abschirmblech für 1 h bei 29 ° C mit Alufolie bedeckt, um Verbindungen sowie CuSO 4 vor Licht schützen. 8. Chemische Verwundender In 10 ul 120 uM CuSO 4 funktionierende Lösung in jede Vertiefung mit Ausnahme der negativen Kontrollen, mischen und inkubieren 4 mal wieder für 1 h bei 29 ° C. 9. Waschen Entfernen und austauschen 80 ul von mir<html> Medium aus jeder Vertiefung zweimal (in 20 ul-Schritten) zu entfernen und Verbindungen CuSO 4. 10. Image Acquisition Starten der Bildaufnahme auf einem invertierten automatisierten Mikroskop (dh: Olympus scan ^ R) 90 Minuten nach der anfänglichen Behandlung Kupfer. Setzt die initiale z-Ebene, so dass Neuromasten von rechts und links hintere seitliche Linie sichtbar sind. Bild jedes Well einmal pro Stunde in der Kanäle Hellfeld, mit Cy3 und GFP in 4 Fokalebenen (50 mu m Abstand) ein 4-fach-Objektiv (NA = 0,13). Weitere Informationen zu Bild-und Datenverarbeitung sind auf Anfrage erhältlich. 11. Bildverarbeitung 1. Daten sortieren Raw-Bilder werden mit unseren Kunden Software LabView-Skript verarbeitet. Die erste Operation in der Bildverarbeitung Pipeline wird von RAW-Bildern Sortierung vom Mikroskop erzeugten Daten-Ordner von Kanal-, Brunnen-und Zeit-Punkt-Informationen. ove_step &quot;&gt; 2. Erweiterte Tiefenschärfe Anschließend erzeugt die Software erweitert unscharfe Bilder von 4 Brennebenen für jeden der Kanäle. 3. RGB-Overlay In einem letzten Schritt die erweiterten Fokus Bilder aus den 3 Kanälen zusammengeführt werden, um in einem letzten RGB-Overlay-Bild führen. 4. Automatisierte Erkennung Neuromasten Ein Mustererkennungs-Tool (Rapid-IA LabView-Prototyping-Werkzeug) identifiziert Neuromasten in den RGB-Overlay-Bilder und erstellt eine empirisch definierten Bereich von Interesse rund um den Neuromasten. 5. Quantifizierung Innerhalb der empirisch definierten Bereich von Interesse umgebenden verletzten Neuromasten rot fluoreszierenden Leukozyten (wider als rote Pixel) werden ausgewertet, was zu einer primären Auslesen von p ercent ein REA o l durch eukocytes (Paol) ccupied. Im Durchschnitt 95,27 ± 2,11% (FDA1) und 95,12 ±1,56% (FDA2) von Brunnen (Larven) wurden ordnungsgemäß erkannt und haben in der Folge zu weiteren Datenverarbeitung unterzogen worden. Die Rohdaten-Ausgang (Paol für jeden erkannten Neuromasten) in einer txt-Datei gespeichert und dient als Daten-Input für den MATLAB-Skripten, die die Rohdaten weiterverarbeiten. 12. Data Processing 1. Imaps Beurteilung des Erfolgs einzelner Experimente durch grafische Visualisierung der Rohdaten-Ausgang Paol in einem Farbcode konnte mit sogenannten Entzündung Karten (IMAPS) (Abbildung 2) realisiert werden. Leuchtend grüne spiegelt eine hohe initiale entzündliche Index; schwarz bedeutet, dass keine Entzündung. Dies ermöglicht schnellen Überblick zur raschen Identifizierung von gescheiterten Versuchen, die dann von der weiteren Datenanalyse ausgeschlossen werden können. 2. Mittelung von Kontrollen Jede experimentelle Platte enthält 320 Verbindungen spiegelt eineinzelnen Datenpunkt pro Verbindung und Zeit-Punkt-sowie 32 positiven und negativen Kontrollen. Der 32-Steuerung repliziert sind gemittelte und die Standardabweichung berechnet. Für die Kontrollen nur Datenpunkte innerhalb 2 Standardabweichungen enthalten sind. 3. Normalisierung Die Normalisierung wird durch Tabellenkalkulation getan. Der durchschnittliche Wert von DMSO, wobei die Negativkontrolle, wird auf 0 gesetzt und der höchste gemittelten Paol für die Kupfer-Steuerung wird auf 1 gesetzt, so dass die maximale Differenz zwischen dem positiven und negativen Kontrollproben auf 1 gesetzt ist. Jede Verbindung der Paol wird linear interpoliert oder extrapoliert zur jeweiligen Kontrolle über die experimentelle Platte. 