Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Kerne von Kardiomyozyten aus postmortalen Geweben zu isolieren. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst mit einem Stabhomogenisator und einem Glasstößel homogenisiert und anschließend mehrfach filtriert wird. Der zweite Schritt besteht darin, den nukleären Anteil durch Dichtegradientenzentrifugation von den anderen zellulären Fraktionen zu trennen.

Anschließend werden die Kerne der Kardiomyozyten mit einem gegen PCM1 gerichteten Antikörper immunmarkiert. Der letzte Schritt besteht darin, die markierten Kerne der Kardiomyozyten mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren. Unmittelbar vor weiteren downstream-Manipulationen wird schließlich die Reinheit der Kardiomyozytenkerne durch erneute Analyse der sortierten nukleären Fraktionen bestätigt.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Kerne von Kardiomyozyten aus frischem oder eingefrorenem Archivgewebe hochdurchsatzfähig gleich gut analysiert werden können. DNA-basierte Untersuchungen an Kardiomyozyten sind aus mehreren Gründen besonders anspruchsvoll. Erstens machen Kardiomyozyten im Herzen nur etwa 20–30 % der Zellen aus.

Außerdem sind sie in erheblichem Maße nukleiert. Darüber hinaus sind Kardiomyozyten in erheblichem Maße polyploid. Diese hier beschriebene Methode überwindet all diese Hürden.

Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, beschichten Sie Ultrazentrifugenröhrchen mit 10 Milliliter einer 1 %igen BSA-haltigen PBS-Beschichtungslösung. Nach einer 30-minütigen Rotationsphase entfernen Sie die Beschichtungslösung und lassen die Röhrchen lufttrocknen.

Beginnen Sie das Verfahren zur Isolierung von Herzkernen damit, mit einem Skalpell den linken Ventrikel aus einem schockgefrorenen Mäuseherzen zu dissezieren. Schneiden Sie das präparierte Gewebe in kleine Segmente und überführen Sie die Gewebestücke anschließend in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das mit 15 Millilitern Lysepuffer gefüllt ist. Homogenisieren Sie das Herzgewebe danach mit einem Stabhomogenisator bei 24.000 U/min für 10 Sekunden und verdünnen Sie das Homogenat mit einem gleichen Volumen Lysepuffer auf insgesamt 30 Milliliter. Überführen Sie das Homogenat in einen Glas-Down-Homogenisator und führen Sie acht Hubbewegungen mit einem Stößel mit großem Spaltmaß durch, um die Kerne freizusetzen.

Dann filtrieren Sie die rohen Zellkerne zuerst durch einen Zellfilter mit 100 Mikrometer, anschließend durch einen Zellfilter mit 70 Mikrometer in ein frisches kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie nun das isolierte rohe Zellkernpräparat 10 Minuten bei 700 ×g und 4 °C.

Drehen Sie das Röhrchen um, um das Überstand vorsichtig zu entfernen, und wischen Sie die Innenseite des Röhrchens mit einem Papiertuch ab, wobei Sie darauf achten, das Nuclei-Pellet nicht aufzuwirbeln. Pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, um die rohen Kerne erneut in Suspension zu bringen.

Isolieren Sie in fünf Millilitern Saccharose-Puffer und geben Sie anschließend weitere 25 Milliliter Saccharose-Puffer zur Kernsuspension hinzu. Fügen Sie danach 10 Milliliter frisch zubereiteten Saccharose-Puffer in eines der zuvor vorbereiteten beschichteten Ultrazentrifugenröhrchen hinzu. Überlagern Sie den Puffer dann vorsichtig mit der resuspendierten Kernpräzipitatlösung.

Nach dem Ausgleichen der Röhrchen in einem frei schwingenden Rotor wird der Rotor in eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge eingesetzt und die Kernprobe 60 Minuten bei 13.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Sobald die Zentrifugation beendet ist, die Röhrchen vorsichtig aus dem Rotor nehmen und erneut invertieren. Um den Überstand zu entfernen, den verbleibenden Rückstand an der Innenwand des Röhrchens wie zuvor mit einem Papierhandtuch abwischen und dann das Kernpellet in einem Milliliter Kernspeicherpuffer resuspendieren.

Bevor Sie mit dem Immunfärbungsverfahren beginnen, überführen Sie eine 20-Mikroliter-Aliquot der Zellkernprobe in ein Fax-Röhrchen. Geben Sie 980 Mikroliter Kernspeicherpuffer zum Aliquot hinzu und beschriften Sie das Röhrchen als Negativkontrolle. Geben Sie nun Anti-PCM1-Antikörper zur Zellkernprobe und zu den Negativkontrollröhrchen in einer Verdünnung von 1:500 hinzu.

