Name: Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Kardiomyozyten-Kernen aus postmortalem Gewebe durch Homogenisierung, Dichtesedimentation und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung. Diese Methode ermöglicht hochreine Kerne für genetische Analysen.

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Wir möchten Marcelo Toro für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie anerkennen. Diese Studie wurde vom schwedischen Herz-und Lungen-Stiftung, EU-Kommission RP7 &quot;CardioCell&quot;, Schwedischer Forschungsrat, AFA Versicherungen und ALF unterstützt. OB wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt.

1. Die Isolierung des Herz-Kerne <ol><li> Mantel Ultrazentrifuge Rohre (Beckman Zentrifugenröhrchen # 363.664) mit 10 ml 1% BSA / PBS Beschichtungslösung. Verschließen Sie die Röhrchen und lassen Sie sie für 30 min in einem Rohr Rotator drehen. Entfernen Sie die Beschichtungslösung und lassen Sie die Zentrifugenröhrchen Luft trocknen lassen (eine Tube pro Maus Herz für die Analyse der einzelnen Mäuseherzen, abwechselnd bis zu 5 Mäuseherzen oder 1 g Herzgewebe von einer anderen Spezies erforderlich ist (z. B. Mensch) können verarbeitet werden In einem Röhrchen). </li><li> Alle folgenden Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden. Präparieren Sie die linke Herzkammer aus frischen oder gefrorenen Snap-Maus-Herz mit einem Skalpell. Man beachte, daß dieses Protokoll für Mäuseherz optimiert, sondern auch von Ratten oder menschlichen Herzens angepasst werden. Alternativ können bis zu 1 g des Herzgewebes von einer anderen Spezies. </li><li> Schneiden Sie die Probe in kleinen Kabinen mit einem Skalpell. </li><li> Übertragen der Gewebestücke in einen 50 ml-Falcon-Röhrchen mit 15 ml Lyse-Puffer gefüllt. </li><li> Homogenisieren derHerzgewebe mit einem T-25 Ultra-Turrax-Homogenisator Sonde (IKA) bei 24.000 UpM für 10 sek. </li><li> Verdünnen des Homogenats mit einem gleichen Volumen Lysepuffer bis 30 ml. </li><li> Verwenden Sie ein Glas Douncer (40 ml) zur weiteren Homogenisierung des Gewebes und die Kerne frei. Führen Sie acht Schläge mit einem großen Abstand Pistill. </li><li> Führen Sie das rohe Kerne durch ein 100 um und 70 um Nylon-Mesh Zellsieb (BD Biosciences), fortlaufend zu isolieren. </li><li> Anzentrifugieren das rohe Kerne in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C) bei 700 × g für 10 min isoliert. </li><li> Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Umdrehen der Rohre und wischen Sie das Innere des Rohres mit einem Papiertuch. Achten Sie darauf, die Kerne Pellet stören. </li><li> Man löst das rohe Kerne in 5 ml Saccharose-Puffer zu isolieren durch Pipettieren der Lösung mehrmals auf und ab. Fügen Sie eine weitere 25 ml Saccharose-Puffer auf die gelöste Pellet. </li><li> 10 ml frisch zubereiteten Saccharose-Puffer auf die beschichtete Ultrazentrifuge Rohr (siehe Schritt 1.1). &lt;/ Li&gt; <li> Sorgfältig überlagern den zusätzlichen 10 ml Saccharose-Puffer mit dem resuspendierten Pellet Kerne in Saccharose-Puffer von 1,9 Schritt aufgelöst. </li><li> Gleichen