Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, stimulierte Kalziumantworten sowohl räumlich als auch zeitlich in Gehirnschnitten mithilfe eines nicht grün fluoreszierenden Kalziumindikatorfarbstoffs in GFP-markierten Neuronen zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn einer transgenen Maus, die GFP in bestimmten Zellen exprimiert, entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, Gewebeschnitte mit einem Mikrotom herzustellen.

Anschließend wird die Beladungslösung mit dem Kalziumindikatorfarbstoff mittels Pipette auf die Schnitte aufgebracht, damit der Farbstoff von den Gehirnzellen aufgenommen werden kann. Im letzten Schritt erfolgt eine zeitsynchronisierte Aufnahme fluoreszierender Zellen mittels konfokaler Mikroskopie. Letztendlich werden Kalziumantworten in mit GFP markierten Neuronen mittels multicolor Kalzium-Bildgebungsanalyse dargestellt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass wir Kalzium in grün fluoreszierenden GFP-markierten Neuronen mithilfe eines rotverschobenen fluoreszenten Kalziumindikators einfärben können. Die große Stokes-Verschiebung des weiter ins Rote reichenden Farbstoffs ermöglicht es uns, eine Multifarb-Analyse der roten Fluoreszenz in Kombination mit dem grünen GFP unter Verwendung einer einzigen Anregewellenlänge durchzuführen. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir mit dem Problem konfrontiert wurden, Kalziumsignale in Neuronen zu überwachen, die wir nur anhand eines genetischen fluoreszierenden Markers identifizieren konnten, nämlich dem grünen Fluoreszenzprotein.

Ich werde nun verschiedene kritische Schritte dieses Verfahrens demonstrieren. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die erhitzte Agar-Lösung nach dem Abkühlen in eine quadratische Petrischale bis zu einer Höhe von einem Zentimeter gießen. Nach dem Erstarren wird das 4%ige Agar-Gel in Blöcke von einem Kubikzentimeter Größe geschnitten und zur Lagerung in eine Flasche gegeben. Nachdem die Maus enthirnt wurde, schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Einweg-Rasierklinge in zentraler sagittaler Richtung vom Stirnbein bis zum äußeren Hinterhauptsfortsatz.

Öffnen Sie anschließend den eingeschnittenen Kopfhautbereich zunächst in rostral-lateraler Richtung, dann in ventraler Richtung. Führen Sie danach zwei laterale und einen rostralen Schnitt durch.

Am Foramen magnum mit einer kleinen Feder-Schere vorsichtig den Schädel abtrennen. Zu diesem Zeitpunkt sollten das occipitale Interparietal- und die Parietalbeine gelöst werden. Falls die Dura mater noch vorhanden ist, vorsichtig mit einer Pinzette entfernen, um Schäden am Gehirn zu vermeiden.

Entfernen Sie anschließend das Squamale, das vordere ethmoidale Foramen und das frontale Foramen. Nun kann das Gehirn mithilfe einer umgekehrten mikroskopischen Löffelspatel leicht entfernt werden, und die Hirnnerven können durchtrennt werden. Das Gehirn sollte mit seiner ventralen Seite nach unten auf einer schnittfesten Oberfläche landen, wobei die ventrale Gehirnfläche nach unten zeigt.

Entfernen Sie das Kleinhirn mit einer Einweg-Rasierklinge. Diese gerade Schnittfläche dient als Grundlage, um das Gehirn zur Erstellung koronaler Gehirnschnitte auf einer Platte zu befestigen. Anschließend wird das Gehirn mit der Schnittfläche nach unten mithilfe einer geringen Menge schnelltrocknender, hochleistungsfähiger Cyanoacrylat-Klebstoff auf die Basisplatte des Mikrotoms geklebt.

Kleben Sie anschließend einen Agarosegelblock von einem Kubikzentimeter an der ventralen Seite des Gehirns auf die Grundplatte des Mikrotoms, um das Gehirn während des Schneidens zu stützen und zu fixieren. Nachdem die Verbindung getrocknet ist, stellen Sie die Platte in das Bad des Mikrotoms, das eine mit Sauerstoff angereicherte extrazelluläre Lösung mit einer Temperatur von sechs Grad Celsius enthält. Anschließend schneiden Sie das Gehirn bei geringer Schneidgeschwindigkeit in Schnitte mit einer Dicke von 300 Mikrometern; die koronalen Gehirnschnitte werden solange gesammelt, bis das gesamte Gehirn sectioniert ist.