4. Abschließende Auslesen: Entzündliche Index Nach einer ausreichenden Wiederholungsversuchen (zB 15) durchgeführt wurden, werden normalisierte Rohdaten Wiederholungsversuchen gemittelt, was zu einer endgültigen Auslesen - die entzündlicheIndex. Die anfängliche Entzündungsreaktion Index des Kupfer-Steuerung beginnt bei 100% für die Zeit-Punkt-Null und korreliert mit der Bildaufnahme Startzeit (90 Minuten nach der anfänglichen Behandlung Kupfer). 5. Monotone Exponentialregression Fitting Aufgrund einer Entzündung Auflösung im Laufe der Zeit führen wir eine monotone nichtlineare Regression exponentiellen Fitting in Richtung der anfänglichen Entzündung durch <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> - A 0 ist ein Maß für die ursprüngliche Antwort bei t = 0, wird ein 1 zu der Steigung der Größe über die Zeit passt. 6. 2-D-Merkmalsraum Plot (Abbildung 4) Um den Merkmalsraum zu erzeugen, wird eine nicht-lineare Regression und einen Cluster-Analyse teilt die Merkmalsraum in charakteristische Bereiche, wodurch eine automatisierte Erkennung von interessanten Kandidaten aus verschiedenen immunmodulatorischen Kategorien (Anti-inflammatORY, Anti-Auflösung, pro-inflammatorische, pro-Auflösung). Alle Verbindungen sind in der 2-D-Darstellung von den Parametern a 0 und a 1 bezogen angezeigt. 13. Datenmanagements und der Datenspeicherung Unsere Daten-Handling-Routinen erstellen Internetseiten zu visualisieren und zu repräsentieren, wie Drogen-Bildschirme bieten einen schnellen Überblick über die Bild-und Datenverarbeitung Schritte &#39;Ergebnisse sowie eine detaillierte Ansicht, wenn durch den Benutzer 10 angefordert. Soft-Links zu anderen relevanten heterogenen biologischen und chemischen Datenbanken sowie um eine wertvolle Ressource für vergleichende Studien und Roman 11 vorzusehen integriert. Durch diese Routinen werden die Daten richtig Normen und Metainformationen für die langfristige Speicherung dieser Daten eingestellt. 14. Repräsentative Ergebnisse In einer Pilotstudie Bildschirm analysierten wir eine Bibliothek, bestehend aus 640 FDA zugelassen bekannten bioaktiven Verbindungen für Auswirkungen auf die Initiation, Progression oder Auflösung eines Granulocytic Entzündungsreaktion. Basierend auf der beobachteten Effekte wir klassifiziertes 4 Arten von immunmodulatorischen Phänotypen, die ein Anzeichen sein für verschiedene Wirkmechanismen kann: anti-inflammatorische (1), Anti-Auflösung (2), pro-inflammatorische (3) und pro-Auflösung (4) , welche mit den Parameter a 0 und 1, die von einer monoton nicht-lineare Regression Armatur (E + ao ALX -) entstehen beschrieben in Richtung der ersten Entzündung. A 0 repräsentiert die Größe der Entzündungsreaktion während ein 1 charakterisiert die Steigung der Kurve und beschreibt somit Entzündung die Lösung. Anzeigen aller Verbindungen in einem 2-D-Merkmalsraum Grundstück (A 1 im Vergleich zu einem 0) ermöglicht die automatisierte Identifizierung von Kandidaten schlagen aus den verschiedenen Kategorien immunmodulatorische (Abbildung 3). 45. Stelle von 640 Verbindungen ausgeübt signifikante anti-inflammatorische Wirkung durch Reduktion der entzündlichen ersten Index zu 50% oder weniger. Innerhalb this Kategorie fanden wir sechs Verbindungen aus der pharmakologischen Klasse der nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs), Bestätigung der Gültigkeit unseres Ansatzes. Allerdings rangiert NSAR nicht zu den stärksten entzündungshemmenden Medikamenten. Abgesehen von den NSAR fanden wir einige zusätzliche pharmakologische Wirkstoff-Klassen wie zum Beispiel Angiotensin-Rezeptorblocker (ARB), Antibiotika und Protonenpumpenhemmern. 7 Verbindungen erfüllten die Kriterien empirisch definierte Schwelle für potenzielle Pro-Auflösung Drogen. 