Sie die Zentrifugenröhrchen, bevor Sie sie in eine JS13.1 frei schwingenden Rotor und platzieren Sie den Rotor in eine High-Speed-Zentrifuge (Beckman Avanti S-25). </li><li> Drehen der Kerne Probe bei 13.000 × g bei 4 ° C für 60 min. </li><li> Wenn die Spin abgeschlossen ist, entfernen die Röhrchen vorsichtig von dem Rotor und der Überstand verworfen durch Invertieren der Rohre und Abwischen der restlichen Ablagerungen aus dem Inneren der Rohre mit einem Papiertuch. </li><li> Lösen Sie die Kerne Pellet in 1 ml Kerne Pufferspeicher (NSB Plus-Puffer). Hinweis: NSB plus enthält 1,5 mM Spermin als DNA-Stabilisator. </li><li> Fahren Sie mit Schritt 2.1, Immunfärbung von Kardiomyozyten Kernen. </li></ol> 2. Immunfärbung für die Durchflusszytometrie <ol><li> Die negativen Kontrollen für Immunfärbung. Man entnimmt einen aliquoten von 20 ul aus den Kernen Probe und eineDD 980 ul von NSB und Puffer. </li><li> In Anti-pericentriolar Material 1-Antikörper (Kaninchen-Anti-PCM-1, Atlas Antikörper) zu den Kernen Probe in einer Verdünnung von 1:500 bis Immunmarkierung Kardiomyozyten Kernen. In den Isotyp-Antikörper in der gleichen Verdünnung des Anti-PCM-1-Antikörper mit der Negativkontrolle, in Schritt 2.1 hergestellt. </li><li> Inkubieren negativen Kontrolle und Probe-Röhrchen bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Waschen Sie Negativ-Kontrolle und Probe mindestens einmal mit NSB Plus-Puffer (Spin-Down Rohre in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C) bei 700 xg für 10 min. Überstand verwerfen und lösen sich die Kerne Pellet in 1 ml NSB Plus-Puffer). </li><li> In Anti-Kaninchen-fluoreszierenden sekundären Antikörper (FITC oder APC) zu negativen Kontrolle und Probenröhrchen in einer Verdünnung von 1:1000. </li><li> Inkubieren negativen Kontrolle und Probe-Röhrchen bei 4 ° C für 1 h. </li><li> Waschen Sie Negativ-Kontrolle und Probe mindestens einmal mit NSB Plus-Puffer (Spin-Down Rohre in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C) bei 700 xg für 10 min. Überstand verwerfen und lösen sich die Kerne Pellet in 1 ml NSB Plus-Puffer). </li><li> Fahren Sie mit der durchflusszytometrischen Analyse und Sortierung. </li></ol> 3. Durchflusszytometrie <ol><li> Coat Kerne Sammlung Röhrchen (Falcon 15 ml) mit 1% BSA / PBS-Lösung, bevor Sie die Durchflusszytometrie Sortierung wie in Schritt 1.1 beschrieben starten. </li><li> Filtern Sie die Probe und die negative Kontrolle durch einen 30 um Zellsieb und laden Sie zuerst die negative Kontrolle der Durchflusszytometer (BD Zufluss). Definieren Sie die erste und zweite Tor zu Kernen und Singuletts (Einzel-Kerne) zu definieren, basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC), Vorwärtsstreuung Impulsbreite (FS Pulsbreite) und seitliche Streulicht (SSC) (Abb. 2a und b). Hinzufügen eines DNA-Färbung (DRAQ5 (1:500)) zu der Probe kann helfen, die Kerne Bevölkerung zunächst zu identifizieren. </li><li> Laden der Probe und immunmarkierten definieren das dritte Tor zu Kardiomyozyten Kerne (PCM-1-positve) aus nicht-Kardiomyozyten Kerne (PCM-1-negativen) zu