Reinigung und Aggregation des Amyloid Precursor Protein intrazelluläre Domäne

Ziel dieses Verfahrens ist es, das Amyloid-Vorläuferprotein intrazelluläre Domäne, auch bekannt als A-ICD, aufzureinigen und ein Protokoll zur thermischen Aggregation und Charakterisierung des A-ICD mittels Rasterkraftmikroskopie vorzulegen. Dies wird erreicht, indem zunächst die A-GST-Fusion von A-ICD in Bakterien exprimiert wird. Als nächstes wird das G-S-T-A-I-C-D-Protein gereinigt, mit Thrombin gespalten, um die GST von der A-ICD zu trennen, und die GST wird entfernt.

Dann wird die thermische Aggregation von A ICD induziert. Abschließend werden die A-ICD-Aggregate mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass der A-ICD in einer für die biochemische und biophysikalische Analyse ausreichenden Menge bis zur Homogenität gereinigt werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, die komplexe Chromatographieschritte erfordern, besteht darin, dass sie hochrein und löslich ist. Ein ICD kann auf dem Labortisch mit Standardreagenzien und -geräten isoliert werden. Ein mit diesem Protokoll erstellter ICD eignet sich für die weitere biochemische und biophysikalische Charakterisierung.

Das Verfahren wird von Amina ti vorgeführt. Ein ehemaliger Postdoc meines Labors, Dr. Andres Oberer, wird demonstrieren, wie man die Rasterkraftmikroskopie von A ICD durchführt, um die rekombinante A PP intrazelluläre Domäne oder A ICD zu exprimieren. Beginnen Sie mit BL 21-Zellen, die mit dem pgx 41-Vektor transformiert wurden und den menschlichen A-ICD beherbergen, der mit einer einzigen Kolonie mit dem C-Terminus von GST fusioniert ist, impfen Sie 10 Milliliter LB-Bouillon mit Ampicillin und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius unter kräftigem Schütteln am nächsten Morgen.

Inkubieren Sie 400 Milliliter LB-Ampicillin in einem Ein-Liter-Kolben mit fünf Millilitern der Nachtkultur. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter kräftigem Schütteln, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,4 bis 0,6 erreicht hat. Dies dauert normalerweise zwei bis 2,5 Stunden, um die Expression von G-S-T-A-I-C-D zu induzieren.

Wir fügen 0,4 Millimolar IPTG hinzu und inkubieren es fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter kräftigem Schütteln. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 Mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und lagern Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Vorbereitung der Lyse, des Puffers und des Werfens von Bakterien auf Eis fügen Sie dem Pellet 20 Milliliter Puffer hinzu und verwenden Sie eine Kombination aus Vortexen und Tation auf Eis mit einer Pipette gründlich.

Reese suspendiert das Bakterienpellet und leitet das resuspendierte Bakterienlysat durch einen vorgekühlten Emulgator oder eine französische Presse. Bei 30.000 PSI wird das Lysat ein zweites Mal durch den Emulgator geleitet und das Lysat in einem vorgekühlten 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Zentrifugieren Sie das Lysat von 15.000 Mal G und vier Grad Celsius für 30 Minuten.

Trennen Sie das Supinat und geben Sie es in ein vorgekühltes 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 500 Mikroliter einer 50%igen Aufschlämmung von Glutathion hinzu. 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius drehen, während sich die Probe dreht.

Stellen Sie nach der Inkubation frischen Elutionspuffer her. Gießen Sie das Lysat und die Aufschlämmung in eine Einweg-Fünf-Zoll-Polystyrol-Chromatographiesäule mit Kursfiltern. Waschen Sie die Säule fünfmal mit drei Millilitern PBS.

Verschließen Sie den Boden der Säule und fügen Sie 500 Mikroliter Elutionspuffer bei Raumtemperatur hinzu. Verschließen Sie die Oberseite der Säule und drehen Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Sammeln Sie das Frühgewicht in einem gekühlten 1,5-Milliliter-Mikroabfallröhrchen.

Wiederholen Sie die Elution noch zwei weitere Male. Dialysieren Sie das Eluat in einer Dialysemembran mit einem Cutoff-Verhältnis von 10.000 Molekularen in vier Litern PBS über Nacht bei vier Grad Celsius am folgenden Tag. Dialysieren Sie eine Stunde lang gegen weitere vier Liter PBS bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie das Protein aus der Dialysekassette und führen Sie einen Proteinquantifizierungsassay durch, um die Ausbeute an G-S-T-A-I-C-D zu bestimmen. Eine typische Reinigung aus 400 Millilitern Kultur führt zu Ausbeuten von mehr als 20 Milligramm gereinigtem Protein bei Konzentrationen von 10 bis 20 Milligramm pro Milliliter. Aliquotieren Sie das Protein in 200 Mikroliter, aliquot und frieren Sie es bei minus 80 Grad Celsius ein.