18 Drogen übten einen pro-inflammatorische Wirkung, was zu übertriebenen Leukozytenrekrutierung verletzt Neuromasten im Vergleich zu den positiven Kontrollen. Nur 2-Verbindungen verhindert rechtzeitige Lösung der Entzündungsreaktion. Die entzündungshemmende Wirkung der mehrere Hit-Kandidaten (exemplarische Kandidaten aus oben genannten pharmakologischen Wirkstoffklassen) aus dem Pilot-Bildschirm could in einer Dosis-abhängigen Weise in den nachfolgenden sekundären Assays Chin (Daten nicht gezeigt) bestätigt werden. Eine Wiederholung von 4 potentiellen pro-Auflösung Medikamente nicht bestätigen Sie die angegebene Wirkungsweise wie in der primären Bildschirm ausgeübt. 2 der Medikamente einen leichten entzündungshemmend bei höheren Konzentrationen (20 pM). Ein drittes Medikament zeigte eine marginale Nicht-Dosis-abhängigen anti-inflammatorische Wirkung Arzneimittelkonzentrationen im Bereich von 5 bis 20 uM. Die vierte Droge hatte keine Wirkung auf die entzündliche Reaktion bei den getesteten Konzentrationen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Abbildung 1. Workflow des Chin-Assay. Einzelne Verbindung transgenen cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 Larven (3 DPF) werden von Hand in 384-Well Mikrotiterplatten verteilt. Drogen werden gleichzeitig in jede Vertiefung mit einem Zephyr Compact Liquid Handling Workstation hinzugefügt. Die Testplatten werden dann für 1 h bei 29 ° C inkubiert Die Behandlung mit CuSO 4 </sub&gt; - Lösung (10 uM Endkonzentration) für 1 h zufügt, die Verwundung und initiiert eine akute entzündliche Reaktion. Schließlich werden Kupferlösung und Drogen abgewaschen und automatisierte Bildaufnahme gestartet wird (90 Minuten nach der anfänglichen Behandlung Kupfer). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Abbildung 2. . Übersicht Bild von RAW-Bildern Die Abbildung zeigt RAW-Bilder von 4 Fokalebenen (Z = 0 - 3) im Abstand von 50 um in den Kanälen Cy3 (links) und GFP (rechts) sind. Arrows (Z = 1,2) zeigen beispielhaft Neuromasten, Pfeilspitzen (Z = 1,2) Punkt zu geclusterten Leukozyten um Neuromasten. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Abbildung 3. Entzündung Maps (IMAPS) Der Erfolg der einzelnen Versuche in imaps was die Entzündungsreaktion (Rohdaten) in einem Farbcode beurteilt werden kann:. Hellgrün spiegelt eine hohe anfängliche Inflation<html> mmatory Antwort; schwarz bedeutet, dass keine Entzündung imaps Zum Zeitpunkt 0 (links) und Zeit-Punkt 5 (rechts) zeigen deutlich, ob ein Experiment in weiteren Datenverarbeitung einbezogen werden sollten.. Kupfer Kontrollen (Zeile 13 und 24) zeigen sich in unterschiedlichen Schattierungen von Grün, während DMSO Kontrollvertiefungen (Zeile 1 und 12) in dunkelgrün oder schwarz erscheinen. Zum Zeitpunkt-Nummer 5 wird eine Entzündung fast in Kupfer Kontrollen lösen, jetzt in dunklen Schattierungen von grün oder schwarz gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Abbildung 4. 2-D-Merkmalsraum Diagramm von 320 Verbindungen eines FDA-Bibliothek und ihre entsprechenden Kontrollen. Alle Verbindung Vertiefungen in einem 2-D Merkmalsraum Plots basierend auf der Parameter a 0 und a 1, die aus einem nicht-linearen ergeben angezeigt Regression Armatur (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; Gleichung 1 &quot;/&gt;) in Richtung der anfänglichen Entzündung. Diese Funktion Raum Grundstück erlaubt die automatisierte Identifizierung von interessanten Kandidaten, die zu einer der folgenden vier Kategorien immunmodulatorischen achten, die Anzeichen der Medikamente kann &quot;Wirkungsweise:. anti-inflammatorische (1), Anti-Auflösung (2), pro-inflammatorische (3) und pro-Auflösung (4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