isolieren. Starten Sie die Sortierung(Abb. 2c und d). </li></ol> Optional: Um die Kern-DNA-Gehalt (Ploidie) zu analysieren und Zellzyklus-Analyse durchzuführen fügen Sie eine entsprechende DNA-Färbung der Kerne (zB Hoechst 33342 oder DRAQ5) (Abb. 2e). <ol start="4"><li> Nach der Durchflusszytometrie Sortierung, legen Sie die Kerne auf Eis und neu analysieren, um die Sortierung Reinheit (Abb. 3a und b) zu bestimmen. </li><li> Drehen Sie den sortierten Kerne in den Sammelröhrchen bei 1500 xg in einer Kühlzentrifuge für 15 min. </li><li> Man löst die Kerne Pellets in einer Pufferlösung mit dem Downstream-Anwendungen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Kerne Morphologie und Integrität durch DNA Flecken beurteilt werden und visualisiert durch Mikroskopie (Abb. 1). Erfolgreiche PCM-1 Kennzeichnung kann durch Epifluoreszenzmikroskopie und mittels Durchflusszytometrie (Abb. 1 und Abb. 2c und d) beurteilt werden. PCM-1-Positive und negative Populationen sollten gut voneinander getrennt werden (Abb. 2c und d). In murinen linken Ventrikel ungefähr 30% aller Kerne Kerne sein sollte Kardiomyozyten (2d). Sortieren Reinheit kann durch neue Analyse der sortierten Kerne (Abb. 3a und b) beurteilt werden. Beide Kerne Bevölkerung sollte eine Sortierung Reinheitsgrad von mehr als 95%. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> Abbildung 1. PCM-1 identifiziert Kardiomyozyten Kerne. Cardiac Kerne (a) mit Antikörpern gegen PCM-1 (b) und Nkx2.5 (c) in einer erwachsenen Maus Herzen gefärbt werden. (D) PCM-1-markierte Kerne werden von Kardiomyozyten Zytoplasma (Myosin heavy chain (MHC)) umgeben ist und zum Ausdruck des Transkriptionsfaktors Nkx2.5 und dokumentiert die genaue Identifizierung von Kardiomyozyten Kerne von PCM-1-Färbung (Maßstab 20 pm und 10 um (d, Einschub)). (E) Cardiac Kerne Isolate visualisiert mit dem DNA-Farbstoff DRAQ5. (F und g) CardiomyocYTE Kerne sind mit Antikörpern gegen PCM-1 (Maßstab 10 um) beschriftet. Beachte, dass die epinuclear Färbungsmuster von PCM-1 in Myozyten Kerne im Gewebe aufweist und in isolierten Kernen (Pfeile). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> Abbildung 2. Durchflusszytometrische Sortierung von Kardiomyozyten Kernen. (A) Cardiac Kerne werden durch Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC) identifiziert. (B) ein zweites Tor identifiziert einzelne Kerne von FSC und FS Impulsbreite 5. (C, d) Fluoreszenz-Gating ermöglicht die Trennung von Kardiomyozyten Kerne (PCM-1-positiv) und nicht-Kardiomyozyten (PCM-1-negativen) Kerne von Herzgewebe. (E) Maus Kardiomyozyten meist (&gt; 80%) diploid (2n), ist nur eine kleine Teilmenge tetraploiden (4n) 6. Hinweis enthalten menschlichen Kardiomyozyten eine höhere Frequenz von Polyploidie Kerne (&gt; 2n) 7,8. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 3. Reinheit Analyse der sortierten Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten Kerne. Re-Analyse der sortierten Nicht-Kardiomyozyten (a) und Kardiomyozyten Kerne (b). Beide Populationen zeigen eine Sortierung Reinheitsgrad von mehr als 99%.

