Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein phänotypisches Screening durchzuführen, um die immunmodulatorische Aktivität von Verbindungen mit Hilfe eines in vivo Zebrafisch-Entzündungsassays zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die Zebrafischlarve an einen 384 verteilt wird. Die nächstgelegenen Verbindungen, die gesiebt werden sollen, werden den Larven zugesetzt, um das Eindringen in das Gewebe zu ermöglichen.

Dann wird Kupfersulfatlösung hinzugefügt, um gewebespezifische Schäden zuzufügen. Schließlich werden die Verbindungen und Kupfersulfat durch frisches Medium ersetzt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das Ausmaß des gewebespezifischen Leukozyteneinstroms im Laufe der Zeit durch die Analyse von Echtzeit-In-vivo-Mikroskopiedaten zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Induktion von Entzündungen bei Hunderten von Personen ermöglicht und damit eine experimentelle und analytische Automatisierung ermöglicht. Das Verfahren wird von Christina Whitman, einer Doktorandin aus meinem Labor für den Kinn-Assay, demonstriert. Richten Sie Gruppenpaarungen zwischen homozygoten, doppelt transgenen und Wildtyp-AB-Fischen ein, sammeln Sie Embryonen durch natürliches Laichen und ziehen Sie 50 bis 70 pro Platte in E drei Medium bei 29 Grad Celsius bis drei Tage nach der Befruchtung auf.

Überprüfen Sie alle Larven unter einem fluoreszierenden Stereoskop auf die Expression von fluoreszierenden Reportern, spontane Entzündungen und eine angemessene altersbedingte Entwicklung. Nach der Vorbereitung des Screening-Mediums und der Zugabe von 20 Mikrolitern zu den Vertiefungen einer 384-Vertiefungsplatte wird eine einzelne anästhesierte Larve in 74 Mikrolitern Medium in jede Vertiefung übertragen. Verwendung einer Pipettenspitze, die auf eine Bohrungsgröße von zwei Millimetern zugeschnitten wurde, mit einer flexiblen Mikropipettenspitze.

Richten Sie die Larve in einer seitlichen Position innerhalb der Vertiefung aus. Führen Sie alle folgenden Liquid-Handling-Schritte mit einem Roboter-Liquid-Handling-Arbeitsplatz durch, um die gleichzeitige Behandlung aller Larven für die medikamentöse Behandlung sicherzustellen. Pipettieren Sie fünfmal auf und ab, um die Verbindungen in einer Medikamentenvorratsplatte zu mischen. Geben Sie 16 Mikroliter der 7,5 x Wirkstoffvorratsplatte in die Screening-Platte und mischen Sie fünfmal mit 10 Mikrolitern pro Sekunde.

Decken Sie die Siebplatte mit Alufolie ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 29 Grad Celsius. Um chemische Wunden herbeizuführen. Fügen Sie jeweils 10 Mikroliter 120 mikromolare Kupfersulfat-Arbeitslösung hinzu.

Akzeptieren Sie die Negativkontrollen, mischen Sie viermal und inkubieren Sie erneut eine Stunde lang bei 29 Grad Celsius. Waschen Sie die Embryonen, indem Sie zweimal 80 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung entfernen und austauschen, beginnend mit 90 Minuten. Nehmen Sie nach der ersten Kupferbehandlung Bilder an einem inversen automatisierten Mikroskop mit einem Forex-Objektiv auf.

Stellen Sie den anfänglichen Z-Wert so ein, dass die Neuromasse von der rechten und linken hinteren Seitenlinie sichtbar ist und einmal pro Stunde jeweils gut abgebildet wird. Unter Verwendung der Hellfeldseite mit drei und GFP-Kanälen in vier Fokusebenen. Die benutzerdefinierte Laboransichtssoftware erstellt Bilder mit erweitertem Fokus aus vier Fokusebenen für jeden der Kanäle.

Die Bilder werden dann zusammengeführt, um ein endgültiges RGB-Overlay-Bild zu erstellen. Ein Mustererkennungstool identifiziert Neurome innerhalb der RGB-Overlay-Bilder und erstellt einen empirisch definierten Interessenbereich um die rot fluoreszierenden Leukozyten der Neurome, die die verletzten Neurome umgeben, werden bewertet, was zu einer primären Anzeige der prozentualen Fläche führt, die von Leukozyten oder blass besetzt ist. Im Durchschnitt werden 95 % der Larven richtig erkannt und können anschließend einer weiteren Datenverarbeitung unterzogen werden.