<ol><li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li>
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<li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciencenet%27+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li>
<li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvester%27%3A+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<p class="jove_content"&gt; Hier präsentieren wir eine vollautomatische Hochdurchsatz-Screening-Strategie zur Identifizierung von immunmodulatorischen Verbindungen in einem ganzen Tier Kontext. Somit ist eine Überwachung einer akuten Entzündungsreaktion<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und in Echtzeit.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Wir stellen ein Protokoll zur Zebrafisch als ein wertvolles Modell-Organismus für die Wirkstoffforschung oder Drogen Wiederverwendung Bemühungen gelten, da die Droge Auswirkungen auf die Rekrutierung von Leukozyten an Wunden lassen sich relativ einfach im Rahmen einer voll funktionsfähigen angeborenen Immunsystems untersucht werden. Der einzigartige Vorteil unseres Ansatzes ist die Tatsache, dass chemische Verwundung manuelle Manipulation Larven obsolet macht, so dass eine Automatisierung und Screening in einem High-Throughput-Format.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Darüber hinaus können schädliche oder toxische Arzneimittelwirkungen sowie starken Off-Target-Effekte leicht mit der vorgeschlagenen Set-up beurteilt werden. Die FDA genehmigte jedoch Bibliothek enthielt keine toxischen Verbindungen bei den angegebenen Konzentrationen Screening. Trotzdem haben wir für offensichtlich giftige Verbindungen vorzuschlagen, um den verfügbaren Datenbestand (zB immunmodulatorische Phänotyp, Wirkstoffkonzentration) zwischen Mitgliedern der gleichen pharmakologischen Substanzklasse in der Bibliothek getestet vergleichen. Giftig Mitglieder einer Familie Substanz, die sonst übt eine vielversprechende immunmodulatorische Phänotyp, konnte bei niedrigeren Konzentrationen getestet werden, wenn nötig zu sein.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Wir haben die Möglichkeit der Kategorisierung von Drogen automatisch entsprechend ihrer ausgeübten immunmodulatorischen Wirkung unter Beweis gestellt. Arzneimittel aus der Kategorie der entzündungshemmenden Verbindungen können in unabhängigen Versuchen, die meisten der Verbindungen Ausüben ihrer Wirkung in einer Dosis-abhängigen Weise validiert werden können. Vier Verbindungen als mögliche pro-Auflösung Drogen identifiziert werden konnten bisher nicht als solche bestätigt werden. Es zeigt auch, dass diese besondere Kategorie immunmodulatorische schwierig zu beschreiben ist, da keine Medikamente ausschließlich betrifft Auflösung bisher in der Literatur beschrieben. Jedoch zeigten 3 der 4 erneut geprüft Arzneimittel ein entzündungshemmendes Trend bei höheren molaren Konzentrationen. Die Optimierung der empirisch definierte Schwelle Kriterien sollen helfen, die Anzahl der False-Positives zu reduzieren.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Darüber hinaus bietet die präsentierte Technik die Möglichkeit, für die Identifizierung von Mutationen in Genen, die Leukozyten Zugverhalten genutzt werden<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Abschließend kann das vorgeschlagene Verfahren erleichtern und beschleunigen Wirkstoffforschung oder Drogen Wiederverwendung Bemühungen durch Abgabe von potenziellen neuen Leitstrukturen mit leicht verfügbaren Informationen über die Verträglichkeit der Medikamente, Toxizität, Dosierung sowie mögliche Off-Target-Effekte. Daher dient als einfache, kostengünstige und zeitsparende Strategie in frühen Stadien der Medikamentenentwicklung erzielen.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Kupfer (II)-sulfat wasserfreiem </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDA zugelassenen Arzneimittel Bibliothek </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 Mikrotiterplatte Unverbindliche, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> schwarz </td></tr><tr><td> Olympus scan ^ R </td><td> Olymp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Compact Liquid Handling Workstation </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