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<li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914(2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Genaue Identifizierung der Kardiomyozyten Kerne ist entscheidend für die Analyse der regenerativen Vorgänge im Myokard 2,3. Herkömmliche Techniken zu Kardiomyozyten aus frischem Gewebe zu isolieren sind hauptsächlich auf enzymatischen Abbau von Proteinen der extrazellulären Matrix und die anschließende Reinigung in der interstitiellen Zellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit basiert. Die weitere Reinigung des lebenden Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen (ESC) Immunmarkierung mit Oberfl...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Lysispuffer </td></tr><tr><td> Name des Reagenzes </td></tr><tr><td> 0,32 M Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 mM Magnesiumacetat </td></tr><tr><td> 2,0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0,5 mM EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 2. Saccharose-Puffer </td></tr><tr><td> Name des Reagenzes </td></tr><tr><td> 2,1 M Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM Magnesiumacetat </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 3. Kerne Speicherpuffer (NSB plus) </td></tr><tr&gt; <td> Name des Reagenzes </td></tr><tr><td> 0,44 M Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCl </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1,5 mM Spermin </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Chemikalien und Geräte </td><td> Firma </td></tr><tr><td> Kaninchen-IgG-Isotyp-ChIP Grade, # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> Kaninchen anti-PCM-1-Antikörper, # HPA023374 </td><td> Atlas Antibodies </td></tr><tr><td> Donkey sek. Antikörper, Anti-Kaninchen Alexa 488 Fluor, # A-21.206 oder gleichwertige sek. Fluoreszenz-Antikörper </td><td> Life Technologies </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> Zelle Siebe 30 um, 70 um und 100 um </td><td> BD Biosciences </td></tr><tr><td> Glass Douncer (40 ml) undPistill &quot;L&quot; </td><td> VWR (Wheaton Industries Inc.) </td></tr><tr><td> T-25 Ultra-Turrax-Homogenisator </td><td> IKA Deutschland </td></tr><tr><td> Dispergierwerkzeug S25 N-18 G </td><td> IKA Deutschland </td></tr><tr><td> Beckman Avanti Zentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Falcon-Tubes 15 ml und 50 ml </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman Zentrifugenröhrchen # 363664 </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> JS13.1 frei schwingenden Rotor </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Influx Zytometer </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Tube Rotator </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

isolierung von kardiomyozyten kerne von post-mortem gewebe

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identifizierung von Kardiomyozyten Kerne hat in Gewebeschnitten Herausforderung gewesen, da die meisten Strategien nur auf zytoplasmatische Markerproteine ​​1 verlassen. Seltene Ereignisse in Herzmuskelzellen wie Proliferation und Apoptose erfordern eine genaue Identifizierung von Kardiomyozyten-Kerne auf die Zellerneuerung in der Homöostase und bei pathologischen Zuständen 2 zu analysieren. Hier stellen wir eine Methode, um Kardiomyozyten Kerne aus post mortem Gewebe zu isolieren durch Sedimentation und Dichte Immunomarkierung mit Antikörpern gegen pericentriolar Material 1 (PCM-1) und anschließende Durchflusszytometrie-Sortierung. Diese Strategie ermöglicht einen hohen Durchsatz-Analyse und Isolation mit dem Vorteil bei der Arbeit ebenso gut auf frischen und gefrorenen Gewebe Archivalien. Dies macht es möglich, das Material bereits in Biobanken gesammelten studieren. Diese Technik ist und die Messung in einer Vielzahl von Arten und mehrfach Downstream-Anwendungen, wie Kohlenstoff-14-3, Zell-cycle-Analyse 4, Visualisierung von Thymidin-Analoga (zB BrdU und IdU) 4, Transkriptom-und epigenetische Analyse.

Cardiac Kerne über Dichte Sedimentation isoliert und mit Antikörpern gegen immunmarkiert pericentriolar Material 1 (PCM-1) zu identifizieren und zu sortieren Kardiomyozyten Kerne durch Durchflusszytometrie.