Bereiten Sie nun eine 20%ige F1 27 in DMSO-Lösung vor, indem Sie DMSO-Lösung zu F1 27-Pulver hinzufügen. Lösen Sie es anschließend durch zweiminütiges Beschallen der Lösung direkt auf. Danach geben Sie fünf Mikroliter der 20%igen F1 27-Lösung zu einem Gefäß mit 50 Mikrogramm zellpermeablem furred am hinzu.

Lösen Sie die Lösung mit einer Pipette. Geben Sie anschließend 45 Mikroliter extrazelluläre Lösung zur Mischung hinzu und wirbeln Sie sie. Geben Sie kurz darauf zusätzlich 325 Mikroliter extrazelluläre Lösung hinzu und beschallen Sie das Röhrchen weitere drei Minuten lang.

Nach der Sonikation 1,156 Milliliter oxygenierte extrazelluläre Lösung hinzufügen, um die endgültige Beladungslösung mit dem Calciumindikator D zu erhalten. Die koronalen Hirnschnitte in eine sechswellige Zellkulturplatte überführen, die mit oxygenierter extrazellulärer Lösung gefüllt ist, mit bis zu sechs Schnitten pro Vertiefung. Anschließend die oxygenierte extrazelluläre Lösung aus den Kammern absaugen, wobei darauf geachtet werden muss, die Hirnschnitte nicht zu beschädigen.

Als Nächstes pipettieren Sie 750 Mikroliter der Calciumindikator-D-Lösung direkt in jedes Brunnenloch, sodass die Gehirnschnitte von der Lösung mit RoRE Am bedeckt sind. Anschließend inkubieren Sie die Schnitte 45 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Sauerstoff-Kohlendioxid-Zellkulturinkubator.

Am Ende der Inkubation ersetzen Sie die Beladungslösung mit dem Calciumindikator DI durch frische, mit Sauerstoff angereicherte extrazelluläre Lösung, um eine Überladung der Zellen zu verhindern. Um die durch den Reiz ausgelösten Änderungen des fluoreszierenden Signals zu überwachen, überführen Sie eine der mit Fure-Red beladenen Gehirnschnitte in eine Ableitungskammer und positionieren Sie sie nach Wunsch. Nachdem die Kammer am konfokalen Mikroskopaufbau befestigt wurde, spülen Sie den Schnitt 10 Minuten lang mit mit Sauerstoff angereicherter extrazellulärer Lösung durch, um überschüssige extrazelluläre Calciumindikatorfarbstoffe zu entfernen.

Nachdem die PERFUSE acht die Aufnahmekammer verlassen hat, wird sie in einer Vakuumflasche gesammelt. Anschließend betrachten Sie das Schnittpräparat unter dem Mikroskop bei niedriger Vergrößerung. Notieren Sie die Orientierung des Schnitts und suchen Sie den interessierenden Bereich im Präparat, in unserem Fall den hypothalamischen Bereich im Gehirn.

Anschließend auf hohe Vergrößerung umschalten. Suchen Sie die gewünschte Zelle im Schnitt, indem Sie GFP-Bilder aufnehmen und gleichzeitig die Fluoreszenzintensität des URA-Rot-Signals überprüfen. Passen Sie die Laserleistung auf einen Wert an, der Messungen der Änderung der URA-Rot-Fluoreszenzintensität ermöglicht und eine Auslöschung der beiden Fluorophore verhindert.

Als Nächstes beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern mit einer Frequenz zwischen 0,5 und zwei Hertz, um die Fure- und GFP-Signale zu erfassen. Diese Abbildung zeigt das konfokale Bild der GN-, RHR-Tau-GFP-Neurone in einer koronalen Gehirnschnittpräparation. Dies ist das relativ gleichmäßige Fluoreszenzsignal, das nach der Beladung des Gehirnschnitts mit Fure am beobachtet wird, und dies ist das überlagerte Bild, das die Neurone zeigt, die mit dem Kalziumindikatorfarbstoff beladen sind.

Hier sind Beispiele für kalziumabhängige Antworten einzelner GFP-markierter Neuronen in verschiedenen hypothalamischen Hirnarealen, die durch somatische Reize ausgelöst wurden. Die unterschiedlichen Kalziumsignale zwischen den GN-RHR-exprimierenden Neuronen verschiedener hypothalamischer Kerne können mithilfe der Fläche unter der Kurve verglichen werden, die als Schätzwert für die gesamte Kalziumänderung in einem bestimmten Neuron während desselben Zeitraums dient. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie in weniger als 90 Minuten durchgeführt werden, einschließlich der Vorbereitung des Kalziumindikatorfarbstoffs, des Beladens und der Inkubation der Schnitte, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.