die erleichterung drug discovery: eine automatisierte high-content-assay entzündung im zebrafisch

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafisch-Larven sind besonders zuträglich ganze Tier kleines Molekül Bildschirmen 1,2 aufgrund ihrer geringen Größe und der relativen Leichtigkeit der Manipulation und Überwachung sowie der Tatsache, dass Verbindungen einfach dem Badewasser hinzugefügt werden und sind leicht absorbiert werden, wenn in einem verabreicht &lt;1% DMSO-Lösung. Durch die optische Klarheit der Zebrafisch-Larven und der Verfügbarkeit von transgenen Linien exprimiert fluoreszierenden Proteinen in Leukozyten bieten Zebrafisch den einzigartigen Vorteil, Überwachen eines akuten Entzündungsreaktion in vivo. Folglich wurde unter Verwendung der Zebrafisch für High-Content-Bildschirme kleines Molekül mit dem Ziel der Identifizierung von immunmodulatorischen Verbindungen mit hohem Durchsatz 3-6 vorgeschlagen worden, was darauf hindeutet Entzündung Induktion Szenarien zB lokalisierte Nicks in fin Gewebe-, Laser-Schäden gerichtet an die Oberfläche des Dotters Embryonen 7 oder Heckflosse Amputation 3,5,6. Der größte Nachteil dieser Methoden war jedochdas Erfordernis einer manuellen Manipulation Larven zu induzieren Verwundung und verhindert so das Hochdurchsatz-Screening. Die Einführung der chemisch induzierte Entzündung (Chin)-Assay 8 beseitigt diese Hemmnisse. Seit Verwundung zugefügt wird chemisch die Zahl der Embryonen, die gleichzeitig behandelt werden können, ist praktisch unbegrenzt. Temporäre Behandlung von Zebrafisch-Larven mit Kupfersulfat selektiv induziert Zelltod in Haarzellen des seitliche Linie System und führt zu einer schnellen Rekrutierung von Granulozyten verletzten Neuromasten. Die entzündliche Reaktion kann in Echtzeit durch Verwendung transgener Verbindung cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 6,9 Zebrafischlarven, die ein grün fluoreszierendes Protein in Neuromasten Zellen, sowie ein rot fluoreszierendes Protein exprimieren Granulozyten Kennzeichnung eingehalten werden. Um ein Screening-Strategie, die sowohl High-Content-und Hochdurchsatz-Analysen erlauben würde, erarbeiten wir eingeführt Liquid-Handling-Roboter-und kombinierter automatisierte MICRoscopy mit einem benutzerdefinierten Skript entwickelte Software. Dieses Skript ermöglicht die automatisierte Quantifizierung der Entzündungsreaktion indem man die Prozent-Bereich von rot fluoreszierenden Leukozyten innerhalb einer empirisch definierten Umgebung verletzten grün fluoreszierenden Neuromasten besetzt. Darüber hinaus haben wir automatisierte Datenverarbeitung, Handhabung, Visualisierung und Speicherung aller auf speziell entwickelte MATLAB-und Python-Skripte basieren. In Kürze stellen wir eine automatisierte HC / HT Bildschirm, der Prüfung von chemischen Verbindungen ermöglicht ihre Wirkung auf Initiation, Progression oder Auflösung eines granulozytäre Entzündungsreaktion. Dieses Protokoll dient einem guten Ausgangspunkt für tiefer gehende Analysen der Droge Mechanismen und Stoffwechselwege in der Orchestrierung von einem angeborenen Immunantwort beteiligt. In Zukunft kann es helfen, zu identifizieren unerträglich giftige oder Off-Target-Effekte bei früheren Phasen der Wirkstoffforschung und reduzieren dadurch prozedurale Risiken und Kosten für die Arzneimittelentwicklung.