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Die Identifizierung von Kardiomyozytenkernen in Gewebeschnitten gestaltete sich bislang als schwierig, da die meisten Strategien ausschließlich auf zytoplasmatischen Markerproteinen basieren1. Seltene Ereignisse ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Kerne von Kardiomyozyten aus postmortalen Geweben zu isolieren. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst mit einem Stabhomogenisator und einem Glasstößel homogenisiert und anschließend mehrfach filtriert wird. Der zweite Schritt besteht darin, den nukleären Anteil durch Dichtegradientenzentrifugation von den anderen zellulären Fraktionen zu trennen. Anschließend werden die Kerne der Kardiomyozyten mit einem gegen PCM1 gerichteten Antikörper immunmarkiert. Der letzte Schritt besteht darin, die markierten Kerne der Kardiomyozyten mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren. Unmittelbar vor weiteren downstream-Manipulationen wird schließlich die Reinheit der Kardiomyozytenkerne durch erneute Analyse der sortierten nukleären Fraktionen bestätigt.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Kerne von Kardiomyozyten aus frischem oder eingefrorenem Archivgewebe hochdurchsatzfähig gleich gut analysiert werden können. DNA-basierte Untersuchungen an Kardiomyozyten sind aus mehreren Gründen besonders anspruchsvoll. Erstens machen Kardiomyozyten im Herzen nur etwa 20–30 % der Zellen aus.Außerdem sind sie in erheblichem Maße nukleiert. Darüber hinaus sind Kardiomyozyten in erheblichem Maße polyploid. Diese hier beschriebene Methode überwindet all diese Hürden.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, beschichten Sie Ultrazentrifugenröhrchen mit 10 Milliliter einer 1 %igen BSA-haltigen PBS-Beschichtungslösung. Nach einer 30-minütigen Rotationsphase entfernen Sie die Beschichtungslösung und lassen die Röhrchen lufttrocknen.Beginnen Sie das Verfahren zur Isolierung von Herzkernen damit, mit einem Skalpell den linken Ventrikel aus einem schockgefrorenen Mäuseherzen zu dissezieren. Schneiden Sie das präparierte Gewebe in kleine Segmente und überführen Sie die Gewebestücke anschließend in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das mit 15 Millilitern Lysepuffer gefüllt ist. Homogenisieren Sie das Herzgewebe danach mit einem Stabhomogenisator bei 24.000 U/min für 10 Sekunden und verdünnen Sie das Homogenat mit einem gleichen Volumen Lysepuffer auf insgesamt 30 Milliliter. Überführen Sie das Homogenat in einen Glas-Down-Homogenisator und führen Sie acht Hubbewegungen mit einem Stößel mit großem Spaltmaß durch, um die Kerne freizusetzen.Dann filtrieren Sie die rohen Zellkerne zuerst durch einen Zellfilter mit 100 Mikrometer, anschließend durch einen Zellfilter mit 70 Mikrometer in ein frisches kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie nun das isolierte rohe Zellkernpräparat 10 Minuten bei 700 ×g und 4 °C.Drehen Sie das Röhrchen um, um das Überstand vorsichtig zu entfernen, und wischen Sie die Innenseite des Röhrchens mit einem Papiertuch ab, wobei Sie darauf achten, das Nuclei-Pellet nicht aufzuwirbeln. Pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, um die rohen Kerne erneut in Suspension zu bringen.Isolieren Sie in fünf Millilitern Saccharose-Puffer und geben Sie anschließend weitere 25 Milliliter Saccharose-Puffer zur Kernsuspension hinzu. Fügen Sie danach 10 Milliliter frisch zubereiteten Saccharose-Puffer in eines der zuvor vorbereiteten beschichteten Ultrazentrifugenröhrchen hinzu. Überlagern Sie den Puffer dann vorsichtig mit der resuspendierten Kernpräzipitatlösung.Nach dem Ausgleichen der Röhrchen in einem frei schwingenden Rotor wird der Rotor in eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge eingesetzt und die Kernprobe 60 Minuten bei 13.