Um den A-ICD vom GST-Auftauen zu befreien, inkubieren 200 Mikroliter gereinigtes G-S-T-A-I-C-D und die Zugabe von 20 Mikrofreisetzungen von einer Einheit pro Mikroliter Thrombin am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius, reinigen Sie das aggregierte Material durch Zentrifugation bei 20.000 mal G für 30 Minuten von vier Grad Celsius. Füllen Sie das SUPINAT in ein vorgekühltes Mikroröhrchen, um GST und Thrombin zu entfernen. Fügen Sie 50 Mikroliter 50%ige Glutathion-Aro-Aufschlämmung bzw. 50 Mikroliter, 50%p und Wino Zaine Aro-Gülle hinzu.

Inkubieren Sie mit Rotation für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Kurz zentrifugieren, um die Agrokügelchen zu sedimentieren und das Supinat in ein frisches Röhrchen zu entfernen. Extrahieren Sie die GST noch viermal mit Glutathion.

Aros führt einen Proteinquantifizierungsassay an fünf Mikrolitern des gereinigten A-ICD durch. Typische Ausbeuten aus einer 400-Milliliter-Kultur liegen bei 50 bis 100 Mikrogramm bei einer Konzentration von 0,2 bis 0,5 Milligramm pro Milliliter. Nach dem Verdünnen des frisch zubereiteten A ICD in PBS auf eine Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter induzierte die thermische Aggregation, indem die Proben 48 Stunden lang bei 43 Grad Celsius bei 800 U/min in einem beheizten Schüttler inkubiert wurden.

Verdünnen Sie die Probe 20-fach mit deionisiertem Wasser und tupfen Sie zwei Mikroliter auf frisch gespaltenes Wasser. Glimmer trocknet die Probe über Nacht in einem Trockenmittel, um die aggregierten A ICD-Rasterkraftmikroskopie im Klopfmodus mit Goldgoat zu visualisieren. Mikro-Sharpp-Nitrid-Ausleger mit einem nominalen Spitzenradius von zwei Nanometern.

Typische Abklopfamplituden während der Bildgebung, 10 bis 20 Nanometer bei der Resonanzfrequenz der Ausleger. Die Ausprägung und relative Anreicherung von G-S-T-A-I-C-D ist hier dargestellt. Nach der Lyse liegt der Großteil des Fusionsproteins in der löslichen Fraktion vor, so dass eine Extraktion aus Einschlusskörpern nicht erforderlich ist.

Das Material, auf das aus der Glutathion-Säule angespielt wird, ist zu mehr als 95% rein. In der hier gezeigten Zubereitung betrug die Konzentration des aus der Säule angedeuteten Proteins 14,5 Milligramm pro Milliliter und die Ausbeute 22 Milligramm. Die Spaltung von 200 Mikrolitern dieses Präparats über Nacht mit 20 Einheiten Thrombin führte zu einer fast 100%igen Spaltung des Fusionsproteins.

Die Menge an verwendetem Thrombin ist gering genug, um von Kumasi nicht nachgewiesen zu werden. Bläuliche Flecken, die Entfernung des Thrombins und der GST führten zu einem gewissen Materialverlust. Es war jedoch mehr als 90 % rein mit einer Ausbeute von 70 Mikrogramm A ICD bei einer Konzentration von 0,35 Milligramm pro Milliliter.

Ein ICD-Aggregat, das von einem FM abgebildet wird, sind typischerweise steroidamorph und haben eine Größe von 50 bis 100 Nanometern. Aggregiertes Material ist nicht nachweisbar, wenn eine äquimolare Menge des Chaperons UBI Quillin one zur Aggregationsreaktion hinzugefügt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man EICD aufreinigt, um seine Aggregation zu induzieren, und den Bildaggregatschacht A-F-M-E-I-C-D.

Die mit dieser Technik gereinigten Methoden können auf andere Methoden wie Lichtstreuung und Filterfallen-Assays angewendet werden, um Fragen zur Wirkung molekularer Chaperone auf die EACD-Aggregation zu beantworten.