Hier beschreiben wir einen neuen High-Content-chemisch induzierte Entzündung Assay mit dem Ziel der Identifizierung von immunmodulatorischen Proteine ​​tätig. Wir haben erfolgreich automatisierte Mikroskopie mit selbst entwickelten Software-Scripte für die automatisierte Quantifizierung der Entzündungsreaktion sowie weitere Datenverarbeitung, Analyse-, Bergbau-und Storage kombiniert.

Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch

Zebrafischlarven eignen sich aufgrund ihrer geringen Größe sowie der relativen Einfachheit der Manipulation und ... besonders gut für Whole-Animal-Screens mit niedermolekularen Substanzen1,2

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen phänotypischen Screen durchzuführen, um immunmodulatorische Wirkungen von Substanzen mittels eines In-vivo-Zebrafisch-Entzündungsassays nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zebrafischlarven in eine 384-Well-Platte verteilt werden; anschließend werden die zu testenden Verbindungen den Larven zugesetzt, um eine Gewebepenetration zu ermöglichen.Dann wird eine Kupfersulfatlösung hinzugefügt, um gewebespezifische Schäden zu verursachen. Schließlich werden die Verbindungen und das Kupfersulfat durch frisches Medium ersetzt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die mittels Analyse von Echtzeit-In-vivo-Mikroskopiedaten den Umfang des gewebespezifischen Leukozyten-Einwanderungs über die Zeit zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die gleichzeitige Induktion einer Entzündung bei Hunderten von Individuen ermöglicht und somit die experimentelle und analytische Automatisierung erlaubt. Den Versuch wird Christina Whitman, eine Doktorandin aus meinem Labor, für den Kinn-Test demonstrieren. Führen Sie Gruppenverpaarungen zwischen homozygot doppelt transgenen und wildtypischen AB-Fischen durch, sammeln Sie die Embryonen durch natürliche Fortpflanzung und ziehen Sie 50 bis 70 Embryonen pro Platte in E3-Medium bei 29 °C bis drei Tage nach der Befruchtung heran.Überprüfen Sie alle Larven unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop auf die Expression des fluoreszierenden Reporters, spontane Entzündungen und eine altersentsprechende Entwicklung. Nachdem das Screening-Medium hergestellt wurde, fügen Sie 20 Mikroliter in die Vertiefungen einer 384-Loch-Platte hinzu und übertragen jeweils eine einzelne anästhesierte Larve in 74 Mikrolitern Medium in jede Vertiefung. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, deren Öffnung mit einer flexiblen Mikropipettenspitze auf einen Durchmesser von zwei Millimetern abgeschnitten wurde.Positionieren Sie die Larve seitlich in der Vertiefung. Führen Sie alle folgenden Flüssigkeitsmanipulationsschritte mit einer automatisierten Flüssigkeits-Handhabungsstation durch, um eine gleichzeitige Behandlung aller Larven mit dem Wirkstoff sicherzustellen. Pipettieren Sie fünfmal auf und ab, um die Verbindungen in der Wirkstoff-Stammlösungsplatte zu mischen. Geben Sie 16 Mikroliter der 7,5-fachen Wirkstoff-Stammlösung in die Screening-Platte und mischen Sie fünfmal mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Sekunde.Bedecken Sie die Screening-Platte mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 29 Grad Celsius, um eine chemische Verletzung zu induzieren. Geben Sie jeweils 10 Mikroliter der 120-Mikromolar-Kupfersulfat-Arbeitslösung hinzu.Die Negativkontrollen viermal waschen und erneut eine Stunde bei 29 Grad Celsius inkubieren. Die Embryonen waschen, indem aus jeder Vertiefung zweimal 80 Mikroliter Medium entfernt und ausgetauscht werden, beginnend nach 90 Minuten. Nach der initialen Kupferbehandlung Bilder mit einem invertierten automatisierten Mikroskop unter Verwendung eines Forex-Objektivs aufnehmen.Stellen Sie die anfängliche Z-Ebene so ein, dass das Neuro-Massenmaterial der rechten und linken hinteren Seitenlinie sichtbar ist, und nehmen Sie jede Vertiefung einmal pro Stunde auf. Verwenden Sie dazu den Helligkeitskanal drei und den GFP-Kanal in vier Fokusebenen. Die benutzerdefinierte LabView-Software erstellt erweiterte Fokusbilder aus vier Fokusebenen für jeden der Kanäle.Die Bilder werden anschließend zusammengeführt, um ein endgültiges RGB-Überlagerungsbild zu erzeugen. Ein Mustererkennungswerkzeug identifiziert Neurome innerhalb der RGB-Überlagerungsbilder und definiert empirisch einen interessierenden Bereich um die Neurome herum. Rötlich fluoreszierende Leukozyten, die die verletzten Neurome umgeben, werden ausgewertet, was zu einer primären Messgröße