Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, stimulusinduzierte Kalziumreaktionen sowohl in GFP-markierten Neuronen als auch zeitlich in Hirnschnitten unter Verwendung eines nicht-grün fluoreszierenden Kalziumindikatorfarbstoffs zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn einer transgenen Maus extrahiert wird, die GFP in bestimmten Zellen exprimiert. Der zweite Schritt besteht darin, Gewebeschnitte mit einem Mikrotom vorzubereiten.

Als nächstes wird die Kalziumindikator-Farbstoffladelösung auf die Scheiben pipettiert, damit der Farbstoff von den Gehirnzellen aufgenommen werden kann. Der letzte Schritt besteht darin, eine Zeitstempelaufzeichnung von fluoreszierenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie durchzuführen. Letztendlich werden die Kalziumreaktionen in GFP-markierten Neuronen mit Hilfe einer mehrfarbigen Kalzium-Bildgebungsanalyse gezeigt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass wir Kalzium in grün fluoreszierenden GFP-Tech-Neuronen mit einem rotverschobenen fluoreszierenden Kalziumindikator abbilden können. Die enorme Verschiebung des Strichs durch das geringere Rot ermöglicht es uns, die rote Fluoreszenz in Kombination mit dem grünen GFP mit einer einzigen Anregungswellenlänge mehrfarbig zu analysieren. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir mit dem Problem konfrontiert waren, Kalziumsignale in Neuronen zu überwachen, die wir nur mit einer genetischen Fluoreszenztechnologie, dem grünen Fluoreszenzprotein, identifizieren konnten.

Ich werde nun einige kritische Schritte dieses Verfahrens aufzeigen. Beginnen Sie den Vorgang, indem Sie die erhitzte Agarlösung in eine quadratische Petrischale bis zu einer Höhe von einem Zentimeter gießen. Nach dem Abkühlen und Aushärten wird das 4%ige Agar-Gel in Blöcke von einem Kubikzentimeter geschnitten und zur Aufbewahrung in eine Flasche gegeben. Nach der Enthauptung der Maus schnitt man die Kopfhaut mit einer einschneidigen Rasierklinge in zentraler sagittaler Richtung vom Stirnbein bis zur äußeren Hinterhauptsprotuberanz.

Anschließend öffnen Sie die Schnittkopfhaut zunächst in rostraler Querrichtung weiter. Dann in ventraler Richtung. Machen Sie dann zwei seitliche und einen rostralen Schnitt

Im Foramen magnum mit einer kleinen Federschere vorsichtig den Schädel abspalten. In diesem Moment sollten die hinterhauptsächlichen inter parietalen und parietalen Knochen abgelöst werden. Wenn die Dura-Materie noch vorhanden ist, entfernen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette, um Schäden am Gehirn zu vermeiden.

Als nächstes entfernen Sie das Plattenbein, das vordere Siebbeinknochen und das Foramen frontalis. Nun kann das Gehirn einfach mit einem umgedrehten Mikrolöffelspatel entnommen und die Hirnnerven durchtrennt werden. Das Gehirn sollte auf seiner ventralen Seite auf einer schnittfesten Oberfläche mit der ventralen Oberfläche des Gehirns nach unten landen.

Verwende eine einschneidige Rasierklinge, um das Kleinhirn zu entfernen. Diese gerade Schnittfläche wird die Grundlage für die Montage des Gehirns auf einer Platte sein, um das Schneiden von koronalen Hirnschnitten zu ermöglichen. Als nächstes kleben Sie das Gehirn mit der Schnittfläche auf die Grundplatte des Mikrotoms mit einer kleinen Menge des schnell aushärtenden Hochleistungs-Cyanacrylat-Klebstoffs Sekundenkleber.

Kleben Sie anschließend einen ein Kubikzentimeter großen Agar-Gel-Block an der ventralen Seite des Gehirns auf die Grundplatte des Mikrotoms, um das Gehirn beim Schneiden zu stützen und zu fixieren. Nachdem die Bindung getrocknet ist, legen Sie die Platte in das Bad des Mikrotoms, das sechs Grad Celsius kalte, sauerstoffhaltige extrazelluläre Lösung enthält. Schneiden Sie dann das Gehirn in Scheiben von 300 Mikrometern Dicke mit geringer Schnittgeschwindigkeit, die koronalen Hirnschnitte werden gesammelt, bis das gesamte Gehirn geschnitten wurde.