Der Erfolg einzelner Experimente wird anhand von Entzündungskarten oder Augenkarten bewertet. Die hellen Daten sind farblich kodiert, wobei Hellgrün für einen hohen anfänglichen Entzündungsindex steht, und Schwarz zeigt an, dass keine Entzündung vorhanden ist. Dieser schnelle Überblick ermöglicht die schnelle Identifizierung fehlgeschlagener Experimente, die dann von der weiteren Datenanalyse ausgeschlossen werden können.

iMaps zum Zeitpunkt 0,0 und zum Zeitpunkt 0,5 zeigen deutlich, ob ein Experiment in die weitere Datenverarbeitung einbezogen werden soll. Kupfer-Regler werden in unterschiedlichen Grüntönen angezeigt, während DMSO-Kontroll-Wells zum Zeitpunkt 0,5 in Dunkelgrün oder Schwarz erscheinen. Die Entzündung ist bei Kupferkontrollen fast verschwunden, die jetzt in dunklen Grün- oder Schwarztönen angezeigt werden, um die Kontrollen zu verarbeiten.

Die 32 Kontrollreplikate werden gemittelt und die Standardabweichung berechnet. Nur. Datenpunkte innerhalb von zwei Standardabweichungen sind enthalten. Der Durchschnittswert des Negativkontroll-DMSO wird auf Null gesetzt, und der höchste durchschnittliche PAOL für die Kupferkontrolle wird auf eins gesetzt. Der PAOL jeder Verbindung wird linear, interpoliert oder auf die entsprechenden Regler auf der Experimentierplatte extrapoliert.

Die normalisierten Rohdaten aus Replikationsexperimenten werden gemittelt, um eine endgültige Ablesung zu erhalten, den Entzündungsindex aufgrund der Entzündungsauflösung. Im Laufe der Zeit wird eine monotone exponentielle nichtlineare Regressionsanpassung in Richtung der anfänglichen Entzündung durchgeführt. Durch die Verwendung dieser Formel, bei der eine Null das Maß für die anfängliche Reaktion zum Zeitpunkt gleich Null ist und eine Eins mit der Steigung der Größe über die Zeit in Beziehung gesetzt wird, um den Merkmalsraum zu erzeugen, wird eine nichtlineare Regression angewendet und eine Clusteranalyse unterteilt einen Merkmalsraum in charakteristische Regionen, wodurch eine automatisierte Identifizierung interessanter Kandidaten aus verschiedenen immunmodulatorischen Kategorien ermöglicht wird.

Alle Parameter werden im 2D-Diagramm basierend auf den Parametern ACE von Null und Ass von eins angezeigt. Die Datenverarbeitungsroutinen erstellen Webseiten, die einen schnellen Überblick über die Ergebnisse sowie eine Detailansicht bieten und vom Benutzer angefordert werden. Softlinks zu anderen relevanten heterogenen, biologischen und chemischen Datenbanken sind ebenfalls integriert, um eine wertvolle Ressource für vergleichende und neuartige Studien mit diesen Routinen bereitzustellen.

Für die Langzeitspeicherung dieser Daten werden geeignete Datenstandards und Metainformationen in einem Pilotbildschirm festgelegt, eine Analyse wurde in einer Bibliothek von 640 von der FDA zugelassenen bekannten bioaktiven Verbindungen durchgeführt, um die Wirkung auf die Initiierung, das Fortschreiten oder die Auflösung einer granulozytären Entzündungsreaktion zu untersuchen. Basierend auf den beobachteten Effekten wurden vier Arten von immunmodulatorischen Phänotypen klassifiziert, die auf unterschiedliche Wirkmechanismen hinweisen können: entzündungshemmend, anti-auflösend, pro-inflammatorisch und pro-auflösend. 45 von 640 Verbindungen übten signifikante entzündungshemmende Wirkungen aus, indem sie den anfänglichen Entzündungsindex auf 50 % oder weniger reduzierten.

Innerhalb dieser Kategorie wurden sechs Verbindungen gefunden, die zur pharmakologischen Klasse der bonafide entzündungshemmenden Arzneimittel gehörten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie phänotypisches In-vivo-Screening auf immunmodulatorische Wirkstoffaktivität weitgehend automatisiert werden kann, was sowohl eine konsistente Datenerfassung als auch eine konsistente Analyse in einem gesamten Tierkontext ermöglicht.