führt, die den prozentualen Flächenanteil durch Leukozyten oder blass gefärbte Bereiche angibt. Im Durchschnitt werden 95 % der Larven korrekt erkannt und können anschließend einer weiteren Datenverarbeitung unterzogen werden.Der Erfolg einzelner Experimente wird mithilfe von Entzündungskarten oder Augenkarten bewertet. Die Daten werden farblich kodiert, wobei helles Grün einen hohen anfänglichen Entzündungsindex darstellt und Schwarz keine Entzündung anzeigt. Diese schnelle Übersicht ermöglicht die rasche Identifizierung fehlgeschlagener Experimente, die anschließend von der weiteren Datenanalyse ausgeschlossen werden können.iMaps zur Zeit 0,0 und Zeit 0,5 zeigen eindeutig, ob ein Experiment in die weitere Datenverarbeitung einbezogen werden sollte. Kupfer-Kontrollen erscheinen in unterschiedlichen Grüntönen, während DMSO-Kontrollmulden zur Zeit 0,5 dunkelgrün oder schwarz erscheinen. Die Entzündung ist in den Kupfer-Kontrollen nahezu abgeklungen und wird nun in dunklen Grüntönen oder schwarz gekennzeichnet, um die Kontrollen zu verarbeiten.Die 32 Kontrollreplikate werden gemittelt und die Standardabweichung berechnet. Nur Datenpunkte innerhalb von zwei Standardabweichungen werden einbezogen. Der Mittelwert der negativen Kontrolle DMSO wird auf null gesetzt und der höchste mittlere PAOL-Wert der Kupferkontrolle wird auf eins gesetzt; der PAOL-Wert jeder Verbindung wird linear interpoliert oder extrapoliert relativ zu den entsprechenden Kontrollen auf der experimentellen Platte.Die normalisierten Rohdaten aus Wiederholungsexperimenten werden gemittelt, wodurch eine endgültige Messgröße entsteht, der Entzündungsindex aufgrund der Entzündungsauflösung. Im Zeitverlauf wird eine monotone exponentielle, nichtlineare Regressionsanpassung in Richtung der anfänglichen Entzündung durchgeführt. Unter Verwendung dieser Formel, bei der eine Null die Messgröße für die anfängliche Reaktion zum Zeitpunkt null darstellt und eine Eins der Steigung der Amplitude über die Zeit entspricht, um den Merkmalsraum zu erzeugen, wird eine nichtlineare Regression angewandt, und eine Clusteranalyse unterteilt den Merkmalsraum in charakteristische Bereiche, wodurch eine automatisierte Identifizierung interessanter Kandidaten aus verschiedenen immunmodulatorischen Kategorien ermöglicht wird.Alle Parameter werden in der 2D-Darstellung basierend auf den Parametern ACE von null und Ace von eins angezeigt. Die Datenverarbeitungsroutinen erstellen Webseiten, die einen schnellen Überblick über die Ergebnisse sowie eine detaillierte Ansicht gemäß Nutzeranforderung bieten. Weiche Verbindungen zu anderen relevanten heterogenen, biologischen und chemischen Datenbanken sind ebenfalls integriert, um eine wertvolle Ressource für vergleichende und neuartige Studien durch diese Routinen bereitzustellen.Angemessene Datenstandards und Metainformationen wurden für die Langzeitarchivierung dieser Daten in einem Pilotscreen festgelegt; eine Analyse wurde in einer Bibliothek von 640 zugelassenen, bekannten bioaktiven Wirkstoffen der FDA hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Initiation, Progression oder Resolution einer granulozytären entzündlichen Reaktion durchgeführt. Basierend auf den beobachteten Effekten wurden vier Typen immunmodulatorischer Phänotypen klassifiziert, die auf unterschiedliche Wirkmechanismen hinweisen könnten: antiinflammatorisch, anti-resolutiv, proinflammatorisch und pro-resolutiv. 45 von 640 Verbindungen zeigten signifikante antiinflammatorische Effekte, indem sie den initialen Entzündungsindex auf 50 % oder weniger reduzierten.In dieser Kategorie wurden sechs Verbindungen gefunden, die zur pharmakologischen Klasse echter entzündungshemmender Arzneimittel gehören. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die phänotypische In-vivo-Screening-Methode zur Bestimmung immunmodulatorischer Wirkungen von Substanzen weitgehend automatisiert werden kann, was sowohl eine konsistente Datenerfassung als auch Analyse im Kontext eines gesamten Lebewesens ermöglicht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir berichten über die Entwicklung eines Systems zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-transgenen Embryos in Mikrotiterplatten. Dies demonstriert die Fähigkeit, dosisabhängige Wirkung eines kleinen Moleküls, BCI, auf Fibroblast Growth Factor Expression des Reportergens zu messen und Technologie für den Aufbau High-Throughput-Zebrafisch chemische Bildschirme.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