Bereiten Sie nun ein 20%iges onic F1 27 in DMSO-Lösung vor, indem Sie onic F1 27 Pulver mit DMSO-Lösung zusetzen. Als nächstes lösen Sie es auf, indem Sie die Lösung zwei Minuten lang direkt mit Schall beschallen. Geben Sie danach fünf Mikroliter 20%ige Lösung F1 27 in ein Röhrchen mit 50 Mikrogramm zelldurchlässigem Fell.

Mischen Sie die Lösung mit einer Pipette. Fügen Sie dann 45 Mikroliter extrazelluläre Lösung zu der Mischung hinzu und wirbeln Sie sie ein. Fügen Sie kurz weitere 325 Mikroliter extrazelluläre Lösung hinzu und beschallen Sie das Röhrchen für weitere drei Minuten.

Nach der Beschallung fügen Sie 1,156 Milliliter sauerstoffhaltige extrazelluläre Lösung hinzu, um die endgültige Calciumindikator-D-Ladelösung zu erhalten. Übertragen Sie die koronalen Hirnschnitte auf eine Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen, die mit sauerstoffreicher extrazellulärer Lösung gefüllt ist, bis zu sechs Scheiben pro Vertiefung. Aspirieren Sie dann die sauerstoffhaltige extrazelluläre Lösung aus den Kammern und achten Sie darauf, die Hirnschnitte nicht zu beschädigen.

Pipettieren Sie anschließend 750 Mikroliter der Ladelösung des Calciumindikators D direkt auf jeden. Nun, die Hirnschnitte sollten mit der Lösung bedeckt werden, die Rore Am enthält. Danach inkubieren Sie die Scheiben im Sauerstoff-Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator für 45 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Ersetzen Sie am Ende der Inkubation die DI-Ladelösung des Kalziumindikators durch frische sauerstoffhaltige extrazelluläre Lösung, um eine Überlastung der Zellen zu vermeiden. Um die stimulusinduzierten Veränderungen des Fluoreszenzsignals zu überwachen, wird eines der fure-rot geladenen Gehirnschnitte in eine Aufnahmekammer übertragen und wie gewünscht positioniert. Nachdem Sie die Kammer auf das konfokale Mikroskop montiert haben, perfundieren Sie die Scheibe 10 Minuten lang mit sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung, um überschüssigen extrazellulären Kalziumindikatorfarbstoff zu entfernen.

Nach dem Verlassen der Aufnahmekammer wird die PERFUSE Acht in einer Vakuumflasche aufgefangen. Betrachten Sie dann den Schnitt durch das Mikroskop bei geringer Vergrößerung. Notieren Sie sich die Ausrichtung der Scheibe und finden Sie den interessierenden Bereich in der Schnitte, in unserem Fall den hypothalamischen Bereich im Gehirn.

Wechseln Sie anschließend zu einer hohen Vergrößerung. Finden Sie die interessierende Zelle in der Schnitte, indem Sie GFP-Bilder sammeln und gleichzeitig die Fluoreszenzintensität des roten URA-Signals überprüfen. Stellen Sie die Laserleistung auf einen Wert ein, der Messungen in der Änderung der URA-Rotfluoreszenzintensität ermöglicht und ein Ausbleichen der beiden Fluorophore verhindert.

Beginnen Sie als Nächstes mit der Aufnahme von Bildern mit Raten zwischen 0,5 und zwei Hertz, um die Fure- und GFP-Signale zu sammeln. Diese Abbildung zeigt das konfokale Bild der GN, RHR Tau GFP-Neuronen in einem koronalen Hirnschnitt. Dies ist das relativ gleichmäßige Fluoreszenzsignal, das nach dem Laden des Gehirnschnitts mit fure am beobachtet wurde, und dies ist das zusammengeführte Bild, das die Neuronen zeigt, die mit dem Kalziumindikatorfarbstoff beladen sind.

Hier sind Beispiele für die somatischen Stimulus-induzierten Kalziumreaktionen von einzelnen GFP-markierten Neuronen in verschiedenen hypothalamischen Hirnarealen. Die unterschiedlichen Kalziumsignale zwischen den GN-RHR-exprimierenden Neuronen verschiedener Hypothalamuskerne können verglichen werden, indem die Fläche unter der Kurve als Schätzung für die Gesamtveränderung des Kalziums in einer gegebenen Zelle während des gleichen Zeitraums verglichen wird. Diese Technik kann in weniger als 90 Minuten durchgeführt werden, einschließlich der Vorbereitung des Kalziumindikatorfarbstoffs, des Ladens und der Inkubation der Scheiben, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.