Anschließend beide Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Röhrchen mit Puffer zur Nuklei- Lagerung waschen, den Überstand verwerfen und die Nuklei-Pellets in einem weiteren Milliliter Puffer zur Nuklei-Lagerung resuspendieren.

Fügen Sie dann das fluoreszierende sekundäre Antikörper gegen Tollwut in einer Verdünnung von 1 zu 100 zu den Zellproben hinzu und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Nach dem Waschen der Röhrchen mit Kernspeicherpuffer resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter Kernspeicherpuffer zur Durchflusszytometrie-Sortierung und -Analyse, nachdem die Kerne, Sammelröhrchen mit BSA und PBS beschichtet wurden, wie zu Beginn des Videos gezeigt. Filtern Sie die Probe und die negative Kontrolle jeweils durch einzelne 30-Mikron-Zellsiebe. Geben Sie kurz vor dem Beladen einen DNA-Farbstoff hinzu.

Fügen Sie eine Verdünnung von 1 zu 500 zur Identifizierung der Zellkernpopulationen hinzu. Laden Sie die negative Kontrolle auf den Durchflusszytometer. Verwenden Sie die Parameter für Vorwärts- und Seitwärtsstreuung, um das erste Tor zur Definition der kardialen Kerne entsprechend dem hier gezeigten DOT-Plot zu setzen.

Verwenden Sie anschließend die Parameter Vorwärtsstreuung und Pulsbreite der Vorwärtsstreuung, um ein zweites Tor um die Einzelkerne zu erstellen, ähnlich dem hier gezeigten DOT-Plot. Laden Sie nun die immunmarkierte Probe und setzen Sie das dritte Tor, um PCM1-positive Kardiomyozytenkerne von PCM1-negativen Nicht-Kardiomyozytenkernen zu unterscheiden. Nutzen Sie die nukleare DNA-Färbung, um den DNA-Gehalt zu analysieren und eine Zellzyklusanalyse durchzuführen, vergleichbar mit der durch dieses Histogramm veranschaulichten Analyse.

Nach der Sortierung der Kerne basierend auf ihrer PCM1-Positivität die sortierten Kerne auf Eis stellen und ein Aliquot jedes sortierten Probenmaterials erneut analysieren, um die Reinheit der Sortierung zu bestimmen. Abschließend die sortierten Kerne in ihren Sammelröhrchen 15 Minuten bei 1500 × g und 4 °C abzentrifugieren. Nach dem Verwerfen der Überstände die Kernpellets in einem Puffer resuspendieren, der mit der gewünschten downstream-Anwendung kompatibel ist.

In dieser ersten Abbildung wurde ein erwachsenes Mausherz mit einem Kernfarbstoff sowie Antikörpern gegen PCM1, den Herzmuskelnukleus-Transkriptionsfaktor NKX2.5 und schwere Myosinkette (MHC) gefärbt. Hier ist eine Vergrößerung der Überlagerung aus der vorherigen Abbildung dargestellt. Beachten Sie, wie die durch PCM1 markierten Kerne in Weiß den Transkriptionsfaktor NKX2.5 in Rot exprimieren und von grün gefärbtem Kardiomyozytenzytoplasma umgeben sind.

Diese Daten zeigen gemeinsam die Genauigkeit, mit der die PCM-eins-Färbung Kerne von Kardiomyozyten identifiziert. Der Ausschnitt verdeutlicht das epinukleäre Färbungsmuster von PCM eins in Myozytenkernen, wie weiter durch die Pfeile in dem Experiment dargestellt, das in den nächsten drei Abbildungen gezeigt wird. In diesen wurden isolierte Herzkernpräparate mit dem DNA-Farbstoff DRAC fünf sowie mit Antikörpern gegen PCM eins gefärbt. Hier zeigt die Überlagerung der beiden vorherigen Abbildungen erneut das epinukleäre Färbungsmuster von PCM eins in den isolierten Kardiomyozytenkernen, wobei die Pfeile dieses Muster erneut hervorheben.

Dieses Punktdiagramm zeigt, dass ungefähr 30 % der mit dieser Methode isolierten Kerne Kardiomyozytenkerne sind, wie durch ihre PCM-1-Markierung angegeben. Schließlich, wie diese Histogramme veranschaulichen, sind Maus-Kardiomyozytenkerne hauptsächlich diploid, was durch den 2N-Peak angezeigt wird, während nur eine kleine Teilmenge tetraploid ist, was durch den kleineren 4N-Peak angezeigt wird. Einer der Vorteile dieser Technik ist, dass sie leicht auf andere Arten angepasst werden kann.

Wie beim Menschen.