Unser Labor eine neuartige automatisiertes Hochdurchsatz-Bildgebungssystem, die nützlich für die Detektion von verschiedenen Verhaltensweisen in 7 Tage alten Larven Zebrafisch ist. Das System kann zum Erfassen geringfügige Änderungen im Verhalten nach der Larven für Umweltgifte oder Arzneimitteln ausgesetzt wurden verwendet werden.

Automatisierte Hochdurchsatz-Analysen in Behavioral Zebrafischlarven

Dieses Video Artikel beschreibt das Hochdurchsatz-Pipeline, die erfolgreich etabliert hat, zu infizieren und zu analysieren, eine große Zahl von Zebrafisch-Embryonen bietet eine neue Verbindung leistungsfähiges Werkzeug für Test-und Wirkstoffforschung mit einer ganzen Wirbeltierorganismus.

Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion als Modell für Drug Discovery

Der Zebrafisch ist eine hervorragende experimentelle Organismus auf wirbelEntwicklungsProzesse und das Modell menschlichen Krankheit zu studieren. Hier ein Protokoll auf, wie man eine manuelle chemische Bildschirm mit hohem Durchsatz in Zebrafischembryonen mit einer führen beschreiben wir ganze-mount in situ Hybridisierung (WISH) ausgelesen.

Ein Handbuch Kleine Molecule Bildschirm Nähern Hochdurch Mit Zebrafischembryonen

Das Protokoll beschreibt sondenschaft Erwachsenen Zebrafisch mit einem biologischen; dann zerlegen und zytometrie, konfokale Mikroskopie und qPCR Darm vorbereiten. Diese Methode ermöglicht die Verwaltung von bioaktiven Substanzen, intestinale Aufnahme und der lokalen immun Reiz hervorgerufen zu überwachen. Es ist relevant für die Prüfung der intestinalen Dynamik von oralen Prophylaxe.

Orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch: ein Modell für die Bewertung der intestinalen Aufnahme von bioaktiven Substanzen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Transitzeit von eindringmittel beschrifteten Nahrung durch den Darm Larven Zebrafisch auf hohen Durchsatz Weise messen.

Hochdurchsatz-Messung der Darm Transitzeit mit Larven Zebrafisch

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Zebrafish Xenograft-Modelle ermöglichen ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening und eine fluoreszierende Bildgebung menschlicher Krebszellen in einer in vivo Mikroumgebung. Wir haben einen Workflow für großangelegte, automatisierte Arzneimitteluntersuchungen an von Patienten abgeleiteten Leukämieproben in Zebrafischen mit hilfe einer automatisierten Fluoreszenzmikroskop-Bildgebungseinheit entwickelt.

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die automatisierte Implantation von Tumor-Xenotransplantaten in Zebrafischlarven mit Hilfe eines hochmodernen robotergestützten Injektionssystems vor. Darüber hinaus präsentieren wir Injektionsvideos und Validierungsdaten, die die erfolgreiche Leistung des Systems belegen.

Automatisierung der Tumorimplantation in Zebrafischlarven für Krebsforschung und Medizin

Visual Analytics (VA) ist ein neuer Ansatz zur Analyse von Daten interaktiv. In diesem Video sprechen wir die Daten Überlastung Problem durch High-Throughput-biologische Experimente gebracht werden, und schlagen VA als eine Lösung für dieses Problem nicht. Das Video demonstriert Analyse innerhalb und zwischen den immunologischen Datensätze mit einem VA-Tool namens Tableau.

Erleichterung der Analyse der immunologischen Daten mit Visual analytischen Techniken

Lernen Sie eine automatisierte High-Content-Assay zur Untersuchung von Entzündungen in Zebrafischlarven. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung immunmodulatorischer Bioaktiva durch Echtzeitbildgebung.

Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch

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