Zellspezifische Analyse Arabidopsis Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Population von zelltypspezifischen Protoplasten aus einem Blatt zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Pflanzen gezüchtet werden, die GFP in bestimmten Zelltypen im Blatt exprimieren. Der zweite Schritt besteht darin, Blätter zu ernten und Protoplasten durch einen enzymatischen Verdau zu erzeugen.

Anschließend werden die Protoplasten filtriert und mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder Facts sortiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Genauigkeit der Sortierung mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu bestätigen. Letztendlich können die sortierten Protoplasten für die Analyse der zelltypspezifischen Genexpression, die Proteomanalyse oder das metabolische Profiling verwendet werden.

Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung wurde bisher erfolgreich für Wurzeln eingesetzt, wird aber auch zur Isolierung von Blattzellen eingesetzt. Die Markierung mit GFP vor dieser Methode war aufgrund der Interferenz durch Chlorophyllfluoreszenz begrenzt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine schnelle, aber sorgfältige Probenvorbereitung entscheidend ist, um die umfangreichen physiologischen Veränderungen, die während der Zellsortierung auftreten können, zu minimieren.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie nicht wissen, wie sie den Zellsortierer einrichten oder wie sie die genaue Sortierung bestätigen können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pflanzensystembiologie zu beantworten. Das Problem bei der Identifizierung von Genregulationsnetzwerken in einem komplexen mehrzelligen Organ wie einem Blatt besteht darin, dass verschiedene Zelltypen unterschiedliche Gruppen von Genen exprimieren.

Diese genetische Information geht bei der Ernteanalyse eines ganzen Blattes verloren, wodurch das Verfahren demonstriert wird. An meiner Seite werden Ellison As und Sanjeev Kuma sein, die diese Arbeit in unserem Labor technisch unterstützen. Füllen Sie zunächst eine neun Zentimeter lange runde Petrischale mit 20 Millilitern Lösung A, die Proto-Plattierungsenzyme sowie Transkriptions- und RNA-Inhibitoren enthält.

Ernten Sie dann das gewünschte Blattmaterial für Proben, die mehr als ein einzelnes Blatt enthalten, wie die hier gezeigte Probe. Ordnen Sie die Blätter in einem Stapel von bis zu 15 Blättern an. Schneide dann mit einer Rasierklinge die Blätter in einen Millimeter breite Streifen.

Übertragen Sie die Blattstreifen sofort mit einer flachen Pinzette in die Petrischale, trennen Sie die Streifen vorsichtig und infiltrieren Sie die Proben dann zweimal für jeweils fünf Minuten im Vakuum. Stellen Sie dann die Petrischale auf einen Orbitalschüttler, der auf 90 U/min bei Raumtemperatur eingestellt ist, und stellen Sie die Proto-Gipsproben drei bis vier Stunden lang auf. Während der Inkubation trennst du die Blattstreifen mit der Pinzette im Abstand von einer halben Stunde voneinander.

Nach dem Aufschluss filtrieren Sie die Protoplastenlösung vorsichtig durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Um die Blattstreifen zu entfernen, werden die Streifen zurückgehalten. Die Protoplasten werden durchsickern.

Spülen Sie nun mit vier Millilitern Lösung A die Blattstreifen vorsichtig ab und sammeln Sie die Wäsche in der 50-Milliliter-Tube. Übertragen Sie dann die Protoplastensuspension in Röhrchen mit rundem Boden und zentrifugieren Sie die Protoplasten fünf Minuten lang bei 300-facher G-Temperatur und Raumtemperatur. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, saugen Sie vorsichtig so viel wie möglich von der Rückenlage ab und waschen Sie dann die Protoplasten mit fünf Millilitern Lösung A unter den gleichen Zentrifugenbedingungen.

Nach dem Entfernen der Rückenlage wird die PROTOPLASTS mit einer abgeschnittenen P 1000-Spitze in einem geeigneten Volumen der Lösung A für die Sortierung unmittelbar vor der Sortierung resuspendiert. Verwenden Sie eine ungeschnittene P 1000-Spitze, um alle Klumpen in der Protoplasten-Lösung zu zerkleinern. Dissoziieren Sie die Zellen weiter, indem Sie die Protoplasten durch einen 50-Mikron-Füllfilter in ein Beschaffungsröhrchen filtrieren.

Verdünnen Sie dann die Zelllösung nach Bedarf, um ein Verstopfen der Küvettenzufuhrdüse zu vermeiden. Nach der Bestimmung der optimalen Bedingungen für die Zellbeschaffung ist das GFP-positive Proto plus mit einem 488-Nanometer-Argonnenlaser zu identifizieren, der die Ausgabe des 580 30 Bandpassfilters mit dem 530 40 Bandpassfilter kombiniert. Beachten Sie, dass die GFP-positiven Protoplasten in der hohen 530- und niedrigen 580-Population auftreten.