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Sobald die Zentrifugation beendet ist, die Röhrchen vorsichtig aus dem Rotor nehmen und erneut invertieren. Um den Überstand zu entfernen, den verbleibenden Rückstand an der Innenwand des Röhrchens wie zuvor mit einem Papierhandtuch abwischen und dann das Kernpellet in einem Milliliter Kernspeicherpuffer resuspendieren.Bevor Sie mit dem Immunfärbungsverfahren beginnen, überführen Sie eine 20-Mikroliter-Aliquot der Zellkernprobe in ein Fax-Röhrchen. Geben Sie 980 Mikroliter Kernspeicherpuffer zum Aliquot hinzu und beschriften Sie das Röhrchen als Negativkontrolle. Geben Sie nun Anti-PCM1-Antikörper zur Zellkernprobe und zu den Negativkontrollröhrchen in einer Verdünnung von 1:500 hinzu.Anschließend beide Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Röhrchen mit Puffer zur Nuklei- Lagerung waschen, den Überstand verwerfen und die Nuklei-Pellets in einem weiteren Milliliter Puffer zur Nuklei-Lagerung resuspendieren.Fügen Sie dann das fluoreszierende sekundäre Antikörper gegen Tollwut in einer Verdünnung von 1 zu 100 zu den Zellproben hinzu und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Nach dem Waschen der Röhrchen mit Kernspeicherpuffer resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter Kernspeicherpuffer zur Durchflusszytometrie-Sortierung und -Analyse, nachdem die Kerne, Sammelröhrchen mit BSA und PBS beschichtet wurden, wie zu Beginn des Videos gezeigt. Filtern Sie die Probe und die negative Kontrolle jeweils durch einzelne 30-Mikron-Zellsiebe. Geben Sie kurz vor dem Beladen einen DNA-Farbstoff hinzu.Fügen Sie eine Verdünnung von 1 zu 500 zur Identifizierung der Zellkernpopulationen hinzu. Laden Sie die negative Kontrolle auf den Durchflusszytometer. Verwenden Sie die Parameter für Vorwärts- und Seitwärtsstreuung, um das erste Tor zur Definition der kardialen Kerne entsprechend dem hier gezeigten DOT-Plot zu setzen.Verwenden Sie anschließend die Parameter Vorwärtsstreuung und Pulsbreite der Vorwärtsstreuung, um ein zweites Tor um die Einzelkerne zu erstellen, ähnlich dem hier gezeigten DOT-Plot. Laden Sie nun die immunmarkierte Probe und setzen Sie das dritte Tor, um PCM1-positive Kardiomyozytenkerne von PCM1-negativen Nicht-Kardiomyozytenkernen zu unterscheiden. Nutzen Sie die nukleare DNA-Färbung, um den DNA-Gehalt zu analysieren und eine Zellzyklusanalyse durchzuführen, vergleichbar mit der durch dieses Histogramm veranschaulichten Analyse.Nach der Sortierung der Kerne basierend auf ihrer PCM1-Positivität die sortierten Kerne auf Eis stellen und ein Aliquot jedes sortierten Probenmaterials erneut analysieren, um die Reinheit der Sortierung zu bestimmen. Abschließend die sortierten Kerne in ihren Sammelröhrchen 15 Minuten bei 1500 × g und 4 °C abzentrifugieren. Nach dem Verwerfen der Überstände die Kernpellets in einem Puffer resuspendieren, der mit der gewünschten downstream-Anwendung kompatibel ist.In dieser ersten Abbildung wurde ein erwachsenes Mausherz mit einem Kernfarbstoff sowie Antikörpern gegen PCM1, den Herzmuskelnukleus-Transkriptionsfaktor NKX2.5 und schwere Myosinkette (MHC) gefärbt. Hier ist eine Vergrößerung der Überlagerung aus der vorherigen Abbildung dargestellt. Beachten Sie, wie die durch PCM1 markierten Kerne in Weiß den Transkriptionsfaktor NKX2.5 in Rot exprimieren und von grün gefärbtem Kardiomyozytenzytoplasma umgeben sind.Diese Daten zeigen gemeinsam die Genauigkeit, mit der die PCM-eins-Färbung Kerne von Kardiomyozyten identifiziert. Der Ausschnitt verdeutlicht das epinukleäre Färbungsmuster von PCM eins in Myozytenkernen, wie weiter durch die Pfeile in dem Experiment dargestellt, das in den nächsten drei Abbildungen gezeigt wird. In diesen wurden isolierte Herzkernpräparate mit dem DNA-Farbstoff DRAC fünf sowie mit Antikörpern gegen PCM eins gefärbt. Hier zeigt die Überlagerung der beiden vorherigen Abbildungen erneut das epinukleäre Färbungsmuster von PCM eins in den isolierten Kardiomyozytenkernen, wobei die Pfeile dieses Muster erneut hervorheben.Dieses Punktdiagramm zeigt, dass ungefähr 30 % der mit dieser Methode isolierten Kerne Kardiomyozytenkerne sind, wie durch ihre PCM-1-Markierung angegeben. Schließlich, wie diese Histogramme veranschaulichen, sind Maus-Kardiomyozytenkerne hauptsächlich diploid, was durch den 2N-Peak angezeigt wird, während nur eine kleine Teilmenge tetraploid ist, was durch den kleineren 4N-Peak angezeigt wird. Einer der Vorteile dieser Technik ist, dass sie leicht auf andere Arten angepasst werden kann.Wie beim Menschen.

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Forschung

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