Mit den Nicht-GFP-Protoplasten in der niedrigen 530, niedrigen 580 Population, erscheinen die toten, sterbenden Protoplasten und Trümmer in der hohen 580 Population zur Visualisierung der sortierten Protoplasten durch Fluoreszenzmikroskopie, sortieren Sie die Protoplasten direkt in mindestens acht Volumina Lösung A nach dem Sortieren des Konzentrats, die Protoplasten können durch Zentrifugation Protoplasten in acht Volumina von Lösung A sortiert und zur Visualisierung auf einem Fluoreszenzmikroskop gesammelt werden, um die Anreicherung zu verifizieren. Dieses erste Bild zeigt ein Beispiel für eine Anreicherung der TP 382-Zelllinie, die GFP in den Schließzellen exprimiert. Beispiele für Ausbeuten, die mit dieser Methode sowohl vor als auch nach der Amplifikation erzielt wurden, sind in dieser Tabelle zusammengefasst.

Die erhaltenen Mengen zwischen 500 Pikogramm und 50 Nanogramm sind ausreichend für die Amplifikation durch das ovation PICO WTA-System und die anschließende Analyse mittels quantitativer PCR, Next Generation Sequencing oder Microarray. Die nächste Bilderserie zeigt verschiedene Protoplasten-Zelllinien, die nach der eben beschriebenen Methode isoliert und sortiert wurden. Diese ersten Protoplasten wurden von KC 2 74 abgeleitet, Blätter eines Querschnitts von KC 2 74.

Das Blatt zeigt, dass das GFP im Gefäßsystem exprimiert wird. Diese Protoplasten wurden aus KC 4 64 Blättern isoliert und ein Querschnitt eines KC 4 64 Blattes zeigt, dass die GFP-Expression in der A dal epidermis zu finden ist. Schließlich wurden diese Protoplasten aus TP 3 82 Blättern in TP 3 82 Blättern gewonnen.

Das GFP wird hier in den Schließzellen exprimiert. Typische Punktdiagramme für die Faxerfassung, die die Ausgabe von 5 80 30 Nanometern im Vergleich zu 5 30 40 Nanometern Bandpassfiltern veranschaulichen, werden gezeigt. Die abgebildeten Sortiertore sind diejenigen, die typischerweise während der Sortierung verwendet werden.

Dieser erste Stop-Plot von vierblättrigen Protoplasten aus Kohle, die in Abwesenheit von Inhibitoren verputzt wurden, zeigt eine einzige niedrige 530, niedrige 580 Population. Während dieses Punktdiagramm von vierblättrigen Protoplasten aus Wildtyp-Kohle, die in Gegenwart von Inhibitoren verputzt wurden, die Verschiebung der 580-Fluoreszenz zeigt, die aufgrund des durch die Inhibitoren verursachten Stresses und der Färbung auftritt. Diese Punktdiagramme sind von blattabgeleiteten Protoplasten aus den Linien KC 7 4, KC 4 64 und TP 3 82.

Diese Proben wurden auch in Gegenwart von Inhibitoren progappiert, was zeigte, dass das GFP in der hohen 530 und der niedrigen 580 Population enthalten war. Für diesen Vertreter wurden zunächst quantitative PCR-Experimentproben für jeden Fraktionstyp gewonnen. Die Proben wurden dann mit dem ovation PICO WTA-System und quantitativer PCR amplifiziert.

Es wurden GFP-spezifische Primer verwendet. Die dargestellten Werte sind die höchsten in Rot und die niedrigsten in Grün Durchschnitts- oder Einzelwerte, die Aktin zwei als Referenzgen verwenden, sind durch die horizontalen gelben Balken gekennzeichnet. Das Ergebnis ist eine erneute Verifizierung der optischen Auswertungen des GFP-Zellgehalts in den sortierten Fraktionen.

Die hohe 530 und die niedrige 580-Population wiesen die höchsten messbaren Niveaus der GFP-Expression auf. Während die hohe 530 High 580 Population eine etwa 1000-fach niedrigere GFP-Expression aufwies, wiesen die niedrigen 530, 580 und 530 High 580 Populationen eine niedrige GFP-Expression auf, die mit denen der Kontrollpopulationen für ganze Blätter und unsortierte Protoplasten vergleichbar war. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis fünf Stunden von der Pflanze bis zur sortierten Zellpopulation durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Zellsortierer ständig zu überwachen und ihn bei Bedarf neu zu kalibrieren, um die Sortiergenauigkeit zu erhalten.

Dieses Verfahren wurde gefunden. Andere Methoden, wie z. B. die Mikrostrahlenanalyse, können durchgeführt werden, um die Genexpressionsniveaus in verschiedenen Zelltypen zu vergleichen und gegenüberzustellen. Jetzt, da diese Technik entwickelt ist, analysieren wir die Genexpression in bestimmten Blattzelltypen in verschiedenen Entwicklungsstadien und vergleichen sie mit Daten aus dem gesamten Blatt, die im Rahmen des Agronomics-Projekts generiert wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Zelltypen von Blättern mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung isoliert